免疫抑制剂对糖尿病小鼠胰岛细胞移植长期存活效果的研究

中国现代医药杂志 ２００６ 年 ８ 月第 ８ 卷第 ８ 期 ＭＭＪＣ， Ａｕｇ ２００６， Ｖｏｌ ８， Ｎｏ．８
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·论 著·
免疫抑制剂对糖尿病小鼠胰岛细胞移植 长期存活效果的研究
袁超 于立新 杜传福 刘小友
【摘要】 目的 观察胰岛细胞移植后应用免疫抑制剂对胰岛组织长期存活的影响。方法 对 Ｗｉｓｔａｒ 大鼠胰腺进行灌 注， 分离和纯化胰腺的胰岛细胞； 将纯化的胰岛移植入 Ｃ５７ＢＬ／６ 糖尿病小鼠肾包膜下， 分组对移 植后的小鼠进行不同免疫 抑制剂（ 他克莫司、雷帕霉素、抗白介素－ ２Ｒ 抗体） 不同方案联合治疗， 比较各个方案组与对照组（ 不同任何免疫抑制剂） 的 差异性。并对术后移植物存活时间、糖耐量试验以及外周血 ＣＤ４＋、ＣＤ８＋Ｔ 细胞亚群和 ＩＬ－ ２ 含量进行分析和比较。对移植部 位进行组织学切片， 分析胰岛周围单核细胞现象。结果 单纯移植组在无任何免疫抑制剂的情况下， 异种胰岛一般在术后 １０ 天左右丧失功能， 外周血中 ＣＤ４＋ Ｔ 细胞亚群明显高于使用免疫抑制剂组 （ Ｐ＜０．０５） ， 而 ＣＤ８＋Ｔ 细胞亚群没有明 显变化 （ Ｐ＞０．０５） ， ＩＬ－ ２ 含量各组无明显差异（ Ｐ＞０．０５） 。各实验组 １ 周后血糖浓度变化与对照组比较均有显著性差异（ Ｐ＜０．０５） 。应 用 Ｔ＋Ｒ＋Ａ 组， 移植受体存活时间最长平均为 １６１．４±４０．４ 天。结论 他克莫司、雷帕霉素及抗白介素－ ２Ｒ 抗体联合用药， 能 够不同程度的提高胰岛细胞移植后糖尿病小鼠的存活时间。
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移植物经分离和纯化后被移植入受体小鼠的肾包膜 下， 应用免疫抑制剂观察小鼠长期存活时间［６］。
１ 材料与方法
１．１ 实验动物： 选取雄性同系繁殖 Ｗｉｓｔａｒ 大鼠， 体重 ２５０￣２７５ｇ， 用为胰岛供体 ８￣１０ 周， 购自中国科学院 动 物 研 究 所 ； 受 体 试 验 动 物 采 用 ８ ￣１０ 周 雄 性 Ｃ５７ＢＬ／６（ Ｂ６） 小 鼠 ， 购 自 北 京 大 学 医 学 院 实 验 动 物 中心。 １．２ 仪器和试剂： 便携式血糖 仪 （ Ｃｏｍｐａｎｉｏｎ ＩＩ 血 糖 仪及试纸） ， 胶原酶 Ｐ 型（ＳＩＧＭＡ 公司）， Ｆｉｃｏｌｌ （ 华美 生物工程公司） ， ＲＰＭＩ１６４０ 培养液 （ ＧＩＢＣＯ 公司） ， 小鼠 ＩＬ－ ２ ＥＬＩＳＡ 试剂盒（ 北京晶美公司） ， 新生小牛 血清 （ 华美生物工程公司） ， 抗小鼠 Ｔ 细胞 ＣＤ４＋ 、 ＣＤ８＋、荧光单克隆抗体（ 美国 Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｉｎｃ） 。 １．３ 免疫抑制剂： ＦＫ５０６（ 他克莫司， 日本 Ｆｕｊｉｓａｗａ 制 药有限公司） 用 ０．９％的 ＮａＣｌ 溶液配制成， 雷帕霉素 （ 华北制药） ， 用蒸馏水稀释 ， 并 于 ４℃保 存 ， 噻 尼 哌 （ Ｒｏｃｈｅ 公司） 。 １．４ 糖尿病模型的建立： 于 Ｃ５７ＢＬ／６ 小鼠受移植前 ２ 周先建立糖尿病模型， 先将小鼠禁食 ２０ 小时， 链脲 霉素 （ ｓｔｒｅｐｔｏｚｏｔｏｃｉｎ ） 经 腹 腔 一 次 性 给 药 ， 尾 静 脉 采 血测血糖。２ 周后非禁食条件下血糖仍持续在 １８ｍｍｏｌ／Ｌ 以上者作为移植受者。 １．５ 胰 岛 细 胞 分 离 ， 移 植 ： 根 据 Ｍａｌａｎｏ［７］的 胰 岛 分 离 方案， 将 Ｗｉｓｔａｒ 大鼠经胆总管内插管逆行注入预冷 的胶原酶 Ｐ 溶液 ８～１０ｍｌ， 使胰腺膨胀， 迅速摘取整 个胰腺， Ｆｉｃｏｌｌ 梯度离心， 在显微镜下手捡获得纯净 的胰岛， 双硫腙 ＤＴＺ 染色检测胰岛的纯度。将 ３００￣ ４００ 个胰岛移植于糖尿病小鼠肾包膜下， 还纳肾脏 缝合切口。 １．６ 实验分组： 实验分为 ５ 组， 第 １ 组（ ｎ＝７） ： 胰岛移
５０．４５±３．４３＊
１６．５７±１．３３＊
４３．２６±３．２５＊
１４．１１±１．１０＊
ＩＬ－ ２ 含量（ ｎｇ／Ｌ）
５．６１６±４．０１３ ２．７２７±１．８８５ ３．５６２±０．９９６ ２．９９７±１．１５４ ２．４１０±１．３３１
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植后不用任何免疫抑制剂 ｃｏｎｔｒｏｌ 组； 第 ２ 组（ ｎ＝７） ： ＦＫ５０６＋噻尼哌（ Ｔ＋Ａ 组） ； 第 ３ 组（ ｎ＝７） ： 雷帕霉素＋ 噻 尼 哌 （ Ｒ＋Ａ 组 ） ； 第 ４ 组 （ ｎ＝７） ： ＦＫ５０６＋雷 帕 霉 素 （ Ｔ＋Ｒ 组） ； 第 ５ 组（ ｎ＝７） ： ＦＫ５０６＋雷帕霉素＋噻尼哌 （ Ｔ＋Ｒ＋Ａ 组） 。 １．７ 免疫抑制剂用药 方 案 ： 雷 帕 霉 素 ： 蒸 馏 水 稀 释 ， 每隔 １ 天大鼠腹膜内注射 １ 次 １ｍｌ； 第 ０ 天用诱导 剂量浓度为 ０．３ｍｇ／ｋｇ 腹膜内注射； 随后每隔 １ 天腹 膜内注射， 浓度为 ０．１５ｍｇ／ｋｇ， 直到 ２６ 天停止； 于第 ２８ 天开始降低剂量浓度为 ０．１ｍｇ／ｋｇ 腹膜内注射， 直 到试验结束。ＦＫ５０６： ０．９％ＮａＣｌ 溶液稀释。第 ０ 天开 始每天 １ 次腹膜内注射 １ｍｌ（１ｍｇ／ｋｇ）。噻尼哌： 于移 植后第 ０、３、７ 天以及自此以后每周 １ 次连续 ８ 周， 腹膜内注射， 每次 ０．１ｍｇ 溶于 １ｍｌ ０．９％ＮａＣｌ 中。对 照组： 胰岛移植后不接受任何免疫抑制剂， 只是在饮 水中添加 ２５０ｍｇ／Ｌ 的氨苄青霉素， 防止感染。 １．８ 实验室检测学检查： 各实验组均于术后第 ５ 天 尾静脉采血进行 Ｔ 细胞亚群和血清 ＩＬ－ ２ 含量测定； 术后 １ 周小鼠尾静脉采血， 进行糖耐量试验。 １．９ 统计学分析： 用 ＳＰＳＳ１０．０ 统计软件进行分析， 实 验数据以均数±标准差（ ｘ±ｓ） 表示， 对各组 Ｔ 细胞亚 群， ＩＬ－ ２ 含量应用单因素方差分析， 各组血糖浓度 应用重复测量方差分析， 进行多重比较， Ｐ＜０．０５ 有 显著性差异。
作者单位： ５１０５１５ 广东省广州市， 南方医科大学南方医院 器官移植科
的发生发展。但临床胰岛移植仍存在一定的障碍， 主要由于胰岛移植物的质量与数量不足， 如能移植 足够数量、存活且有功能的胰岛， 并适当应用免疫抑 制剂， 则临床胰岛移植效果将会有显著提高［６］。
在免疫抑制方案中目前国际上比较成熟的是加 拿大的“Ｅｄｍｏｎｔｏｎ ｐｒｏｔｏｃｏｌ”经过临床检验， 并得到广 泛 认 可 ［４］。 为 了 研 究 胰 岛 移 植 中 他 克 莫 司 （ Ｔａｃｒｏｌｉｍｕｓ） 、雷 帕 霉 素 （ Ｒａｐａｍｙｃｉｎ） 和 抗 白 介 素 － ２Ｒ 抗体（ Ａｎｔｉ ＩＬ－ ２ Ｒａｎｔｉｂｏｄｙ） 在啮齿类动物之间防 止排斥反应的机理和现象， 本课题选用 Ｗｉｓｔａｒ 大鼠 为胰岛移植物的供体， Ｃ５７ＢＬ／６（ Ｂ６） 作为移植受体，
表 １ 各组术后第 ５ 天外周血 Ｔ 细胞亚群分布及 ＩＬ－ ２ 含量
组别
对照组 Ｔ＋Ａ 组 Ｔ＋Ｒ 组 Ｒ＋Ａ 组 Ｔ＋Ｒ＋Ａ 组
＊ Ｐ＜０．０５
Ｔ 细胞亚群
ＣＤ４＋（ ％）
ＣＤ８＋（ ％）
６６．９９±３．５９
１９．１１±２．５６
５４．２３±４．１３＊
１７．２４±２．１９＊
４７．８７±４．６４＊
１５．４２２±１．５７＊
【关键词】 他克莫司 雷帕霉素 抗白介素－ ２Ｒ 抗体 胰岛细胞移植 长期存活
Ｔｈｅ ｓｔｕｄｙ ｏｆ ｌｏｎｇ－ ｔｅｒ ｍ ｉｓｌｅｔ ｇｒ ａｆｔ ｓｕｒ ｖｉｖａｌ ｉｎ Ｃ５７ＢＬ／６（ Ｂ６） ｍｉｃｅ ｔｒ ｅａｔｅｄ ｗｉｔｈ Ｔａｃｒ ｏｌｉｍｕｓ， Ｒａｐａｍｙｃｉｎ， ａｎｄ Ａｎｔｉ－ ｉｎｔｅｒ － ｌｅｕｋｉｎ － ２Ｒ ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｙｕａｎ Ｃｈａｏ， Ｙｕ Ｌｉｘｉｎ， Ｄｕ ＣｈｕａｎＦｕ， ｅｔ ａｌ． Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｏｒｇａｎ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ，Ｎａｎｆａｎｇ ｈｏｓｐｉｔａｌ， Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｇｕａｎｇｚｈｏｕ ５１０５１５
【Ａｂｓｔｒ ａｃｔ】 Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ Ｔｏ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅ ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｓｕｐｐｒｅｓｓｉｖｅ ａｇｅｎｔｓ ｌｏｎｇ－ ｔｅｒｍ ｓｕｒｖｉｖａｌ ｏｎ Ｃ５７ＢＬ／６ ｍｉｃｅ ｉｓｌｅｔ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｖｉｔｒｏ． Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｗｉｓｔａｒ ｍｉｃｅ ｉｓｌｅｔｓ ｗｅｒｅ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｂｙ ｔｈｅ ｓｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｌｉｂｅｒａｓｅ ａｎｄ ｐｕｒｉｆｉｅｄ ｂｙ ｆｉｃｏｌｌ． Ｓｕｂｓｅｑｕｅｎｔｌｙ，３００ ｔｏ ４００ ｉｓｌｅｔ ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔｓ ｗｅｒｅ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔｅｄ ｕｎｄｅｒ ｔｈｅ ｋｉｄｎｅｙ ｃａｐｓｕｌｅ ｏｆ ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓｌｙ ｄｉａｂｅｔｉｃ Ｃ５７ＢＬ／６ （ Ｂ６） ｍｉｃｅ． Ａｆｔｅｒ ｔｒａｎｓ－ ｐｌａｎｔａｔｉｏｎ， ｂｌｏｏｄ ｇｌｕｃｏｓｅ ｌｅｖｅｌｓ ｗｅｒｅ ｍｏｎｉｔｏｒｅｄ． Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｃｏｎｓｉｓｔｅｄ ｏｆ ａ ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ Ｒａｐａｍｙｃｉｎ， Ｔａｃｒｏｌｉｍｕｓ， ａｎｄ Ａｎｔｉ ＩＬ－ ２Ｒ ａｎｔｉｂｏｄｙ． Ｒｅｓｕｌｔｓ Ａｆｔｅｒ １０ ｄａｙｓ ｌａｔｅｒ， ｔｈｅ ｃｏｎｔｒｏｌ ｇｒｏｕｐ ｇｒａｆｔ ｌｏｓｔ ｔｈｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎ， ｂｌｏｏｄ ＣＤ４＋ Ｔ ｃｅｌｌ ｏｆ ｃｏｎｔｒｏｌ ｇｒｏｕｐ ｗａｓ ｈｉｇｈ－ ｅｒ ｔｈａｎ ｏｔｈｅｒ ｇｒｏｕｐｓ （Ｐ＜０．０５）． Ａｆｔｅｒ １ ｗｅｅｋ， ｅａｃｈ ｇｒｏｕｐ ｏｆ ｂｌｏｏｄ ｇｌｕｃｏｓｅ ｈａｖｅ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ ｗｉｔｈ ｃｏｎｔｒｏｌ ｇｒｏｕｐ （Ｐ＜０．０５）． Ｔｈｅ ｇｒａｆｔ ｓｕｒｖｉｖａｌ ｏｆ Ｔ＋Ｒ＋Ａ ｇｒｏｕｐ ｗａｓ ｌｏｎｇｅｒ ｔｈａｎ ｏｔｈｅｒ ｇｒｏｕｐｓ， ｔｈｅ ｍｅａｎ ｓｕｒｖｉｖａｌ ｄａｙｓ ｗｅｒｅ １６１．４±４０．４ｄ． Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ Ｃｏｍ－ ｂｉｎｅｄ ｗｉｔｈ Ｔａｃｒｏｌｉｍｕｓ， Ｒａｐａｍｙｃｉｎ ａｎｄ Ａｎｔｉ ＩＬ－ ２Ｒ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｉｍｍｕｎｏｓｕｐｐｒｅｓｓｉｖｅ ｃａｎ ｐｒｏｌｏｎｇ ｔｈｅ ｇｒａｆｔ ｓｕｒｖｉｖａｌ ｉｎ ｄｉａｂｅｔｉｃ ａｆｔｅｒ ｉｓｌｅｔ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ．