沙门氏菌PCR检测方法的建立及其在蔬菜检测中的应用

PCR在食品微生物测定实例-PCR快速检测沙门菌

食品微生物分子生物学测定PCR快速检测沙门菌沙门菌是一种常见的污染食品的致病菌，该菌的常规检测主要采用微生物培养法，需经过选择性增菌、分离培养、革兰氏染色镜检等步骤，以及一系列生化和血清学检测，整个过程一般需要4-7天。

PCR技术作为一种快速、准确检测生物样品中遗传物质的检测方法，为食品中沙门菌的快速检测提供了新的技术手段，本方法可以在12-24h之内即可得出可靠的结果。

实验原理：沙门菌染色体上含有其特有的侵袭基因InvA，可以以此基因设计一对引物，利用Taq酶在合适的条件下，以4种单核苷酸（dNTP）作为原料进行高效循环扩增，最终得到特异性的PCR扩增DNA产物，此产物可以通过琼脂糖凝胶检测进行确认。

实验材料：四硫酸盐胱氨酸增菌液鼠伤寒沙门菌标准参考株Taq DNA聚合酶dNTP10×PCR buffer琼脂糖溴化乙锭（EB）1×TAE电泳缓冲液（0.04M Tris-Cl、0.01M EDTA），溴酚蓝加样缓冲液DNA marker1.5 ml EP管0.2 ml PCR小管微量加样器和枪头PCR反应扩增仪琼脂糖凝胶电泳仪紫外自动成像系统实验步骤：1. 将待检测食品制作成匀浆液接种于四硫酸盐胱氨酸增菌液中培养6h，取100μl 培养物于100 °C加热预处理5min，制作成DNA粗提物用于检测。

2. PCR体系的构建：将PCR反应的6种组分加入到0.2ml的PCR小管中组分体积Taq酶1μldNTP 2μl10×PCR buffer 5μlPCR引物2μl待测样品5μlddH2O 35μl总体积50μl3. PCR反应：将添加好PCR组分的PCR小管以简易离心机进行离心，离心结束后，放入PCR仪中。

将PCR反应扩增仪设定程序：94°C预变性5min，PCR循环：94°C 变性30s，55°C 退火30s，72°C 延伸45s（循环35次），循环结束后，72°C 延伸7min。

沙门茵PCR检测方法的建立

速、灵敏、特异的检测沙门菌的方法十分必要。。
目前，沙门菌检测主要依靠生化反应和血清学鉴定这样的传统检测方法，检验周期较长，所
ｌ－２方法
１．２．１引物设计
摘要：本实验根据沙门菌的侵袭性抗原保守基因肠毒素（ＳＴＮ）基因上的靶序列设计一对引物，对沙门菌基因组ＤＮＡ进行ＰＣＲ扩增，建立了沙门菌的ＰｃＲ检测方法，与传统的细菌分离鉴定方法比较，该方法具有快速、特异、灵敏的特点，在沙门菌监测领域具有广阔的应用前景。关键词：聚合酶链式反应；沙门菌；检测
１２０００ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ，取上清，一２０℃备用。
１．２．４ＰＣＲ扩增反应以及条件的优化
分别对引物浓度和退火温度（设置４９、４９－３、
基金项目：吉林省食品安全地方标准制（修）订项目（ＤＢＳ２２／０４５．２０１２）作者简介：李佳桐（１９８４一），女，延边大学动物医学系，研究生，预
沙门菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）属肠杆菌科，其菌属型繁ＴａｑＤＮＡ聚合酶，ＤＬ２０００ＤＮＡＭａｒｋｅｒ。多，抗原复杂。自１８８５年由Ｓａｌｍｏｎ和Ｓｍｉｔｈ首１．１．３主要仪器次分离出猪霍乱沙门菌以来，已经从人和动物中

食品沙门氏菌实时荧光PCR快速检测方法建立

ＰＮＢｏｊＷＥｉｉｇ，ＮＧＷｅ－ｎＬｈｏ￣ｉＬＵｎ￣ＣＬ－ｉｏＡａ－ｎ，Ｉ－ａＷＡｎｌｇ，ＵＯＺａ－ＩＪ－，ｍｉＭｅｌｎｏ，ｕｉａｂ（．ｃｎｌｇｅｔＧａｇｉｎｒ－ｘｔｎｐｃｏｄＱａｎｉｅｕｅｕＧａｇｉｎｉｇ５０２，ｈａ１ｅｈｏｏｙｎｒｏｕｎｘｔＥｉＩｓｅｔｎａｕｒｔｒａ，ｕｎｘｎｎ０１Ｃｉ）ＴＣｅｆＥｙｉｎａｎＢＮａ３ｎ（．ｎｉｇｎｒ－ｘｔｓｅｔｎａｄＱａａｔｅｕｅｕＤｎｘｇ３６Ｃｉａ２ＤｏｇｎｔＥｉｐｃｏｕｒｎｉｒａ，ｏｇｉ５５，ｈ）ｘＥｙｎＩｉｎｎＢｎ５ｌｎ
速度。本研究根据Ｇｎａｋｅｂｎ提供的沙门氏菌保守基因序列设计引物和探针，建立了食品沙门氏菌实时荧光ＰＲＣ
食品安全问题是非常重要的公共卫生问题之一，
国内和进出口检验检疫，将大大提高食品检测和通关
其中对食源性疾病的监控是保证食品安全的关键所在，例如１９年美国由于冰淇淋污染的沙门氏菌病估９４
计使２１万人患病。沙门氏菌病是沙门氏细菌引起，２４主要症状为发烧、头疼、恶心、呕吐、腹痛及腹泻。
ｄｔｃｏｍｉｏＳｌｎｌｅｅｔｎｌｔｆａｍｏｅｌＤＮＡｗｅ４ｆ／．ｈｅｅｔｎｔｒｄｔｃｉｎｅｒｃｍｅｔｒｔｆａｍｏｅｌｆｏａｐｅｓｎｙｉｉａｅｒ２０ｃｕｍ１ＴｅｄｔｃｏｍｅｆｅｅｔｉｈｎｏｏＳｌｎｌｏｆｏｓｉｉｏｏｎｂｈａｄｍｌｓＷａｏｌａｏｔ．ｅａｏｅｒｓｌｄｍｏｍｔｔａｔｅｍｅｈｄｃｕｄｂｓｆｒａｉｉｇｏｉｏＳｌｎｌｎｆｏｍｐｅ．ｂｕ３ｈＴｈｂｖｕｔｅｍｔｅｈｔｅｓｄｈｔｏｏｌｅｕｅｏｐｄｄａｄｒｎｓｓｆａｍｏｅｌａｉｏｄｓａｌｓＫｅｒｓｆｏ；ａｍｏｅｌ；ｅｌｉＣｄｔｃｏｙｗｏｄ：ｏｄｓｌｎｌｒａ－ｍｅＰＲ；ｅｅｔｎａｔｉ

PCR技术在沙门氏菌检测中的应用

沙门氏菌检测方法都是建立在采取感染 DNA；e.DNA 序列分析[3]。
imals. Animal Welfare Information Center (AW－
病人的粪便或血液作为临床病料的基础上。食
2.2 PCR 技术检测沙门氏菌
IC). (301)344-3212.
品中分离沙门氏菌的方法实质上与用于临床病
测技术也应用到细菌分类检测上，很大提高了常要求引物位于待分析基因组中的高度保守区提供新的思路。
对细菌的检测速度，其中聚合酶链技术（PCR）域，长度为 15 至 30 个碱基为宜；c.进行 PCR 扩
参考文献
法，是具有比较准确的快速检定方法之一，现将增；d.克隆并筛选鉴定 PCR 产物，将扩增产物进 [1]Frank Axelsson,Marie -laure Sorin，Transia.
Hale Waihona Puke 有关检测技术加以论述。行电泳、染色，在紫外光照射下可见特异区段的 Salmonella technical handbook 1997,16～22.
1 沙门氏菌检测技术
DNA 带，根据该带的不同即可鉴定不同的 [2]Kevin Engler. Salmonellosis in laboratry an－
普通沙门氏菌检测方法是利用各种细菌循环，可将靶 DNA 序列扩增近百万倍。
染、如何控制突变和如何控制 PCR 技术鉴别致
的生化特性不同来鉴定，随着生物检测技术的
PCR 技术检测的主要步骤为：a. 应用化学毒微生物产生的毒素等方面的深入研究，必将
进步，以分子生物学及免疫学为基础的各种检手段对目标 DNA 提取；b. 设计并合成引物，通为 PCR 技术在食品检测领域更加广泛的应用

沙门氏菌菌检测方法

沙门氏菌菌检测方法沙门氏菌（Salmonella）是一类常见的食源性致病菌，可以引起人类各种疾病，如食物中毒、胃肠炎等。

因此，对食品中的沙门氏菌进行检测是非常重要的。

下面我将详细介绍几种常用的沙门氏菌检测方法。

1. 培养法培养法是最常用的沙门氏菌检测方法之一。

该方法需要将样品（如食品、水）在适当的培养基上进行培养，并观察是否有沙门氏菌的生长。

具体步骤如下：（1）将样品接种于含有选择性成分的培养基上；（2）将接种的培养基培养在适当的温度下，通常为37摄氏度；（3）观察培养基上是否有典型的沙门氏菌的形成，一般表现为黑色斑点；（4）进行进一步的确认试验，如生化试验和血清学试验。

2. PCR法PCR法是一种快速、准确且高度灵敏的沙门氏菌检测方法。

PCR法通过扩增样品中沙门氏菌的特定基因片段来检测其存在。

具体步骤如下：（1）提取样品中的DNA；（2）使用特定引物扩增沙门氏菌的基因片段；（3）通过电泳将扩增产物分离，并观察是否有目标片段的出现。

3. ELISA法ELISA法是一种常用的快速筛查大量样品的沙门氏菌检测方法。

该方法利用特异性抗体与沙门氏菌抗原结合，并通过酶催化反应来检测沙门氏菌的存在。

具体步骤如下：（1）将样品涂覆在固相酶标板上；（2）添加特异性抗体与沙门氏菌抗原结合；（3）洗涤去除非特异性结合的成分；（4）添加辣根过氧化物酶标记的二抗，并形成酶标复合物；（5）通过酶催化反应产生显色物质，观察是否有颜色的出现。

4. 质谱法质谱法是一种高分辨率、高灵敏度的沙门氏菌检测方法。

该方法通过检测样品中沙门氏菌的特定代谢产物来判断其存在与否。

具体步骤如下：（1）提取样品中的代谢产物；（2）使用质谱仪进行检测，并与数据库中的标准进行比对；（3）根据比对结果判断样品中是否有沙门氏菌的存在。

除了上述常用的沙门氏菌检测方法外，还有一些新兴的检测技术，如纳米技术、免疫传感器等。

这些方法具有高灵敏度、高特异性和快速的特点，可以用于食品、环境等多种领域的沙门氏菌检测。

沙门菌病聚合酶链式反应(PCR)检测方法

沙门菌病聚合酶链式反应(PCR)检测方法聚合酶链式反应(PCR) PCR技术因具有简便、快速、敏感性高和特异性强的优点，现已广泛应用于微生物检测、遗传病诊断等诸多领域。

引物设计是利用：PCR检测沙门菌成功与否的关键，用来设计PCR引物的基因主要分3类，即属特异性引物基因、血清群特异性引物基因与血清型特异性引物基因。

属特异性引物基因。

①hut基因——编码组氨酸转运操纵子。

黄金林等根据其基因序列设计引物，建立了检测沙门菌的PCR方法，对沙门菌A～F各群种15株沙门菌、27株沙门菌现场分离株和其他10株非沙门菌菌株进行了扩增，结果沙门菌均显示出500bp大小的特异性条带，所有对照均不出现特异条带，显示了优良的属特异性。

②inv基因簇——编码吸附和侵袭上皮细胞表面蛋白。

ZnU基因簇与沙门菌对肠道上皮细胞的侵袭有关，包括invA、invB、invC、invD、invE等基因。

众多研究者均证实基于；inv基因簇设计的引物具属特异性，可用于鉴别沙门菌。

李业鹏等根据invA基因设计引物，优化了PCR检测条件，建立了检测沙门菌属的PCR检测方法，并进行了人工污染沙门菌的食品(生肉、鸡蛋、火腿肠等)中沙门菌PCR检测方法的应用性研究。

③hilA基因——编码侵袭基因正调节蛋白。

hilA是inv基因的正转录调节蛋白。

④fimA基因——编码1型菌毛主要的亚单元。

fimA基因编码沙门菌工型菌毛主要的亚单元，介导与上皮细胞表面的特异受体相结合。

H．J．Cohen等根据fimA 基因设计特异引物，检测出牛奶等食品中的沙门菌。

⑤hns基因——编码与蛋白质结合的DNA。

hns基因编码与蛋白质结合的DNA。

⑥spy基因——编码沙门菌毒性质粒相关的毒力因子。

spy基因编码与沙门菌毒性质粒相关的毒力因子，与沙门菌的致病性有关。

J．Mahon等根据鼠伤寒沙门菌spvR基因设计引物，特异性检测到具有该毒力相关基因的沙门菌，而不含质粒和质粒无该毒力相关基因的菌株则表现阴性。

荧光定量RT-PCR检测沙门氏菌方法的建立

ｔｅｆａｉｉｔａｄａｐｉａｏｆｖｌｅ．ｅｈｄＰｉｒａｄｐｏｅｗｅｅｄｓｎｄｂｓｄｏｍＹｇｎｅｕｎｅｏＳｍｏｅａｑａ — ｈｓｂｌｙｎｐｌｔｎｏａｕＭｔｏｓｅｉｃｉｒｍｅｎｒｂｒｅｉｅａｅｎｆｅｅｓｑｅｃａｎｌ，ｎｇｉｆｌｕ
ｔｎｓｅｉｎｔｕｔｒｔａｎｃｉｃｄｎｅｒｔｓ１０％．ｎｌｓｏｉｐｃｍｅｓｗｈｃｕｅｓｒｉｓ，ｏｎｉｅｃａｅｗａ０ｏｉｌＣｏｃｕｉｎＴｈｓａｌｓｍｅｔｏｅ —ｉｌｏｅｃｎａｔｔｔｅｅｅｔｂｉｈｎｆｒａｔｌｍｅｆｕｒｓｅｔｑｎｉａｉｕｖ
ｓｃｅｓｌ．ｔａｈｗｔａｉｍｅｈｄｈｓｇｏｐｃｆｉ，ｅｓｉｉ，ｔｂｌｙｂｅｖｒｉａｉｎｅｐｒｎ．ｏｃｍａｅｉｌａｕｃｓｆｌＩｗｓｓｏｔｈｓｔｏａｏｄｓｅｉｃｔｓｎｉｖｔｓｉｔｙｔｅｉｃｔｘｉｔＴｏｐｒｄｓｕｙｈｔｉｙｔｙａｉｈｆｏｅｍｅｍｕ —
ｙｎｅａ．１ＣｎｒｆＣｉｉｌａｏｔｙＭｄｉＩ，ｏｉ，ｏｒｉｔｒＭｅｉｎｅｉ，ｉａ１０２ｕ，ｔ１（．ｅｅｏｌｃｂｒｏｅｉｎｏＡ，ｌＨｓｔＦｕｔＭｌｙｄｃＵｉｒｔＸ ’ ｎ７０３，ｔｎａＬａｒｃｅｆＰｇｐａｌｈｉａｌａｖｓｙＣ／；，ａ－ｎｅｎｌｙＣＬｄ，／肌７０３，ｈｎ）ｈｎ２ＤｙｌｇＴｃｏｇｏ，ｔ．Ｘ ’ ａｏｈｏ１０２Ｃｉａ

3类食品中沙门氏菌PCR快速检测方法的建立

3类食品中沙门氏菌PCR快速检测方法的建立摘要建立了3类食品中沙门氏菌快速、敏感、特异的PCR快速检测方法。

选取invA基因作为靶序列设计1对引物,在沙门氏菌中能扩增出198 bp的预期片段,而大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、单核细胞增生李斯特氏菌的扩增结果均为阴性,表现出极好的沙门氏菌种特异性。

通过对沙门氏菌标准菌种纯培养液PCR方法灵敏性的检测,发现纯培养的检测极限为72个细菌。

用该方法对3类共计56份食品样品进行检测,检测结果与传统分离鉴定方法完全相符,表明该方法适用于食品中沙门氏菌的快速检测。

关键词食品;沙门氏菌;PCR快速检测方法;建立沙门氏菌(Salmonella)是肠杆菌科中重要的常见人畜共患病原菌。

该菌广泛分布于自然界,目前全世界已经发现2 523个血清型,我国发现的血清型近300个。

许多血清型的沙门氏菌都能产生毒素,以肠炎沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌和猪霍乱沙门氏菌最为常见[1]。

常见的肉类食品和奶蛋类食品都会被沙门氏菌污染,在世界各地的食物中毒中,沙门氏菌引起的中毒病例占首位或第2位[2-3]。

有资料显示,我国细菌性食物中毒中70%～80%是由沙门氏菌引起的[4]。

另外,每年出口的食品由于沙门氏菌污染而造成退货或索赔,以及食品加工厂由于沙门氏菌污染,经常导致重大的经济损失。

因此,对食品中致病菌的监测和检验也就越显示其重要性。

为有效地预防和控制疾病的发生,同时满足食品出口业日益发展的需要,建立快速、敏感而又特异的检测沙门氏菌的方法是非常必要的。

随着分子细菌学研究的开展,人们对细菌的毒素、侵袭素与毒力岛等毒力因子的认识不断深入,使细菌检测从表型特征鉴定逐渐向遗传特征的鉴定,而PCR技术是近年来发展起来的一种体外扩增特异性DNA片段的技术,具有简便、快速、敏感性高和特异性强的优点[5-7],因而从20世纪90年代以来开始尝试利用该技术来检测食品中以及临床样品和环境中的沙门氏菌。

PCR检测方法的特异性与灵敏度主要取决于相应检测靶点的选择,本研究选取invA基因作为靶序列设计1对引物,成功地建立了沙门氏菌的PCR快速检测方法。