包涵体复性(课堂参照)
包涵体的纯化和复性总结--最全的前人经验
<包涵体的纯化和复性总结二、包涵体的洗涤1、包涵体的洗涤问题通常的洗涤方法一般是洗不干净的，我以前是这么做的，先把包涵体用6M盐酸胍溶解充分，过滤除去未溶解的物质，注意留样跑电泳，然后用水稀释到4M,离心把沉淀和上清分别跑电泳，如此类推可以一直稀释到合适的浓度，你可以找到一个合适去除杂质的办法，其实这就是梯度沉淀的方法，我觉得比通常的直接洗脱效果好。
包涵体一般难溶解，所以你要注意未溶解的部分，你可以跑电泳对比，因为有时候难溶解的就是你的目标蛋白，所以每次处理都要把上清和沉淀跑电泳对比，免得把目标蛋白弄丢了。
此外刚处理完的包涵体好溶解。
冷冻后难溶解，溶解也需要长点时间，也需要大量的溶剂。
如果说是不少不溶解的不是你要的，那就不用管了。
2、如何得到比较纯的包涵体对于包涵体的纯化，包涵体的前处理是很重要的。
包涵体中主要含有重组蛋白,但也含有一些细菌成分,如一些外膜蛋白、质粒ＤＮＡ和其它杂质。
洗涤常用1%以下的中性去垢剂，如Tween、Triton、Lubel和NP40等加EDTA和还原剂2-巯基苏糖醇（DTT）、β-巯基乙醇等反复多次进行，因去垢剂洗涤能力随溶液离子强度升高而加强，在洗涤包涵体时可加50 mM NaCL。
这样提取的包涵体纯度至少可达50%以上，而且可保持元结构。
也可用低浓度的盐酸胍或尿素/中性去垢剂/EDTA/还原剂等洗去包涵体表面吸附的大部分不溶性杂蛋白。
洗涤液pH以与工程菌生理条件相近为宜，使用的还原剂为0.1-5mM。
EDTA为0.1-0.3 mM。
去垢剂如Triton X-100、脱氧胆酸盐和低浓度的变性剂如尿素充分洗涤去除杂质,这一步很重要,因为大肠杆菌外膜蛋白Omp T(37 KDa)在4-8mol/L尿素中具有蛋白水解酶活性,在包涵体的溶解和复性过程中可导致重组蛋白质的降解。
对于尿素和盐酸胍的选择：尿素和盐酸胍属中强度变性剂，易经透析和超滤除去。
它们对包涵体氢键有较强的可逆性变性作用，所需浓度尿素8-10M，盐酸胍6-8M。
蛋白质、包涵体复性
目录一、脲和盐酸胍在包涵体蛋白质纯化中的作用二、包涵体变复性三、包涵体洗涤纯化——7~10四、包涵体提出、纯化和复性一、二、包涵体变复性包涵体是指细菌表达的蛋白在细胞内凝集，形成无活性的固体颗粒。
一般含有50%以上的重组蛋白，其余为核糖体元件、RNA聚合酶、内毒素、外膜蛋白ompC、ompF和ompA等，环状或缺口的质粒DNA，以及脂体、脂多糖等。
基本信息中文名称包涵体变复性复性方法稀释复性原因基因工程菌的表达产率过高包涵体变性破菌洗涤溶解目录1包涵体2包涵体变性3包涵体复性包涵体是指细菌表达的蛋白在细胞内凝集，形成无活性的固体颗粒。
一般含有50%以上的重组蛋白，其余为核糖体元件、RNA聚合酶、内毒素、外膜蛋白ompC、ompF和ompA等，环状或缺口的质粒DNA，以及脂体、脂多糖等，大小为0.5-1μm，具有很高的密度(约1.3mg/mL)，无定形，呈非水溶性，只溶于变性剂如尿素、盐酸胍等。
NMR等新技术的应用表明包涵体具有一定量的二级结构，他们可能在复性的启动阶段中具有一定的作用。
包涵体的形成原因主要因为在重组蛋白的表达过程中缺乏某些蛋白质折叠的辅助因子，或环境不适，无法形成正确的次级键等原因形成的。
1.基因工程菌的表达产率过高，超过了细菌正常的代谢水平，由于细菌的δ因子的蛋白水解能力达到饱和，使之表达产物积累起来。
研究发现在低表达时很少形成包涵体，表达量越高越容易形成包涵体。
原因可能是合成速度太快，以至于没有足够的时间进行折叠，二硫键不能正确的配对，过多的蛋白间的非特异性结合，蛋白质无法达到足够的溶解度等。
2.重组蛋白的氨基酸组成:一般说含硫氨基酸越多越易形成包涵体，而脯氨酸的含量明显与包涵体的形成呈正相关。
3.重组蛋白所处的环境:发酵温度高或胞内pH接近蛋白的等电点时容易形成包涵体。
4.重组蛋白是大肠杆菌的异源蛋白，由于缺乏真核生物中翻译后修饰所需酶类和辅助因子，如折叠酶和分子伴侣等，致使中间体大量积累，容易形成包涵体沉淀。
包涵体蛋白质复性纯化ppt课件
从中间体转变为天然态的过程比较缓慢。当 溶液中离子强度或变性剂浓度很低，又无其它 辅助手段存在时，聚集趋势占主导地位，导致 蛋白质的自发复性效率极低。
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3. 超滤复性：选择合适载留分子量的膜，允许 变性剂通过膜而蛋白质通不过。在生产中较多的 使用，规模较大，缺点是不适合样品量较少的情 况，且有些蛋白可能在超滤过程中不可逆的变性 （蛋白聚集于膜上）。
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↓ 溶解包涵体 (Dissolve inclusion body)
↓ 蛋白质产物的构象复原等。 (Recovery of target protein conformation)
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复性目的
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复性：通过缓慢去除变性剂（避免折叠中 间体重新聚集）使目标蛋白从变性的完全伸展 状态（？）恢复到正常的折叠结构，同时去除 还原剂使二硫键正常形成。一般在尿素浓度 4M左右时复性过程开始，到2M左右时结束。 对于盐酸胍而言，可以从4M开始，到1.5M 时 复性过程已经结束。
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包涵体复性
包涵体复性
结合液80mm 300mm
Tris: 0.4 0.1 0.1
咪唑：0.1 0.4 1.5
氯化钠： 2 0.5 0.5
尿素：9.6g 2.4g 2.4g
水：补足至20mL 补足至5mL 补足至5mL
1.菌体用裂解液重悬，加入溶菌酶，冰上30min或者时间更长一点。
2.破碎，离心，收集沉淀。
加入包涵体溶解液，10min左右包涵体会溶解。
在冰上进行，可放在摇床上。
3.处理镍柱，放出酒精，水洗2遍，结合液3ml平衡2遍。
4.将包涵体蛋白加入柱子中，结合1小时左右。
5.结合液冲洗柱子。
6.80mm 洗脱蛋白
7.300mm洗脱蛋白，收集2ml洗脱蛋白。
8.准备2个超滤管，分别加入1ml洗脱蛋白液，再加入不含尿素的PBS （可加入EDTA等），离心。
再次加入PBS，离心，收集大约2ml的液体分装保存。
重组蛋白基础知识介绍
一，重组蛋白分类：
1，上清：His上清，His-Sumo上清，GST上清,
2，包涵体复性：His包涵体复性，GST包涵体复性
3，包涵体：His包涵体，GST包涵体
二，重组蛋白缓冲体系：
1，His上清NTA-0+500mM咪唑
2，His-Sumo上清NTA-0+500mM咪唑
3，GST上清1*PBS（包含10mMGST）
4，His 包涵体复性TE缓冲液，PBS缓冲液，1M或2M尿素
5，GST包涵体复性TE缓冲液，PBS缓冲液，1M或2M尿素
6，His包涵体6M盐酸胍，8M尿素,
7，GST包涵体6M盐酸胍，8M尿素
三，各种稀释液配方：
TE缓冲液（10mM Tris 5mM EDTA）
NTA-0 ( Tris,NaCl ,10% 甘油)
四，基础知识介绍：
1，His上清与His-Sumo上清的区别：
His上清是用pET28a载体表达的上清蛋白，上面只有一个His标签，His-Sumo上清是pET28a-Sumo载体表达的上清蛋白，Sumo蛋白上面有His标签。
Sumo是一种分子伴侣，大约18KD，可以与小分子量的蛋白相连接，增加蛋白分子量，增加免疫原性。
2，乳化稀释液
一般来说是重组蛋白用哪种缓冲体系，乳化稀释液就用那种稀释液。
NTA-0可以换成1*PBS缓冲液，His包涵体或GST包涵体缓冲液是6M盐酸胍用3M盐酸胍稀释，His包涵体或GST包涵体缓冲液是8M尿素用4M尿素稀释。
影响包涵体复性的因素
影响包涵体复性的因素
包含体复性是指信息在不同的文本或媒体中传递和保持一致的程度。
影响包含体复性的因素有很多，以下是一些常见的因素：
1. 内容本身：信息的准确性、详细性和一致性会影响包含体复性。
如果内容存在错误、矛盾或缺乏细节，那么在不同的文本中传递时就会出现不一致。
2. 传播媒体：不同的媒体平台和渠道对信息的传达方式和格式有不同的限制和要求。
这可能导致信息在传播过程中的改变和失真，降低了包含体复性。
3. 翻译和转述：当信息从一种语言或媒体转换为另一种语言或媒体时，可能会出现误解、漏解或误传。
这会影响信息的一致性和包含体复性。
4. 个人观点和偏见：在信息传递过程中，个人的观点、态度和偏见可能会对信息的解释和表达产生影响。
这可能导致信息在不同文本中的差异。
5. 时间和环境因素：随着时间的推移和环境的变化，信息的背景和语境也可能发生变化。
这可能导致信息在不同文本中的表达和理解发生变化，降低了包含体复性。
综上所述，包含体复性受多种因素的影响，包括内容本身、传播媒体、翻译和转述、个人观点和偏见，以及时间和环境因素。
理解这些因素可以帮助我们更好地
识别和解决信息一致性的问题。
包涵体的纯化和复性总结--最全的前人经验
包涵体的纯化和复性总结二、包涵体的洗涤1、包涵体的洗涤问题通常的洗涤方法一般是洗不干净的，我以前是这么做的，先把包涵体用6M盐酸胍溶解充分，过滤除去未溶解的物质，注意留样跑电泳，然后用水稀释到4M,离心把沉淀和上清分别跑电泳，如此类推可以一直稀释到合适的浓度，你可以找到一个合适去除杂质的办法，其实这就是梯度沉淀的方法，我觉得比通常的直接洗脱效果好。
包涵体一般难溶解，所以你要注意未溶解的部分，你可以跑电泳对比，因为有时候难溶解的就是你的目标蛋白，所以每次处理都要把上清和沉淀跑电泳对比，免得把目标蛋白弄丢了。
此外刚处理完的包涵体好溶解。
冷冻后难溶解，溶解也需要长点时间，也需要大量的溶剂。
如果说是不少不溶解的不是你要的，那就不用管了。
2、如何得到比较纯的包涵体对于包涵体的纯化，包涵体的前处理是很重要的。
包涵体中主要含有重组蛋白,但也含有一些细菌成分,如一些外膜蛋白、质粒ＤＮＡ和其它杂质。
洗涤常用1%以下的中性去垢剂，如Tween、Triton、Lubel和NP40等加EDTA 和还原剂2-巯基苏糖醇（DTT）、β-巯基乙醇等反复多次进行，因去垢剂洗涤能力随溶液离子强度升高而加强，在洗涤包涵体时可加50 mM NaCL。
这样提取的包涵体纯度至少可达50%以上，而且可保持元结构。
也可用低浓度的盐酸胍或尿素/中性去垢剂/EDTA/还原剂等洗去包涵体表面吸附的大部分不溶性杂蛋白。
洗涤液pH以与工程菌生理条件相近为宜，使用的还原剂为0.1-5mM。
EDTA为0.1-0.3 mM。
去垢剂如Triton X-100、脱氧胆酸盐和低浓度的变性剂如尿素充分洗涤去除杂质,这一步很重要,因为大肠杆菌外膜蛋白Omp T(37 KDa)在4-8mol/L尿素中具有蛋白水解酶活性,在包涵体的溶解和复性过程中可导致重组蛋白质的降解。
对于尿素和盐酸胍的选择：尿素和盐酸胍属中强度变性剂，易经透析和超滤除去。
它们对包涵体氢键有较强的可逆性变性作用，所需浓度尿素8-10M，盐酸胍6-8M。
包涵体变性、复性及纯化
一、菌体的裂解1、怎样裂解细菌？细胞的破碎方法1.高速组织捣碎：将材料配成稀糊状液，放置于筒内约1/3体积，盖紧筒盖，将调速器先拨至最慢处，开动开关后，逐步加速至所需速度。
此法适用于动物内脏组织、植物肉质种子等。
2.玻璃匀浆器匀浆：先将剪碎的组织置于管中，再套入研杆来回研磨，上下移动，即可将细胞研碎，此法细胞破碎程度比高速组织捣碎机为高，适用于量少和动物脏器组织。
3.超声波处理法：用一定功率的超声波处理细胞悬液，使细胞急剧震荡破裂，此法多适用于微生物材料，用大肠杆菌制备各种酶，常选用50-100毫克菌体/毫升浓度，在1KG至10KG 频率下处理10-15分钟，此法的缺点是在处理过程会产生大量的热，应采取相应降温措施，时间以及超声间歇时间、超声时间可以自己调整，超声完全了菌液应该变清亮，如果不放心可以在显微镜下观察。
对超声波及热敏感的蛋白和核酸应慎用。
4.反复冻融法：将细胞在-20度以下冰冻，室温融解，反复几次，由于细胞内冰粒形成和剩余细胞液的盐浓度增高引起溶胀，使细胞结构破碎。
5.化学处理法：有些动物细胞，例如肿瘤细胞可采用十二烷基磺酸钠（SDS）、去氧胆酸钠等细胞膜破坏，细菌细胞壁较厚，可采用溶菌酶处理效果更好，我用的浓度一般为1mg/ml。
无论用哪一种方法破碎组织细胞，都会使细胞内蛋白质或核酸水解酶释放到溶液中，使大分子生物降解，导致天然物质量的减少，加入二异丙基氟磷酸（DFP）可以抑制或减慢自溶作用；加入碘乙酸可以抑制那些活性中心需要有疏基的蛋白水解酶的活性，加入苯甲磺酰氟化物（PMSF）也能清除蛋白水解酶活力，但不是全部，而且应该在破碎的同时多加几次；另外，还可通过选择pH、温度或离子强度等，使这些条件都要适合于目的物质的提取。
这是标准配方:裂解液：50mM Tris-HCl(pH8.5~9.0), 2mM EDTA, 100mM NaCl, 0.5% Triton X-100, 1mg /ml溶菌酶。
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我用透析法复性蛋白,但出现了好多沉淀,后面我要用Ni柱来纯化,我现在不知道复性后怎么
处理?把沉淀弃掉吗?谁来帮帮我吧!
我用透析法复性蛋白,但出现了好多沉淀,后面我要用Ni柱来纯化,我现在不知道复性后怎么
处理?把沉淀弃掉吗?谁来帮帮我吧!
首先，可以再多加一点透析液看看能否将之溶掉，这样可以减少由于免疫共沉淀的原因而与杂质一起沉淀的蛋白。
再次如果你的蛋白已经复性，并且能很好的溶解的话，那么沉淀要么是杂质，要么是不能复性的蛋白，我认为可以离心去除。
出现絮状沉淀是很正常的现象，因为透析本身就是一个复性的过程，那些出现絮状的沉淀就是一些不能够复性成为天然结构的一些目的蛋白和一些杂蛋白，而这些都是我们所不需要的。
所以说出现絮状沉淀是正常的也是我们希望看到的。
至于出现沉淀的原因不外乎条件变化太剧烈了，建议不要让透析的条件变化太剧烈了，主要是PH的浓度的变化和样品中一些其他东西如尿素的浓度变化。
如果楼主透析样品中出现太多的沉淀，甚至于跑胶中基本没有带了，那么建议楼主换一种透析液来用，如用TGE也就是传说中的万金油来试试，我一直用的是这种透析液，效果很不错。
TGE配法如下：
50mM Tris
0.5mM EDTA
50mM Nacl
5%或10％甘油
如果有条件加入1％的甘氨酸或精氨酸和谷胱甘肽会更好些。
沉淀可以拿来重溶，但是重溶的可行性不大，也就是重新溶解的可能性不大
谢谢您们的回答,我再试试.我还想问一下是先过柱后复性还是先复性后过柱那种方法好?我查资料怎么都不一样.还有我纯化的蛋白浓度比较底,能不能浓缩一下,我后面作免疫动物实验,怎样保存蛋白较好?包涵体能放多久不出现问题?
如透析液用TGE的话,一次透析,还是也要分步,要不要调PH或是浓度?
046 wrote:
谢谢您们的回答,我再试试.我还想问一下是先过柱后复性还是先复性后过柱那种方法好?我查资料怎么都不一样.还有我纯化的蛋白浓度比较底,能不能浓缩一下,我后面作免疫动物实验,怎样保存蛋白较好?包涵体能放多久不出现问题?
先过柱後复性。
蛋白浓度较低可以浓缩一下，浓缩方法有很多，简单一点的可以用PEG包埋，就是将蛋白
溶液装在透析袋中，然后覆盖上一些PEG，10～30分钟，根据个体情况而定。
蛋白质的保存，当然最好的是冻干保存，但是如果放置时间不会太长，比如不会超过半年，
完全可以放在-80度保存。
包涵体能放置多久？这个问题不知道，包涵体又不是成品蛋白，放置那么久没什么用。
046 wrote:
如透析液用TGE的话,一次透析,还是也要分步,要不要调PH或是浓度?
要用TGE反复透析，一般8小时左右换一次透析液，透析三次左右。
PH值要调，一般透析液的PH值要根据等电点来确定。
最好距离等电点稍微远点，否则极易产生沉淀。
2.不知你的0 M尿素缓冲液中是否有NaCl等盐类，一些蛋白遇盐易沉淀！解决方法去掉一些盐类成分。
如将PBS改成PB，将其中的NaCl及KCl去掉，改为只含有两种磷酸盐的环境！此其一！
另外，蛋白复性时，如果本身折叠的不好，在最后变性剂从有到无时也是容易析出的。
所以前期一定要保证复性环境平缓，不能太剧烈。
可适当加入一些小分子物质（如L-Arg），或加入氧化还原体系等。
我的缓冲体系是50 mMTris,5% 甘油，1 mMEDTA,pH值7.9
措施：提高pH值为10，尝试稀释复性
3. 1. 沉淀出现的问题可以多看看文献，都有解释。
楼上正解，水化层和电荷问题很大。
2. 更关键的，复性是正确构象形成过程，中间熔球态疏水区外展，疏水聚沉
3. 现在都通过添加外源物起到辅助复性，这个说法有待商榷，应该叫做提高复性效率，毕竟要辅助复性，分子伴侣可能是必需的
4. 有沉淀可能并不是坏事。
最可悲的是“复性”后蛋白都是可溶的，但没有相应的生物活性。
这个“复性”是假象，可溶并不一定是复性成功，SDS-PAGE检测不出来而已。
5. 复性问题是个大坑，不太陷得太深，见好就收。
4.酶活测定
1. 2×反应基质（A液）：2ml Triton X-100，0.5g阿拉伯胶溶于450ml缓冲液。
2. 对硝基苯丁酸酯溶液（p-NPB）：3mg/ml,用异丙醇溶解。
3. 不同pH的缓冲液：其中3.0~6.0 用50mmol/L Na2HPO4-柠檬酸缓冲液；7.0,8.0 用50 mmol/L Tris-HCl缓冲液；9.0~11.0用50 mmol/L Gly-NaOH缓冲液。
反应采用1 ml体系：取350 μl ddH2O、500 μl A液和100 μl底物(p-NPB)在一定温度下恒温水浴温育5 min，然后加入50µl待测酶液，在该温度下恒温反应10min，加入1ml 95%乙醇终止反应，测定A410。
4.透析
(2)透析复性液的配置
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融合蛋白的复性及功能检测
复性液I:100mmol/LTris一HCI(pHS.O)!0.15mol几NaCI!1mmol/LED认!6mol/L 尿素
复性液n:复性液卜0.5mol/LL一Arg
复性液111:复性液I+0.1mmol/LGSSG/0.5mmol/LGSH
复性液1V:复性液I+0.5mol/LL一Arg+0.1mmol/LGssG/0.5mmol/LGsH
复性液V:复性液I+0.5mol/LL一Arg+0.1mmol/LGsSG/o.smmol几GsH+Zmmol/L CaC12
步骤：
(l)取保存在-20e冰箱中的纯化蛋白,加入DTT至终浓度为25mmol/L,
室温孵育2h"
(2)用含有8mol/L的尿素的Elutionbuffe:将蛋白稀释至所需浓度,取变性
蛋白2ml分别加入透析袋中开始透析
(3)将透析袋置于100mL透析液中,4OC透析复性,每3h换一次透析液,
共换5次,通过缓慢降低透析外液中的尿素浓度(4mol/L一2mol/L),最后将透析
外液换为PBS液,更换2次,共透析巧ho
(4)透析完毕,取出溶液,4度下,1200Orpm,离心30min,吸取上清,将
上清置于-40度冰箱中备用"
(5)采用考马斯亮蓝法测定上清中复性蛋白的含量,计算复性产率"
硕士论文：中介蝮(Gloudius diusintermedius)神经毒素磷脂酶A2原核表达包涵体的复性及低温可溶表达研究。