聚谷氨酸液态发酵条件优化
γ-聚谷氨酸发酵过程中溶氧控制优化
谷氨酸发酵生产的过程优化与控制研究
谷氨酸发酵过程优化与控制研究【摘要】：谷氨酸产生菌既是谷氨酸发酵反应过程的主体，也是反应过程的生物催化剂。
通过对影响谷氨酸发酵生产的菌种、原料、发酵环境条件等因素进行分析，指出采用代谢工程方法优化生产菌种和发酵工艺，能够使菌种发酵的综合技术得到不断提高。
关键词：谷氨酸发酵；菌种；流加糖；生物素；发酵环境条件；控制谷氨酸发酵生产是谷氨酸产生菌在其生命活动过程中分解、代谢营养物质、合成所需产物———谷氨酸的生化过程。
在这个过程中，影响谷氨酸产生菌生长、繁殖、代谢及合成产物的因素很多，通过人工干预有目的地控制这些因素，使其最终满足谷氨酸菌种的代谢合成需要，可以达到增加产物、降低消耗的目的。
谷氨酸产生菌既是反应过程的主体，也是反应过程的生物催化剂，它摄取原料的营养，通过细胞内特定的酶系列进行复杂的生化反应。
其底物中的反应物透过细胞壁和细胞膜进入细胞体内，在酶的作用下进行催化反应，将反应物转化为产物并释放出来，细胞的内在特性及其代谢规律是影响生化反应的关键因素。
因此，发酵是一个比其他工业过程更为复杂的动态过程。
1 选育优良菌种高产、纯正、优良的菌种是保证发酵成功的前提，因此优良生产菌种的选育一直是谷氨酸发酵的主要研究课题。
谷氨酸发酵一般采用黄色短杆菌（Brevibacterium fLavum）为出发菌株，根据代谢控制发酵原理进行人工诱变，定向选育高产率的菌种。
在菌种的保藏和培养过程中，与一切生物发酵生产一样，菌种是发酵生产成败的内因，生产选用高产、纯正、优良的菌种，必须做好 5 个方面的控制：①严格保藏温度和干燥的环境，满足菌种不变异、不退化、不污染的条件。
保藏菌种要经分离、纯化、筛选，要有专门的冷藏设备，周围的环境要清洁无污染，对于细菌的保藏可采用- 80 ℃冰箱保藏液体菌种的方法。
②生产使用的菌种要尽量减少传代次数，斜面菌种一般以 2 代~ 3 代可用于生产的为佳。
③严格菌种培养的原材料，试剂原料经过摇瓶和生产试验后，要基本固定规格和生产厂家。
聚谷氨酸高产菌株筛选及发酵条件优化.
γ中国生物工程杂志China Biotechnology, 2005, 25(12):62～65胡荣章1叶海峰1金丽1吴昌琳2吴自荣1*(1 华东师范大学生命科学学院上海2000622 华东师范大学物理系上海200062）摘要γ报道了以11株枯草芽孢杆菌菌株为培养菌株，用3种谷氨酸钠含量不同的培养基进行筛选获得1株γ初始pH、接种量、通气量等发酵条件的优化实验，结果表明最佳发酵条件为：250ml三角烧瓶装液40ml,接种体积分数5％，麦芽糖50g/L，酵母膏10g/L，谷氨酸钠30g/L， NaCl 10g/L，KH2PO4 5g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，初始pH6.0，发酵60h，此时γ达到30.26g/L，比国外报道的20g/L的产量有显著提高。
纯化后产物经红外光谱及核磁共振检测，鉴定为γ关键词聚谷氨酸芽孢杆菌筛选发酵条件优化收稿日期：20050628修回日期：20051008* 通讯作者，电子信箱：zrwu@γγpolyglutamic acid,γPGA）是由微生物合成的一种细胞外高分子量聚合物，由谷氨酸的α－氨基和γ缩合而成。
Shih等［1］首次发现炭疽芽孢杆菌的荚膜中含有γPGA，随后发现有些芽孢杆菌属细菌能够通过发酵培养积累γPGA。
γPGA分子链上具有较高活性的羧基（-COOH），可与一些药物结合生成较稳定的复合物，在体内可被溶酶体降解为内源性谷氨酸，并释放出药物，是一种理想的药物载体［2,3］。
此外，它还具有水溶性、可生物降解、可食用、吸水性强、对人体和环境无毒害作用等特性，因而被广泛应用于食品、化妆品、水处理、农业医药等方面［4］。
但由于微生物发酵产量低，生产成本过高，因此还没有实现大规模生产，故筛选高产菌种、降低生产成本是解决问题的关键。
本研究从筛选高产菌种、优化发酵条件、提高产量着手进行了初步探讨。
1材料和方法1.1材料1.1.1菌种枯草芽孢杆菌（Bacillus. sp）共11株，由本实验室保存。
响应面法优化γ-聚谷氨酸发酵条件
响应面法优化γ-聚谷氨酸发酵条件张智维;刘婷;张海群【期刊名称】《中国调味品》【年(卷),期】2015(000)007【摘要】以一株从纳豆中分离得到的纳豆芽孢杆菌进行γ-聚谷氨酸发酵,利用响应面法对发酵的条件进行优化。
实验结果表明：接种量、pH值和温度是影响发酵的主要因素。
最终达到该株纳豆芽孢杆菌发酵γ-聚谷氨酸的最佳发酵条件：温度40.00℃,接种量7.1%,pH值7.76。
此条件下γ-PGA为19.612 g/L。
%γ-polyglutamic (γ-PGA)is produced by fermentation of Bacillus subtilis natto screened from natto.Furthermore, the optimization of fermentation conditions by response surface method is studied.The results indicate that inoculation quantity,pH value and temperature are the main factors that impact the fermentation process. Finally, the Bacillus subtilis natto possesses the optimal fermentation conditions:temperature of40.00 ℃,inoculation quantity of 7.1%,and pH value of 7.76.Under such conditions,the yield ofγ-PGA reaches 19.612 g/L.【总页数】5页(P56-60)【作者】张智维;刘婷;张海群【作者单位】陕西科技大学生命科学与工程学院，西安 710021;陕西科技大学生命科学与工程学院，西安 710021;陕西科技大学生命科学与工程学院，西安710021【正文语种】中文【中图分类】TS201.5【相关文献】1.γ－聚谷氨酸产生菌发酵培养基的响应面法优化研究2.多聚谷氨酸发酵的响应面法优化3.响应面法优化枯草芽孢杆菌产γ-聚谷氨酸发酵工艺4.利用响应面法优化γ-聚谷氨酸发酵培养基5.响应面法优化γ-聚谷氨酸发酵条件因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
γ-聚谷氨酸生产菌种的ARTP诱变及其发酵条件优化
Ａｂ ｓ ｔ ｒ ａ ｃ ｔ ：Ａｓ ａ ｈ ｉ 【 ｇ ｈ ｍｏ ｌ ｅ ｃ ｕ ｌ ａ ｒ ａ ｍｉ ｎ ｏ ａ ｃ ｉ ｄ ｆ ｒ ｏ ｍ ｂ ｉ ｏ ｓ ｙ ｎ ｔ ｈ ｅ ｓ ｉ ｓ ，＾ ｙ — Ｐ ＧＡ ｈ ａ ｓ ｈ ｉ ｇ ｈ ｗａ ｔ ｅ ｒ ｓ ｏ ｌ ｕ ｂ ｉ ｌ ｉ ｔ ｙ ａ ｎ ｄ ｂ ｉ ｏ ｃ ｏ ｍｐ ａ ｔ ｉ ｂ ｉ ｌ — ｉ ｔ ｙ，ｗｈ ｉ ｃ ｈ ｃ ａ ｎ ｂ ｅ ｗｉ ｄ ｅ ｌ ｙ ｕ ｓ ｅ ｄ ｉ ｎ ｆ ｏ ｏ ｄ， ｍｅ ｄ ｉ ｃ ｉ ｎ ｅ ，ｈ ｏ ｕ ｓ ｅ ｈ ｏ ｌ ｄ ｃ ｈ ｅ ｍｉ ｃ ａ ｌ ｓ ，ｅ ｎ ｖ ｉ ｒ ｏ ｎ ｍｅ ｎ ｔ ａ ｌ ｐ ｒ ｏ ｔ ｅ ｃ ｔ ｉ ｏ ｎ
食
品 与 发
酵 科
技
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第 ５ ３卷 （ 第 ６期 ） Ｖ ｏ １ ． ５ ３， Ｎｏ ． ６
一
聚谷 氨酸生产 菌种 的 Ａ Ｒ Ｔ Ｐ诱变及其发酵条件优化
２ ． Ｓ ｉ ｃ ｈ ｕ ａ ｎ Ａｃ ａ ｄ ｅ ｍ ｙ ｏ ｆ Ｆ ｏ ｏ ｄ ａ ｎ ｄ Ｆ ｅ ｒ ｍ ｅ ｎ ｔ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ Ｉ ｎ ｄ ｓｔ ｕ ｒ ｉ ｅ ｓ ， Ｃ ｈ ｅ ｎ ｇ ｄ ｕ Ｓ ｉ ｃ ｈ ｕ ａ ｎ ６ １ ３ ３ ３ ０ ， Ｃ ｈ ｉ ｎ ａ ）
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枯草芽孢杆菌发酵生产聚-γ-谷氨酸的条件优化
枯草芽孢杆菌发酵生产聚-γ-谷氨酸的条件优化武国慧;张蕾;高德才;李鹏程;张鹰;石元亮【摘要】为提高聚-γ-谷氨酸(poly-γ-glutamic acid,γ-PGA)产量,降低其生产成本,利用枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis),采用单因素试验及正交试验优化法,探究培养基组分及发酵条件对γ-PGA发酵产量的影响.结果表明:最佳培养基组成和培养条件为:蔗糖5%,谷氨酸钠6%,氯化铵0.3%,磷酸氢二钾2%,磷酸二氢钾0.1%,硫酸锰0.003%,pH 7.0,接种量为3%,发酵温度33℃,发酵时间48 h.与未优化前γ-PGA产量(15.8 g/L)相比,经优化后的产量达20.8 g/L,提高了31.65%.%To improve the production and reduce the cost ofγ-PGA, a fermentation study with Bacillus subtilis was conducted to explore the effects of medium compositions and culture cond itions onγ-PGA production based on single-factor experiment and orthogonal design. The results showed that the optimized cultivation conditions and medium composition were as follows:sucrose 5%;sodium glutamate 6%;NH4Cl0.3%;K2HPO42%;KH2PO40.1%;MnSO40.003%;initial pH 7.0;inoculum amount 3%;temperature 33℃;fermentation time 48 h. In this study, highγ-PGA productivity (20.8 g/L) was obtained under the optimal conditions, 31.65%higher than the previous conditions(15.8 g/L).【期刊名称】《食品研究与开发》【年(卷),期】2017(038)011【总页数】6页(P165-170)【关键词】聚-γ-谷氨酸;液体发酵;微生物合成;培养基;正交设计【作者】武国慧;张蕾;高德才;李鹏程;张鹰;石元亮【作者单位】中国科学院沈阳应用生态研究所,辽宁沈阳 110016;中国科学院大学,北京 100049;中国科学院沈阳应用生态研究所,辽宁沈阳 110016;中国科学院大学,北京 100049;中国科学院沈阳应用生态研究所,辽宁沈阳 110016;中国科学院大学,北京 100049;辽宁中科生物工程有限公司,辽宁本溪 117004;辽宁中科生物工程有限公司,辽宁本溪 117004;中国科学院沈阳应用生态研究所,辽宁沈阳 110016;辽宁中科生物工程有限公司,辽宁本溪 117004【正文语种】中文聚-γ-谷氨酸（poly-γ-glutamic acid，γ-PGA）是微生物（主要为芽孢杆菌类）发酵的产物，由L-谷氨酸（L-Glu）、D-谷氨酸（D-Glu）单体通过γ-酰胺键聚合而成的一种阴离子高分子型聚合物[1]。
γ-聚谷氨酸固态发酵提取液的脱色研究
γ-聚谷氨酸固态发酵提取液的脱色研究作者：欧诗亮，王永东，邹水洋来源：《现代食品》 2018年第18期摘要：对γ- 聚谷氨酸（γ-PGA）固态发酵提取液的脱色工艺进行研究，正交试验优化了γ-PGA 发酵提取液的脱色工艺条件，并考察了不同吸附剂联合使用对脱色效果和产物回收率的影响。
结果表明：发酵提取液的脱色优化工艺条件为温度50 ℃、脱色时间2 h、pH 5、活性炭添加量30 g/L 时，脱色效果较好，脱色率为83.37%；将15 g/L 活性炭分别与15 g/L 活性白土、凹凸棒黏土按先后次序对γ-PGA 发酵提取液进行脱色处理能达到良好的脱色效果和较高的产物回收率；其中活性炭与凹凸棒黏土联用的脱色率和产物回收率分别达到92.53%、88.20%。
该方法既利用了不同吸附剂之间的互补性，又避免了吸附剂的过高浓度对目标产物的无选择吸附，为γ-PGA 发酵提取液的脱色工艺提供了新的思路。
关键词：γ- 聚谷氨酸；活性炭；吸附剂；脱色γ- 聚谷氨酸（γ-poly glutamic acid，γ-PGA）作为一种新型的可生物降解高分子材料，因其强吸水性、免疫原性、高成膜性和生物组织相容等良好性能[1]，具有广阔的应用前景。
γ-PGA 常用的生产方法是微生物发酵法。
成品γ-PGA 是白色晶体或粉末状，而发酵液会带有一定的颜色，因此在醇析提取之前必须通过各种手段去除色素。
色素的来源既有原料本身，也有杀菌和发酵过程中产生的。
由于培养基中含有大量谷氨酸、多肽以及蛋白质，很容易与还原糖发生美拉德反应产生褐变[2]；基于γ-PGA 发酵液中菌体含量高，黏度大，色素成分复杂使得脱色较为困难且产物损失大。
所以脱色工艺是γ-PGA 生产中必须高度重视的关键环节。
目前脱色主要采用大孔吸附型树脂、离子交换树脂、活性炭粉、活性炭颗粒、硅藻土等吸附剂，然而这些物质脱色吸附的同时也降低了产物的含量[3]。
因此，本文拟考察多种吸附剂及其脱色工艺条件对产品脱色率和回收率的影响以获取优化的脱色工艺。
微生物发酵聚谷氨酸的工艺流程
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聚谷氨酸液态发酵条件优化作者：刘洁王建磊刘燕妮牟海津来源：《安徽农业科学》2014年第32期摘要 [目的]对一株产聚谷氨酸（γPGA）的枯草芽孢杆菌N2的液态发酵培养基以及发酵条件进行优化。
[方法]采用单因素试验和响应面分析法结合的方法，对枯草芽孢杆菌N2的液态发酵培养基以及发酵条件进行优化。
[结果]优化得到的最佳发酵培养基组分为蔗糖31.5 g/L，大豆蛋白胨4.0 g/L，L谷氨酸44.3 g/L，KH2PO4 0.3 g/L，无水CaCl2 0.2 g/L，NaCl 3.0 g/L。
优化得到的最适发酵条件为：pH 7.5，装液量30%，接种量7%，37 ℃发酵48 h，此时γPGA 的产量最大可达18.7 g/L。
[结论]为今后聚谷氨酸的性质研究奠定基础。
关键词γPGA;液态发酵;条件优化;响应面法中图分类号 S188+.4 ;文献标识码A ;文章编号 0517-6611（2014）32-11231-05Research on Liquidstate Fermentation Condition of γpolyglutamic AcidLIU Jie， WANG Jianlei， LIU Yanni， MOU Haijin* ;（College of Food Science and Engineering， Ocean University of China， Qingdao， Shandong 266003）Abstract ;[Objective] To optimize the liquidstate fermentation conditions to improve the production of γPoly glutamic acid （γPGA） of an bacillus subtilis N2. [Method] Single factor experiments and response surface methodology （RSM） were used to optimize the cultivation conditions and medium. [Result] Under the liquidstate fermentation， the optimum medium was sucrose 31.5 g/L， soy peptone 4.0 g/L， L glutamic acid 44.4 g/L， potassium dihydrogen phosphate 0.3 g/L， calcium chloride anhydrous 0.2 g/L and NaCl 3.0 g/L. The optimized cultivation conditions were decided as follows： initial pH value 7.5， medium volume 30%， inoculums size 7 % and temperature 37 ℃. The maximum yield of γPGA was 18.7 g/L after 48 h under the optimum conditions. [Conclusion] This paper finds the best combination of factors to promote the production of γPGA and contributes to the further research of γPGA.Key words ;γPGA; Liquidstate fermentation; Condition optimization; RSM聚谷氨酸（Polygammaglutamic，γPGA）是一种天然的水溶性酰胺化合物[1]，由L谷氨酸或D谷氨酸通过γ酰胺键连接而形成的多聚体[2]，由枯草芽孢杆菌生产的γPGA结构式见图1[3] 。
图1 γPGA的结构式1913年，γPGA被证实是一些芽孢杆菌荚膜结构的主要成分，自1942年，Bovamick 等发现γPGA作为种发酵产物能自由地分泌到枯草芽孢杆菌的生长培养基中后，多种可在胞外产生γPGA的芽孢杆菌被发现[4] 。
γPGA具有生物可降解性、可食用性、对人体和环境无毒无害性等特性，因此γPGA及其衍生物在医药、农业、食品、工业等方面拥有广阔的应用前景。
目前γPGA生产方法主要有化学合成法、提取法、酶转化法和微生物合成法4种。
前3种方法工艺复杂，成本较高，难以在实际生产中加以应用[5]。
相比之下，微生物合成法生产γPGA由于其工艺简单且环境污染少等特点是目前最常用的方法。
笔者通过单因素和响应面分析法，得出了枯草芽孢杆菌N2的最佳培养条件，显著提高了液态发酵过程中的γPGA产量，为以后γPGA的特性研究和应用奠定基础。
1 材料与方法1.1 菌种枯草芽孢杆菌N2（Bacillus subtilis N2），由中国海洋大学应用微生物实验室提供。
1.2 试验方法1.2.1 培养方法。
初始培养基：葡萄糖30.0 g/L，酵母膏5.0 g/L，谷氨酸30.0 g/L，KH2PO40.5 g/L，MgSO40.1 g/L。
初始培养条件：初始pH 7.0，培养温度37 ℃，培养基装液量40%，接种量5%，发酵时间48 h。
1.2.2 指标测定方法。
γPGA的产量测定参照文献[6]，首先将发酵液的pH调至3降低发酵液黏度，之后4 800 r/min离心15 min去除菌体，上清液加入2倍体积的95%乙醇沉淀，4 ℃放置24 h后离心取沉淀，60 ℃烘干称量。
多糖采用苯酚-硫酸法测定[7]。
黏度使用NDJ8S黏度计进行测定。
1.3 培养基组分的单因素试验设计主要考察不同碳源、氮源及其浓度、L谷氨酸浓度、金属离子种类及浓度对γPGA产量的影响。
1.4 响应面试验设计1.4.1 PlackettBurman 设计。
根据单因素试验的结果，采用Minitab 15.0 软件中N=6的PlackettBurman设计对培养基中的蔗糖、大豆蛋白胨、L谷氨酸、KH2PO4 、无水CaCl2和NaCl这6种不同组分的重要性进行考察，以γPGA（g/L）产量作为响应值，各因素水平见表1。
1.4.2 最陡爬坡试验设计。
根据PlackettBurman试验设计的结果进行主效应分析。
以各显著因素的正负效应确定试验的最陡爬坡路径以快速逼近最佳区域。
γPGA产量（g/L）最高的处理，即为响应面分析的中心点。
表1 PlackettBurman试验各因素水平因素g/L编码代号水平-1+1蔗糖X110.050.0大豆蛋白胨X21.06.0L-谷氨酸X310.050.0KH2PO4X40.10.5无水CaCl2X50.10.5NaClX604.01.4.3 响应面分析。
PlaekettBurman试验确定了影响γPGA产量的主要因素，最陡爬坡试验确定接近响应值区域显著因素的浓度，利用DesignExpert 8.0 软件进行BoxBehnken的中心组合试验设计，采用响应面法在3因素3水平上对γPGA的液态发酵培养基成分进行优化，以γPGA产量（ g/L）为响应值，试验设计见表2。
表2 BoxBenhnken试验因素水平因素g/L水平-10+1蔗糖25.03035.0L谷氨酸35.04045.0NaCl2.533.51.5 发酵条件的单因素优化主要考察不同发酵条件对γPGA产量的影响，发酵条件主要包括培养基的初始pH、培养温度、装液量和接种量，其各因素水平见表3。
表3 发酵条件因素与水平水平因素初始pH温度∥℃装液量∥%接种量∥%16.02810326.53220537.03730747.54140958.0-50-1.6 液态发酵过程中γPGA产量与黏度关系曲线在优化过的培养基中接种一定量的种子液，按照优化得到的发酵条件进行发酵，连续测定发酵过程中的γPGA产量和黏度。
2 结果与分析2.1 单因素试验2.1.1 碳源的选择。
由图2可知，相比于其他碳源，以蔗糖为碳源的培养基中γPGA的产量最高，其次为葡萄糖，效果最差的为柠檬酸。
GOTO等[8]发现以柠檬酸为碳源能够获得较高产量的γPGA，与该试验结果存在很大差异，这可能是由于缺少糖合成循环过程中的某种酶所造成的。
因此，选择蔗糖作为发酵培养基的碳源。
图2 不同碳源对γPGA产量的影响2.1.2 氮源的选择。
氮源可分为有机氮源和无机氮源两大类，由图3可知，该枯草芽孢杆菌N2对有机氮源的利用明显优于无机氮源，且有机氮源中对大豆蛋白胨的利用率最佳。
其他研究结果也存在对无机氮源利用率较好的枯草芽孢杆菌，如以NH4Cl作为Bacillus subtilis TAM4发酵的氮源，其γPGA产量为22.1 g/L[9]。
在后续试验中选用大豆蛋白胨作为发酵培养基的氮源。
图3 不同氮源对γPGA产量的影响2.1.3 蔗糖浓度的选择。
由图4可知，随着蔗糖浓度的升高，γPGA的产量增加，而蔗糖的转化率随之变小。
当蔗糖浓度小于30.0 g/L时，虽然蔗糖转化率大于80%，但γPGA的产量较低;当蔗糖浓度大于30.0 g/L时，蔗糖的转化率接近或小于50%，蔗糖没有充分利用。
因此选择蔗糖浓度为30.0 g/L，此时蔗糖的转化率为72.6%，γPGA的产量为11.9 g/L。
图4 蔗糖浓度对γPGA产量的影响2.1.4 大豆蛋白胨浓度的选择。
由图5可知，随着大豆蛋白胨浓度的增加，γPGA产量明显增加，浓度达到4.0 g/L时，其产量达到最大值，随着大豆蛋白胨浓度的进一步增加，γPGA的产量反而有所下降。
因此，大豆蛋白胨的最佳浓度为4.0 g/L。
图5 大豆蛋白胨浓度对γPGA产量的影响2.1.5 L谷氨酸浓度的选择。
有些菌体可以自身合成L谷氨酸，而有些菌体却要通过摄取外界添加的L谷氨酸作为合成γPGA的前体物质。
由图6可知，培养基中不添加L谷氨酸时也能够生成γPGA，且浓度增加产量增大，但当L谷氨酸浓度到达40.0 g/L后再增加时，γPGA的产量虽然仍增加，但增加的量并不显著，一定程度上造成L谷氨酸的浪费。
同时发现γPGA产量的增加量与L谷氨酸的添加量不成正比，这表明添加的L谷氨酸并没有全部用来合成γPGA，可能更多的是作为一种诱导物，促使枯草芽孢杆菌N2产生γPGA。
因此选取L谷氨酸的浓度为40.0 g/L。
图6 L谷氨酸浓度对γPGA产量的影响2.1.6 金属离子的选择。
金属离子可通过影响合成过程中酶的活性影响γPGA产量。
原始培养基中包含有K+ 和Mg2+，在只含有K+的培养基发酵产得的γPGA产量为12.5 g/L，而在只含有Mg2+的培养基发酵获得的γPGA含量为3.3 g/L。