包涵体

实验室用的是低浓度的变性剂—2M尿素在 50mM Tris pH8.0，1mM EDTA中洗涤和用温 和去垢剂1% TritonX-100洗涤去除膜碎片和膜 蛋白。

4 、溶解 变性蛋白只有空间构象的破坏，一般认为蛋白质 变性本质是次级键、二硫键的破坏，并不涉及一级 结构的变化。包涵体的溶解主要任务是拆开错配的 二硫键和次级键 。

根据不同用途，采用相应溶剂溶解包涵体。 ①如用于免疫注射，用1.5倍沉淀体积的PH8.0， 8M尿素溶解，并于4℃保存。 ②如用于纯化，用2倍沉淀体积的PH8.0的PBS， 2%SKL（十二烷基肌氨酸钠）孵育过夜，溶解 包涵体沉淀，10000rpm，7min离心，收集上清， 4℃保存。
5、复性
包涵体的复性与重折叠的主要任务是： 将多肽链中被拆开的游离巯基重新折叠 通过次级键的形成使蛋白质复性

复性中常采用的方法有：




稀释复性：直接加入水或缓冲液，放置过夜，缺点是体积增加较 大，变性剂稀释速度太快，不易控制。 透析复性：好处是不增加体积，通过逐渐降低外透液浓度来控制 变性剂去除速度，有人称易形成沉淀，且不适合大规模操作，无 法应用到生产规模。 超滤复性：在生产中较多的使用，规模较大，易于对透析速度进 行控制，缺点是不适合样品量较少的情况，且有些蛋白可能在超 滤过程中不可逆的变性。 柱上复性：是最近研究较多并成功的在生产中应用的一种复性方 法，如华北制药的G-CSF复性据说是通过柱上复性进行的。常用 于复性的层析方法有SEC、HIC等。

变性作用是蛋白质受物理或化学因素的影响，改变其 分子内部结构和性质的作用。一般认为蛋白质的二级 结构和三级结构有了改变或遭到破坏，都是变性的结 果。能使蛋白质变性的化学方法有加强酸，强碱，重 金属盐，尿素，乙醇，丙酮等；能使蛋白质变性的物 理方法有加热，紫外线照射，剧烈振荡等。 重金属盐 使蛋白质变性，是因为重金属阳离子可以和蛋白质中 游离的羧基形成不溶性的盐，在变性过程中有化学键 的断裂和生成，因此是一个化学变化。

也可用低浓度的盐酸胍或尿素/中性去垢剂 /EDTA/还原剂等洗去包涵体表面吸附的大部 分不溶性杂蛋白。洗涤液pH以与工程菌生理 条件相近为宜，使用的还原剂为0.1-5mM。 EDTA为0.1-0.3 mM。去垢剂如Triton X-100、 脱氧胆酸盐和低浓度的变性剂如尿素充分洗涤 去除杂质，这一步很重要，因为大肠杆菌外膜 蛋白Omp T(37 KDa)在4-8mol/L尿素中具有蛋 白水解酶活性，在包涵体的溶解和复性过程中 可导致重组蛋白质的降解。

尿素、乙醇、丙酮等，它们可以提供自己的羟 基或羰基上的氢或氧去形成氢键，从而破坏了 蛋白质中原有的氢键，使蛋白质变性。但氢键 不是化学键，因此在变化过程中没有化学键的 断裂和生成，所以是一个物理变化。 加热、 紫外线照射，剧烈振荡等物理方法使蛋白质变 性，主要是破坏蛋白质分子中的氢键，在变化 过程中也没有化学键的断裂和生成，没有新物 质尘成，因此是物理变化。
三、包涵体表达的有利/有害因素：
1、可溶性蛋白在细胞内容易受到蛋白酶的攻击，包 涵体表达可以避免蛋白酶对外源蛋白的降解。 2、降低了胞内外源蛋白的浓度，有利于表达量的提 高。 3、包涵体中杂蛋白含量较低，且只需要简单的低速 离心就可以与可溶性蛋白分离，有利于分离纯化。 4、对机械搅拌和超声破碎不敏感，易于破壁，并与 细胞膜碎片分离。

另外，对于含有半胱氨酸的蛋白质，分离的包 涵体中通常含有一些链间形成的二硫键和链内 的非活性二硫键。还需加入还原剂，如巯基乙 醇、二硫苏糖醇（DTT）、二硫赤藓糖醇、半 胱氨酸。对于目标蛋白没有二硫键某些包涵体 的增溶，有时还原剂的使用也是必要的，可能 由于含二硫键的杂蛋白影响了包涵体的溶解。
对于含有半胱氨酸的蛋白质，分离的包涵体中通常 含有一些链间形成的二硫键和链内的非活性二硫键。还 需加入还原剂，如巯基乙醇、二硫基苏糖醇（DTT）、 二硫赤藓糖醇、半胱氨酸。还原剂的使用浓度一般是 50-100mM 2-BME或DTT，也有文献使用5mM浓度。 在较粗放的条件下，可以使用5ml/l的浓度。还原剂的使 用浓度与蛋白二硫键的数目无关，而有些没有二硫键的 蛋白加不加还原剂无影响，如牛生长激素包涵体的增溶。 对于目标蛋白没有二硫键某些包涵体的增溶，有时还原 剂的使用也是必要的，可能由于含二硫键的杂蛋白影响 了包涵体的溶解。



2 、重组蛋白的氨基酸组成：一般说含硫 氨基酸越多越易形成包涵体，而脯氨酸的含量明 显与包涵体的形成呈正相关。 3 、重组蛋白所处的环境：发酵温度高或 胞内pH接近蛋白的等电点时容易形成包涵体。 4 、重组蛋白是大肠杆菌的异源蛋白，由 于缺乏真核生物中翻译后修饰所需酶类和辅助因 子，如折叠酶和分子伴侣等，致使中间体大量积 累，容易形成包涵体沉淀。

2 、分离 5000-20000g15min离心，可使大多数包涵体沉 淀，与可溶性蛋白分离。

3 、洗涤 包涵体沉淀中主要含有重组蛋白，但也含有一些细菌成 分，如一些外膜蛋白、质粒ＤＮＡ和其它杂质。由于这 些脂体及部分破碎的细胞膜及膜蛋白与包涵体粘连在一 起，所以在溶解包涵体之前要先洗涤。洗涤常用低浓度 的中性去垢剂，如Tween、Triton、Lubel和 NP40等加 EDTA和还原剂二硫苏糖醇（DTT）、β-巯基乙醇等， 因去垢剂洗涤能力随溶液离子强度升高而加强，在洗涤 包涵体时可加50 mM NaCL。这样提取的包涵体纯度至 少可达50%以上，而且可保持原结构。
蛋白质沉淀以及溶解的包涵体可选用多种色谱 法纯化等优点，故目前使用比较广泛。 盐酸胍 成本高、在酸性条件下易产生沉淀、复性后除去 可能造成大量蛋白质沉淀和对蛋白质离子交换色 谱有干扰等缺点。 也可用去垢剂，如SDS、正十六烷基三甲 基铵氯化物等，可以破坏蛋白内的疏水键，可以 增溶几乎所有的蛋白。问题是由于SDS无法彻 底的去除而不允许在制药过程中使用。
用超声波破碎法在处理过程会产生大量的热， 应采取相应降温措施，时间以及超声间歇时间、 超声时间可以自己调整，超声完全了菌液应该变 清亮，如果不放心可以在显微镜下观察。对超声 波及热敏感的蛋白和核酸应慎用。 此外还有高速组织捣碎法，玻璃匀浆器匀 浆 ，反复冻融法 ，化学处理法 。
无论用哪一种方法破碎组织细胞，都会使细胞内蛋 白质或核酸水解酶释放到溶液中，使大分子生物降解， 导致天然物质量的减少，加入二异丙基氟磷酸（DFP） 可以抑制或减慢自溶作用；加入碘乙酸可以抑制那些活 性中心需要有疏基的蛋白水解酶的活性，加入苯甲磺酰 氟化物（PMSF）也能清除蛋白水解酶活力，但不是全 部，而且应该在破碎的同时多加几次；另外，还可通过 选择pH、温度或离子强度等，使这些条件都要适合于 目的物质的提取。
一般用强的变性剂如尿素（6-8M）、盐酸胍 （GdnHCl 6M），通过离子间的相互作用，打 断包涵体蛋白质分子内和分子间的各种化学键， 使多肽伸展 ,达到增溶蛋白的效果。一般来讲， 盐酸胍优于尿素，因为盐酸胍是较尿素强的变 性剂，它能使尿素不能溶解的包涵体溶解，而 且尿素分解的异氰酸盐能导致多肽链的自由氨 基甲酰化，特别是在碱性pH值下长期保温时。 但用尿素溶解具有不电离，呈中性，成本低， 蛋白质复性后除去不会造成大量
包涵体的纯化
一、包涵体的定义


包涵体是指细菌表达的蛋白在细胞内凝集，形成 无活性的固体颗粒。一般含有50%以上的重组蛋白， 其余为核糖体元件、RNA聚合酶、内毒素、外膜蛋白 ompC、ompF和ompA等，环状或缺口的质粒DNA， 以及脂体、脂多糖等。 大小为0.5-1um，具有很高的密度（约1.3mg/ml）， 无定形，呈非水溶性，只溶于变性剂如尿素、盐酸胍 等。

5、以包涵体形式表达的重组蛋白丧失了原有的生物 活性，必须通过有效的变性复性操作，才能回收得到 具有正确空间构象（因而具有生物活性）的目标蛋白， 体外复性蛋白质的成功率相当低，一般不超过30%。
四、包涵体破菌、分离、洗涤、溶解

1 、破菌 基因工程菌发酵液，经离心浓缩后，可用： 机械破碎、超声破碎。单纯超声破碎，在小规 模下且菌量较少的情况下效果较好，由于能量 传递和局部产热等原因，很难用于大体积细胞 悬液的破碎，这样部分未破碎细胞与包涵体混 在一起，给后期纯化带来困难。因此，在较大 规模纯化时先用溶菌酶破碎细菌的细胞膜，再 结合超声破碎方法，可显著提高包涵体的纯度 和回收率。
包涵体的复性是一个复杂的过程，我们公 司生产的融合蛋白用作抗原免疫兔子，因此不需 要作复性处理。
复性：通过缓慢去除变性剂使目标蛋白从变性的 完全伸展状态恢复到正常的折叠结构，同时去除 还原剂使二硫键正常形成。一般在尿素浓度4M 左右时复性过程开始，到2M左右时结束。对于 盐酸胍而言，可以从4M开始，到1.5M 时复性过 程已经结束。


5 、蛋白质在合成之后，于中性pH或接近中性pH 的环境下，其本身固有的溶解度对于包涵体的形成比较 关键，即是说，有的表达产率很高，如Aspartase和 Cyanase,表达产率达菌体蛋白的30%,也不形成包涵体， 而以可溶形式出现。 6 、在细菌分泌的某个阶段，蛋白质分子间的离子 键、疏水键或共价键等化学作用导致了包涵体的形成。
二、包涵体形成的原因

包涵体形成的原因主要因为在重组蛋白的表达过 程中缺乏某些蛋白质折叠的辅助因子，或环境不适， 无法形成正确的次级键等原因形成的。具体的原因可 能有以下几点：

1 、基因工程菌的表达产率过高，超过了细菌正常 的代谢水平，由于细菌的δ因子的蛋白水解能力达到饱 和，使之表达产物积累起来。研究发现在低表达时很少 形成包涵体，表达量越高越容易形成包涵体。原因可能 是合成速度太快，以至于没有足够的时间进行折叠，二 硫键不能正确的配对，过多的蛋白间的非特异性结合， 蛋白质无法达到足够的溶解度等。