倒置荧光显微镜法检测结核分枝杆菌_王印林

表 １ 罗 氏 法 和 荧 光 法 分 离 培 养 阳 性 率 、污 染 率 比 较
培养方法 涂片结果 样本例数 阳性（例） 阳性率（％） 污染（例） 污染率（％）
罗氏法 ≤２＋ ６８
５３Байду номын сангаас ７７．９０ １
１
≥３＋ ３２
３０ ９３．７５
荧光法 ≤２＋ ６８
５４ ７９．４０ ０
０
≥３＋ ３２
《临床荟萃》 ２０１５年 ４月５日 第３０卷 第４期 Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｆｏｃｕｓ，Ａｐｒｉｌ ５，２０１５，Ｖｏｌ ３０，Ｎｏ．４
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性 。 ［１３］ 本研 究 发 现 ＡＰＡＣＨＥⅡ 评 分 与 ＰＣＴ、ＣＲＰ 动态 变 化 均 为 正 相 关，两 组 患 者 ＰＣＴ、ＣＲＰ 呈 正 相 关。提示 ＰＣＴ、ＣＲＰ 可 作 为 病 情 评 估 及 预 后 评 价 的 监测指标之一，且两 者 之 间 具 有 高 度 相 关 性，联 合 监 测对提高病 情 评 估、预 后 评 价 的 敏 感 性 和 特 异 性 具 有重要意义。
２９ ９０．６０
注：≤２＋，χ２＝０．０４３８；≥３＋，χ２＝０．２１６９，均 Ｐ ＞０．０５
２．２ 荧光法 和 罗 氏 法 分 离 培 养 符 合 率 比 较 以 罗 氏法为判断 标 准，荧 光 法 分 枝 杆 菌 分 离 培 养 的 敏 感 度 为９６．４％ 、特 异 度 为８４．４％ 。 结 果 见 表 ２。 ２．３ 荧光法 和 罗 氏 法 分 离 培 养 时 间 比 较 荧 光 法 分离培养为阳性的 时 间 中 位 数 为 １０ 天，９５％ 报 告 时 间为２０．５天；罗 氏 法 分 离 培 法 的 阳 性 的 时 间 中 位 数
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收 稿 日 期 ：２０１４－０６－１６ 编 辑 ：武 峪 峰
倒置荧光显微镜法检测结核分枝杆菌
王 印 林 ，张 厚 亮 ，张 明 生 ，张 俊 慧 ，刘 春 莉
（天津医科大学静海县医院 呼吸内科，天津 ３０１６００）
关 键 词 ：结 核 分 枝 杆 菌 ；培 养 技 术 ；显 微 镜 中 图 分 类 号 ：Ｒ４４６．１１ 文 献 标 识 码 ：Ｂ 文 章 编 号 ：１００４－５８３Ｘ（２０１５）０４－０４３１－０３ ｄｏｉ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１００４－５８３Ｘ．２０１５．０４．０２０
基 金 项 目 ：２００９ 年 天 津 市 卫 生 局 科 研 基 金 资 助 项 目 （０９ＫＺ０３） 通 信 作 者 ：张 厚 亮 ，Ｅｍａｉｌ：ｚｈａｎｇｈｏｕｌｉａｎｇ３６＠１６３．ｃｏｍ
天津医科大学静海县医院住院的结核分枝杆菌痰涂 片镜检阳性患 者 痰 液 标 本 １００ 份，其中 ６８ 例痰涂片 结 果 ≤ ＋ ＋ ，３２ 例 痰 涂 片 结 果 ≥ ＋ ＋ ＋ （菌 落 数 ２００～ ４００个为＋，４００～６００ 为 ＋＋，≥６００ 个 为 ＋＋＋ ）。 Ｈ３７ＲＶ 标准株，由北京市 结 核 病 胸 部 肿 瘤 研 究 所 药 物研究室提供。 １．２ 主 要 仪 器 和 试 剂 倒 置 荧 光 显 微 镜，日 本 Ｏｌｙｍｐｕｓ ３７ ℃培养箱，湖 北 省 黄 石 市 恒 丰 医 疗 器 械 有限公司 ＳＫＰ－０２Ｂ７Ｈ９液 体 培 养 基 （含 １０％ 营 养 添 加 剂 ），Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ。 １．３ 方法 参照结核病诊断实验室检验规程 。 ［２］ １．３．１ 前处理 取 痰 液 标 本 ５ ｍｌ置 于 ５０ ｍｌ无 菌 离心管中，加 入 痰 液 消 化 液 ５ ｍｌ，蜗 旋 震 荡 １５～２０ 秒，待消化完全后 混 匀 放 置 １５ 分 钟。 加 入 磷 酸 盐 缓 冲溶液 （ＰＢＳ）（ｐＨ ６．６７，１／１５ ｍｏｌ／Ｌ）３５ ｍｌ，摇 匀 ５ ５００ｒ／ｍｉｎ离心１５ 分 钟［３］，弃 上 清 液，沉 淀 加 入 选 择 性 ７Ｈ９ 培 养 基 ３ ｍｌ，混 匀 静 置 ，用 两 种 方 法 检 测 。 １．３．２ 倒置 荧 光 显 微 镜 法 培 养 板 中 预 留 一 个 培 养基对照孔，加入 ７Ｈ９ 培养基 １ ｍｌ；其他为培 养 孔，
结核病是世界范围内危及人类健康的呼吸内科 疾病，其发病率、病死 率 高 给 社 会 和 家 庭 造 成 了 巨 大 的负担。既 往 经 典 的 结 核 菌 检 测 方 法 敏 感 度 低，耗 时长，花费较贵，已 不 能 满 足 临 床 诊 治 的 需 求 。 ［１］ 快 速、灵敏的结 核 病 实 验 室 诊 断 新 技 术 的 研 究 迫 在 眉 睫。本研究依据结核分枝杆菌在液体培养基中生长 分泌索状因子，呈现 索 状 特 征 型 结 构 这 一 特 点，利 用 倒置荧光显 微 镜 进 行 观 察，以 明 确 该 方 法 在 结 核 病 诊断中的价值。 １ 资 料 与 方 法 １．１ 标 本 来 源 选 取 ２００９ 年 ７ 月 至 ２０１１ 年 ７ 月 于
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《临床荟萃》 ２０１５年 ４月５日 第３０卷 第４期 Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｆｏｃｕｓ，Ａｐｒｉｌ ５，２０１５，Ｖｏｌ ３０，Ｎｏ．４
加入 ７Ｈ９ 培 养 基０．９ ｍｌ。 吸 取 去 污 处 理 的 痰 标 本 ０．１ｍｌ（吸 取 标 本 中 上 部，以 减 少 杂 质 对 观 察 的 影 响），分别接种于培养孔中。 接种完成后，用 ２～３ 层 聚乙烯带密封，并和 湿 纱 布 一 起 装 入 自 封 塑 料 袋 中， 以增加袋内湿度，防 止 因 培 养 基 过 度 蒸 发，对 实 验 产 生影响，３７ ℃ 培 养。 于 接 种 后 第 ５ 天 开 始 观 察，第 ５～１５天期间每天、第 １６～２５ 天 隔 天、第 ２６～４０ 天 每周两次使用倒置荧光显微镜观察培养孔中是否有 特征性菌丝形成。 １．３．３ 改良罗氏 培 养 法 取 处 理 后 的 标 本０．１ ｍｌ， 分别接种 于 罗 氏 培 养 基 上，每 份 标 本 接 种 两 支。３７ ℃温 箱 培 养，每 周 观 察 两 次，至 ８ 周 止，记 录 细 菌 生 长和污染情况。 １．３．４ 结果 判 定 倒 置 荧 光 显 微 镜 法 在 培 养 孔 中 观测到结核分枝杆菌生长特有形态学结构则判定培 养阳性。改良罗氏培养法在接种７天内有菌落生长 者，即可报告快速 生 长 分 枝 杆 菌；菌 落 数 ≥５ 个 则 报 告为阳性，＜５ 个 直 接 记 录 菌 落 数；８ 周 后 仍 未 见 到 菌落生长即可报告为阴性。 １．４ 统计学方法 采用 ＳＰＳＳ １３．０软件进行数据分 析。两种方法时间 的 比 较 采 用 Ｗｉｌｃｏｘｏｎ 秩 和 检 验； 阳性检出率使 用 配 对 卡 方 检 验。Ｐ ＜０．０５为 差 异 有 统计学意义。 ２ 结 果 ２．１ 荧光法和罗氏法分离培养阳性率、污染率比较 本研究用倒置荧光显微镜法和改良罗氏法分别培 养１００ 例 临 床 标 本，其 中 倒 置 荧 光 显 微 镜 法 分 离 培 养 阳 性 者 为 ８３ 例 ，培 养 阴 性 者 为 １７ 例 ，污 染 ０ 例 ，培 养阳性率为８３％，污 染 率 为 ０％；罗 氏 法 分 离 培 养 阳 性 者 为 ８３ 例 ，培 养 阴 性 者 为 １６ 例 ，污 染 １ 例 ，分 离 培 养阳性率为８３％，污 染 率 为 １％，两 者 分 离 培 养 阳 性 率 、污 染 率 差 异 均 无 统 计 学 意 义 。 结 果 见 表 １。
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