猪Calsarcin-2基因编码区的克隆及组织表达谱分析
猪白细胞介素-2基因的克隆与表达
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一株猪圆环病毒2型全基因组的克隆与序列分析
一株猪圆环病毒2型全基因组的克隆与序列分析王伟丞;梁海英;曾智勇;汤德元;刘钊【摘要】应用猪繁殖障碍性病毒性疫病6重PCR检测方法对贵州省开阳县某规猪场送检的1头疑似断奶仔猪多系统衰竭综合征的病死仔猪进行病原检测,确诊感染有猪圆环病毒2型(PCV2)后,对该病毒全基因组进行扩增,将其克隆到pMD19-TSimple载体上,筛选获得了重组质粒pMD19-T-PCV2,并对其进行序列测定和分析.结果表明:克隆得到的PCV2毒株的基因组全长为1 767 bp,与国内外参考毒株核苷酸序列相似性为94.1％～98.4％,根据欧盟猪圆环病毒疾病委员会规定的PCV2基因型划分标准,将PCV2 GZ-KY1毒株划分为PCV2b亚型.【期刊名称】《中国兽医杂志》【年(卷),期】2014(050)008【总页数】3页(P20-22)【关键词】猪圆环病毒2型;基因组;克隆;序列分析【作者】王伟丞;梁海英;曾智勇;汤德元;刘钊【作者单位】贵州大学动物科学学院,贵州贵阳550025;贵州大学教学实验场,贵州贵阳550025;贵州大学动物科学学院,贵州贵阳550025;贵州大学动物科学学院,贵州贵阳550025;贵州大学动物科学学院,贵州贵阳550025【正文语种】中文【中图分类】S852.65+1猪圆环病毒2型（Porcine circovirus type 2，PCV2）是引起断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)的主要病原。
PMWS于1997年首次在加拿大报道，随后在美国、法国、德国、日本等多个国家相继报道。
近年来该病在我国普遍流行，给我国养猪业造成了巨大的经济损失[1]。
2000年郎洪武等首次报道中国猪群存在PCV2感染，阳性率为42.9%[2]。
2007年周绪斌等报道在2000-2005年间20多个省市PCV2感染平均阳性率达55.04%[3]。
根据崔亚兰等对贵州省2007-2011年猪圆环病毒感染的流行病学调查结果表明，PCV2在贵州省的感染日益严重[4]；另根据本实验室对2011-2012年间贵州部分地区的PCV2血清学调查发现，PCV2野毒感染的阳性率高达61.3%[5]。
猪ApoER2与VLDLR基因的克隆、组织表达及功能特征研究的开题报告
猪ApoER2与VLDLR基因的克隆、组织表达及功能特征研究的开题报告题目: 猪ApoER2与VLDLR基因的克隆、组织表达及功能特征研究一、研究背景ApoER2和VLDLR是细胞膜上的两种受体，与神经元迁移和突触塑性等过程有关。
它们在哺乳动物和家禽中的结构和功能已有较深入的研究，但在猪中的研究尚不足够。
同时，猪是重要的经济动物，其神经系统发育和认知能力等方面的研究对于提高猪的生产效益和研究人类疾病具有重要意义。
二、研究目的本研究旨在克隆猪ApoER2和VLDLR基因的全长cDNA序列，分析其基因结构和表达特点，并进行功能鉴定，以进一步深入了解其在猪神经系统发育和认知能力等方面的作用。
三、研究方法1. 克隆猪ApoER2和VLDLR基因的全长cDNA序列，进行生物信息学分析和基因结构预测。
2. 利用RT-qPCR技术检测猪不同组织中ApoER2和VLDLR基因的表达水平，并进行差异分析。
3. 利用CRISPR/Cas9技术建立ApoER2和VLDLR基因敲除的细胞系，检测其对神经元迁移和突触塑性的影响。
4. 构建ApoER2和VLDLR基因的过表达重组质粒，转染至细胞系中进行功能鉴定。
四、研究意义1. 构建猪ApoER2和VLDLR基因的全长cDNA序列并分析其基因结构可进一步了解其在猪神经系统发育和认知能力等方面的作用和机制。
2. 通过RT-qPCR技术检测不同组织中ApoER2和VLDLR基因的表达水平，可以研究它们在不同组织和疾病中的作用。
3. 利用CRISPR/Cas9技术建立ApoER2和VLDLR基因敲除的细胞系可深入了解其在神经元迁移和突触塑性等方面的作用和机制。
4. 构建ApoER2和VLDLR基因的过表达重组质粒并进行功能鉴定，可以研究它们对神经系统发育和认知能力等方面的作用和机制。
五、研究进展及展望目前，已完成了猪ApoER2和VLDLR基因的克隆和序列鉴定，正在进行基因结构预测和表达分析。
6株猪圆环病毒2型流行毒株全基因组克隆及序列分析.
动物医学进展,2006,27(7:66273Progress in Veterinary Medicine6株猪圆环病毒2型流行毒株全基因组克隆及序列分析3黄伟坚,连慧香,尹业师,屈素洁,李军,余克伦,罗廷荣,陆芹章,刘芳(广西大学动物科技学院,广西南宁530005中图分类号:S852.659.2;S858.28文献标识码:A文章编号:100725038(20060620066208摘要:参考GenBank发表的PCV22全基因组序列,设计1对引物,通过反向PCR技术扩增出6株PCV22流行株的全基因,并进行了序列测定分析。
结果表明,6个分离株基因组全长为1768bp或1767bp,同源性比较发现,分离株之间的核苷酸同源性为95.5% ~100%,与GenBank上已发表的PCV22分离株之间的同源性为93.0%~100%,与法国分离株同源性最高。
6株分离株的ORF2核苷酸及其所推导的氨基酸序列同源性分别为92.9%~100%和92.3%~100%,存在较大的变异。
关键词:猪圆环病毒2型;全基因组;同源性;变异猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type2, PCV22是近年来兽医界关注较多的新发现病毒之一,具有重要的科研价值和经济意义。
PCV22是引起断奶后仔猪多系统衰竭征的主要病原体[1],随着对PCV22研究的不断深入,发现PCV22还与仔猪的A2型先天性震颤、怀孕母猪的繁殖障碍、猪皮炎肾病综合征及猪呼吸道综合征等临床疾病有关[2]。
PCV22的主要危害在于能够使感染猪的免疫功能受到损害[324],导致机体抵抗力下降,易遭受其他病原的并发或继发感染,使病情加重,造成巨大的经济损失。
这种可导致机体免疫抑制的病毒,由于经常以亚临床感染的形式出现,常被忽视。
最近两三年,广西地区也出现了与PCV22相关疾病的报道[5],而且危害逐年增加。
本研究通过流行毒株的全基因克隆与测序,分析PCV毒株之间的遗传发生关系和分子差异,探索PCV22变异规律,为今后深入研究该病的分子生物学特性及开发有效的免疫制剂提供科学依据。
猪圆环病毒Ⅱ型盐城株的全基因组克隆与序列分析
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猪FcγR ⅡB多种剪接异构体的基因克隆与序列分析
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猪2型圆环病毒新疆株全基因组的克隆与序列分析
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ＷＳ已在我 国大 部分地 区流行 开 来 。２ １ ０ ０年 ， 翟 少 伦［ １ 通过 滚 环 扩 增 技 术从 来 自新 疆 某 猪 场 猪 等 肺 脏病料 中获 得 ２株 Ｐ Ｖ２的全 基 因组 ， 登 录号 Ｃ 其
１ 材料 与方 法
１ １ 病料 、 ． 细胞及 菌株
工 生物 工程 有 限公 司测 序 。
１ ７ 分 子 遗 传 与 进 化 分 析 ．
新疆 昌吉 某 猪 场 （ 疑似 Ｐ ＭＷＳ断奶 仔 猪 的脾 、 肾、 巴 结 等 ） 一 ７ ℃ 保 存 备 用 。 Ｐ １ 淋 ， ， Ｏ Ｋ一５细 胞
新 疆 农 业 大 学 学 报
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Ｊ ｕ ｎ ｌ ｆ Ｘ ｎ ｎ ｇ ｉｕｔｒｌＵ ｉｅｓｔ ｏ ｒ ａ ｉｊａ ｇＡ ｒｃｌ ａ ｎｖｒｉ ｏ ｉ ｕ ｙ
文 章 编 号 ： ０ ７８ １ （０ ２ Ｏ一０ ２０ １ ０—６ ４ ２ １ ） ｌ０ ４—５
猪 ２型 圆环病 毒 新 疆株 全基 因组 的克 隆 与序 列 分 析
吴 星 星 ， 春 娟 ，王 璐 ，宫 玉 玲 ， 建 华 ， 多 良 郭 孙 冉
（ 疆农业大学 动物医学学院 ， 新 乌鲁 木 齐 摘 ８０５） ３０ ２
要 ： 根 据 ＧｅＢ ｎ ｎ ａ ｋ中猪 ２型 圆 环 病 毒 （ Ｃ ） 核 苷 酸 序 列 ， 计 了一 对 引 物 ， 用 Ｐ Ｒ方 法 从 疑 似 断 奶 仔 Ｐ Ｖ２ 的 设 采 Ｃ
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猪Calsarcin-2基因编码区的克隆及组织表达谱分析（作者:___________单位: ___________邮编: ___________）作者：苏玉虹，刘东鑫，宋慧娟，曾瑞霞，巴彩凤，王洪才【摘要】目的克隆猪Calsarcin-2（Cs-2）基因，并探讨其在猪组织中的表达特点。
方法利用RT-PCR方法扩增猪Cs-2基因编码区的序列；采用Northern 杂交和半定量RT-PCR方法在猪不同组织和不同部位骨骼肌中分析Cs-2基因表达情况及转录本个数、大小。
结果猪Cs-2基因片段长934 bp,含有1个897 bp的开放阅读框（ORF），编码298个氨基酸，与已报到的人Cs-2基因氨基酸序列相似性为93%；猪Cs-2基因仅在骨骼肌中表达，不同骨骼肌中表达量有所不同，以背最长肌最高；此基因在骨骼肌中只有一个转录本，大小为1.26 kb。
结论猪Cs-2基因序列与已报道的人、鼠Cs-2基因具有高度同源性，主要在骨骼肌中特异表达。
【关键词】猪；Cs-2基因；组织表达谱Cloning of Encoding Region and Analysis of Tissue ExpressionProfile of Pig Calsarcin-2 GeneSU Yuhong, LIU Dongxin, SONG Huijuan,ZENG Ruixia, BA Caifeng, WANG Hongcai(Liaoning Medical University, Jinzhou 121001 China)Abstract：Objective To clone swine Cs-2 gene and to investigate the character of tissue expression in pigs. Methods The sequence of porcine gene Cs-2 was amplified by RT-PCR. The numbers and size of porcine Cs-2 transcripts in skeletal muscle were obtained with Northern blotting and the expression levels in multiple tissues were detected by semi-quantitative RT-PCR. Results The length of porcine Cs-2 cDNA was 934 bp containing an ORF of 897 bp, which encoded a 166 amino acids. Homology of amino acids sequence between the amplified porcine and the reported human Cs-2 was 93%. There was only one transcript among different skeletal muscles whose size was nearly 1.26 kb, but not detected in the other tissues including heart,liver,spleen,lung and kidney.The expression levels of Cs-2 gene varied among different skeletal muscles. It was the highest expression in musculus longissimus dorsi. Conclusions There are great similarities in the porcine Cs-2 gene, human gene and murine Cs-2 gene, which are expressed mainly in skeletal muscles.Key words：pig; Cs-2; tissue expression profile猪肉是人类蛋白质主要来源之一，其基本组成单位是肌纤维，与肉质性状存在相关性。
研究发现：不同品种猪的肌纤维类型转化规律基本一致，但转化率不同，肌肉代谢束内肌纤维类型的组成直接影响全身肌肉量和食用品质。
肌肉中红肌纤维（慢反应纤维）所占比例越大，白肌纤维（快反应纤维）所占比例越小，肌肉品质相对就越好［1］。
很多基因及其产物影响肌肉的肌纤维类型。
有报道指出活化的钙调磷酸酶促进慢反应纤维基因表达［2］。
Frey等以钙调磷酸酶的催化亚基和半乳糖基因激活转录因子的DNA结合结构域组成的融合蛋白为诱饵，双杂交筛选出Calsarcin基因家族的2个成员：Cs-1,Cs-2；Calsarcin蛋白家族能同钙调节酶催化亚基相互作用，诱导细胞内信号传导，调节快慢骨骼肌纤维之间的转化［3］。
人、鼠的Cs-2基因主要在骨骼肌快反应纤维中表达，人中转录体大小约为1.5 kb，鼠的约为1.35 kb。
利用比较基因组学方法，本课题组2006年克隆了猪Cs-2基因，并初步分析了该基因的结构与功能［4］。
本研究在上述工作基础上对猪Cs-2基因进行组织表达谱分析，为进一步研究此基因的结构与功能提供科学依据。
1 材料和方法1.1 实验样品采集同品种、同日龄、同环境饲养的三头成年本地大白猪的股二头肌、头半棘肌、背最长肌、内脊肌及心、肝、脾、肺、肾组织。
所有组织样品采集后迅速置于液氮中冷冻后-80 ℃保存。
1.2 总RNA的提取采用Trizol一步法提取3头本地大白猪不同组织的总RNA。
苏玉虹，等：猪Calsarcin-2基因编码区的克隆及组织表达谱分析辽宁医学院学报2008年10月，29(5)1.3 利用电子克隆策略设计引物以人的同源基因cDNA为信息探针,利用BLAST工具在猪EST数据库中调取同源性序列（标准:长度≥200 bp，相似性≥80%）。
筛选出的ESTs利用Gene Tool 2.0软件进行拼接，以拼接序列重叠群为模板，综合考虑引物设计的各项原则，在Primer Premier 5.0软件中设计引物扩增ORF全长序列。
引物序列及退火温度如下：CS2-F：5＇-TCCACAATGCCGCTCT-3＇，CS2-R：5＇-GAATCATGATGCAAAGG-3＇，退火温度51℃。
1.4 RT-PCR 反应首先以Oligo(dt)15为引物，反转录酶催化cDNA第一链的合成；其次，以cDNA第一链为模板，以CS2为引物进行RT-PCR，PCR 产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测。
1.5 PCR产物的克隆与测序PCR产物经DNA回收试剂盒回收纯化后，与pMD18-T Vector连接，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，应用α互补作用筛选白色菌落。
用碱裂解法抽提质粒，经PCR及EcoRⅠ和HindⅢ双酶切鉴定，阳性质粒送上海生工进行双向测序。
细菌转化、质粒抽提、酶切鉴定均按分子克隆实验指南［5］稍加修改进行。
1.6 Northern杂交按照DIG High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit说明书进行操作。
以CS2引物扩增的934 bp片段标记地高辛作为探针来杂交本地大白猪的股二头肌、头半棘肌、背最长肌、内脊肌及心、肝、脾、肺、肾组织的总RNA。
1.7 组织表达谱分析利用半定量RT-PCR方法检测Cs-2基因在本地大白猪4个非肌肉组织（肝、脾、肺、肾）及5个不同部位肌肉组织（心肌、股二头肌、头半棘肌、背最长肌和内脊肌）中的表达丰度。
为避免基因组污染，利用猪管家基因GAPDH作内标，以CS2引物扩增条带亮度与内标的比值作为表达丰度。
GAPDH基因(GenBank登录号为AF017079)引物序列如下：正向引物：5’-ACCACAGTCCATGCCATCAC- 3’，反向引物：5’-TCCACCACCCTGTTGCTGTA- 3’。
PCR结束后将反应产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，观察并利用图像分析软件Gene Tools分析结果。
2 结果2.1 RT-PCR 扩增结果图1所示，在三头本地大白猪的背最长肌组织中，CS2引物的RT-PCR扩增特异性条带位于900 -1000 bp之间，大小与预期结果一致。
2.2 阳性克隆子的双酶切鉴定引物CS2的扩增产物与载体连接后转化到大肠杆菌内，提取的质粒经EcoRⅠ和HindⅢ双酶切后，10 g／L琼脂糖凝胶电泳检测结果见图2。
由图2可知，双酶切产物与PCR扩增产物一致，表明所提取质粒中含有扩增的目的片段。
2.3 猪Cs-2基因的测序与分析2.3.1 cDNA序列及相似性将扩增片段双向测序后，用Sequencher 4.1.4软件拼接，得到一条934 bp的cDNA整合序列，并提交到GenBank，登录号为DQ058294。
该cDNA序列包括897 bp的全长CDS序列，编码298个氨基酸。
根据物种间剪切位点的保守性分析，获得了该序列5个外显子的连接点，如图3所示。
将此CDS序列与人Cs-2基因cDNA 序列（GenBank登录号为NM_021245）和小鼠Cs-2基因cDNA序列（GenBank登录号为NM_021508）进行BLAST比对，结果显示它们之间的相似性分别为91%和87%。
至此，可将克隆、拼接得到的934 bp的基因片段命名为猪Cs-2基因。
下划线部分为起始密码子和终止密码子；斜体加黑部分为预测的猪Cs-2基因外显子的连接部位2.3.2 氨基酸序列分析由猪Cs-2基因ORF推导的氨基酸序列与人、小鼠Cs-2基因的氨基酸序列之间的相似性分别为93%和89.6%，说明Cs-2蛋白在哺乳动物中相当保守。
此外，Cs-2蛋白同人、鼠的calsarcin家族的其它两个成员比较发现：calsarcin家族成员的氨基端和羧基端的氨基酸序列比较保守，中间的氨基酸变化较大。
Prosite数据库搜索发现Cs-2蛋白存在多种模序，有天冬氨酸糖基化位点，葡萄糖胺聚糖结合位点，十四(烷)酰化位点，酰胺化位点及多种磷酸化位点，包括蛋白酶C磷酸化位点，依赖于cAMP、cGMP蛋白磷酸化位点以及酪蛋白激酶Ⅱ磷酸位点。
经SOPMA软件预测，其二级结构为：α-螺旋占16.44%；β-转角占8.39%；延伸链占18.79%；无规卷曲占56.38%。
2.4 Northern 杂交探针与本地大白猪的背最长肌、内脊肌、头半棘肌及股二头肌总RNA的杂交图均可见杂交信号带，显示该基因在肌肉组织中只有一个转录本，约为1.26 kb，但在心、肝、脾、肺、肾组织中不表达。