包涵体蛋白复性的几种方法
包涵体表达的蛋白的复性
包涵体表达的蛋白的复性外源基因在大肠杆菌中的高表达常常导致包涵体的形成，虽然包涵体具有富集目标蛋白质、抗蛋白酶、对宿主毒性小等优点，但包涵体蛋白质的复性率一般都很低,而分子伴侣、低分子量添加物等在复性过程中的应用及新的复性方法的建立都大大提高了重组蛋白质复性产率。
一、包涵体：1.1包涵体的定义、组成与特性：包涵体是指细菌表达的蛋白在细胞内凝集，形成无活性的固体颗粒。
一般含有50%以上的重组蛋白，其余为核糖体元件、RNA聚合酶、内毒素、外膜蛋白ompC、ompF和ompA等，环状或缺口的质粒DNA，以及脂体、脂多糖等，大小为0.5-1um，具有很高的密度（约1.3mg/ml），无定形，呈非水溶性，只溶于变性剂如尿素、盐酸胍等。
NMR等新技术的应用表明包涵体具有一定量的二级结构，他们可能在复性的启动阶段中具有一定的作用。
[1]1.2包涵体的形成：主要因为在重组蛋白的表达过程中缺乏某些蛋白质折叠的辅助因子，或环境不适，无法形成正确的次级键等原因形成的。
1.2.1、基因工程菌的表达产率过高，超过了细菌正常的代谢水平，由于细菌的δ因子的蛋白水解能力达到饱和，使之表达产物积累起来。
研究发现在低表达时很少形成包涵体，表达量越高越容易形成包涵体。
原因可能是合成速度太快，以至于没有足够的时间进行折叠，二硫键不能正确的配对，过多的蛋白间的非特异性结合，蛋白质无法达到足够的溶解度等。
1.2.2、重组蛋白的氨基酸组成：一般说含硫氨基酸越多越易形成包涵体，而脯氨酸的含量明显与包涵体的形成呈正相关。
1.2.3、重组蛋白所处的环境：发酵温度高或胞内pH接近蛋白的等电点时容易形成包涵体。
1.2.4、重组蛋白是大肠杆菌的异源蛋白，由于缺乏真核生物中翻译后修饰所需酶类和辅助因子，如折叠酶和分子伴侣等，致使中间体大量积累，容易形成包涵体沉淀。
1.2.5、蛋白质在合成之后，于中性pH或接近中性pH的环境下，其本身固有的溶解度对于包涵体的形成比较关键，即是说，有的表达产率很高，如Aspartase和Cyanase,表达产率达菌体蛋白的30%,也不形成包涵体，而以可溶形式出现。
包涵体的复性总结
包涵体的复性总结关于包涵体的复性是一个令人头疼的问题,已经成为生物制药的瓶颈,包涵体的复性前期准备工作尤为重要,关于包涵体的处理一般包括这么几步:菌体的破碎、包涵体的洗涤、溶解、复性以及纯化,实验内容比较庞杂、繁琐。
一、菌体的裂解菌体的破碎方法很多:高速组织捣碎、玻璃匀浆器匀浆、超声波处理法、反复冻融法、化学处理法。
无论用哪一种方法破碎组织细胞,都会使细胞内蛋白质或核酸水解酶释放到溶液中,使大分子生物降解,导致天然物质量的减少,不同的菌体蛋白需要加入不同的抑制剂:二异丙基氟磷酸(DFP)可以抑制或减慢自溶作用;碘乙酸可以抑制那些活性中心需要有疏基的蛋白水解酶的活性,苯甲磺酰氟化物(PMSF)也能清除蛋白水解酶活力,但不是全部,而且应该在破碎的同时多加几次;另外,还可通过选择pH、温度或离子强度等,使用这些条件时都要适合于目的物质的提取。
在实验室研究多采用超声波处理法和匀浆器匀浆法。
二、包涵体的洗涤通常的洗涤方法一般是难以洗干净的,包涵体中主要含有重组蛋白,但也含有一些细菌成分,如一些外膜蛋白、质粒DNA和其它杂质。
洗涤常用1%以下的中性去垢剂,如Tween、Triton、Lubel和NP40等加EDTA反复多次进行,因去垢剂洗涤能力随溶液离子强度升高而加强,在洗涤包涵体时可加50 mM NaCL。
也可用低浓度的盐酸胍或尿素/中性去垢剂/EDTA/还原剂等洗去包涵体表面吸附的大部分不溶性杂蛋白。
洗涤液pH以与工程菌生理条件相近为宜。
根据不同的菌体选用与之相应的洗涤液,比如:2 M尿素+50mm Tris-HCl+0.2 mM NaCl +1%Triton x-100+2mmEDTA PH8.0,再用缓冲洗涤一次。
此外,刚处理完的包含体好溶解,冷冻后难溶解,且溶解时间和比例都会加大。
三、包涵体的溶解强的变性剂如尿素、盐酸胍,是通过离子间的相互作用,打断包涵体蛋白质分子内和分子间的各种化学键,使多肽伸展,SDS、正十六烷基三甲基铵氯化物等去垢剂,可以破坏蛋白内的疏水键,也可溶解一些包涵体蛋白质。
如何对包涵体蛋白进行表达与复性
如何对包涵体蛋白进行表达与复性包涵体即在某些生长条件下，在重组蛋白的表达过程中缺乏某些蛋白质折叠的辅助因子或环境不适，无法形成正确的次级键等原因形成的。
表达量越高越容易形成包涵体。
原因可能是合成速度太快，以至于没有足够的时间进行折叠，二硫键不能正确的配对，过多的蛋白间的非特异性结合，蛋白质无法达到足够的溶解度等。
关于包涵体的复性一直是生物制药的瓶颈，包涵体的处理一般包括这么几步：菌体的破碎、包涵体的洗涤、溶解、复性以及纯化。
一、包涵体蛋白的表达在平板上挑取单菌落，接种于含有氨苄青霉素和卡那霉素抗性的5 ml LB培养基中，37 ℃过夜培养，然后转接到100 ml LB 培养基中，37 ℃培养至A600 为0.4~0.6时，加入IPTG 至终浓度为0.5mmol/L 诱导3.5 h。
8000 r/min 离心5 min 收集菌体，加入10 ml 50 mmol/LTris-HCl，冰浴下超声波破碎后12000 r/min离心30 min收集沉淀。
二、包涵体的洗涤在包涵体中加入包涵体洗涤液：50 mmol/L Tris—HCl，1 mmol/L EDTA，50 mmol/LNaCl，w=0．5％TritonX-100，pH 8．0；，37℃振荡洗涤1～2 h，然后8 000 r/min 离心15 min，收集沉淀。
三、包涵体的溶解洗涤后的包涵体加入适量的(包涵体溶解液)：6 mol/L 尿素，50 mmol/L Tris—HCl，1 mmol/L EDTA，50mmol/L NaCl，10 mmol/L β-ME，pH 8．0(注：β-ME用时现加)，于磁力搅拌器上搅拌过夜，1000 r/min离心30 min，取上清即得包涵体溶解液。
四、包涵体的复性包涵体的复性目前常用的主要有两种方式：1，稀释溶液，但是操作的液体量大，蛋白稀释；2，透析，超滤或电渗透析去除变性剂。
1.包涵体的稀释复性设定不同的复性条件：蛋白质量浓度、尿素浓度、温度、氧化还原条件、加入Ttiton X-100与环糊精的量、复性时间等，使变性溶解的包涵体稀释复性，复性一定时间后取样测酶活性。
蛋白复性
包涵体的变性及复性1、用1×Binding Buffer作裂解液，超声波破碎后，获得的包涵体；2、包涵体用含0.3%SKL（十二烷基肌氨酸钠）的1×Binding Buffer溶解，室温静置至完全溶解；3、充分溶解后，，加入用1×Binding Buffer配制的0.2%PEG2000和0.1mM GSSG：1mM GSH，0.1mM Arg，5-10% Glycerol），最后用1×Binding Buffer稀释蛋白至原菌液体积，调整pH（具体值视蛋白情况定，避开pI），装入透析袋中；4、用20倍体积的1×Binding Buffer进行4℃透析复性，每2h换一次，6次换液后，离心收集蛋白液；5、按可溶性蛋白纯化，注意保持低温环境，防止蛋白降解。
注意：透析液中的添加剂的浓度要在实验中摸索，每种蛋白的要求可能不同。
复性过程的添加剂：1、共溶剂：如PEG6000-20000，据说可以可逆的修饰折叠中间体的疏水集团，此外由于阻止了蛋白质分子间的相互接触的机会，也可能对复性效率的提高起作用。
一般的使用浓度在0.1%左右，具体条件可根据实验条件确定。
2、二硫键异构酶（PDI）和脯氨酸异构酶（PPI）：PDI可以使错配的二硫键打开并重新组合，从而有利于恢复到正常的结构，此外在复性过程中蛋白质的脯氨酸两种构象间的转变需要较高能量，常常是复性过程中的限速步骤，而PPI的作用是促进两种构象间的转变，从而促进复性的进行。
3、分子伴侣，即热休克蛋白（HSP），是一种没有蛋白质特异性的促进折叠的蛋白因子，研究发现很多蛋白在缺乏分子伴侣时无法自己正确的折叠。
有人构建了与伴侣分子共同表达的菌株，据说效果不错。
不过在生产中还没有看到2和3的应用的例子。
4、0.4-0.6ML-Arg：成功的应用于很多蛋白如t-PA的复性中，可以抑制二聚体的形成。
5、甘油等：增加黏度，减少分子碰撞机会，一般使用浓度在5%-30%。
包涵体
包涵体的形成：主要因为在重组蛋白的表达过程中缺乏某些蛋白质折叠的辅助因子，或环境不适，无法形成正确的次级键等原因形成的。
由于包涵体中的重组蛋白缺乏生物学活性，加上剧烈的处理条件，使蛋白的高级结构破坏，因此重组蛋白的复性特别必要。
通过缓慢去除变性剂使目标蛋白从变性的完全伸展状态恢复到正常的折叠结构，同时去除还原剂使二硫键正常形成。
包涵体蛋白复性方法1稀释复性：直接加入水或缓冲液，放置过夜，缺点是体积增加较大，变性剂稀释速度太快，不易控制。
目前稀释法主要有一次稀释、分段稀释和连续稀释三种方式。
2透析复性：好处是不增加体积，通过逐渐降低外透液浓度来控制变性剂去除速度，有人称易形成无活性蛋白质聚体，且不适合大规模操作，无法应用到生产规模。
3超滤复性：在生产中较多的使用，规模较大，易于对透析速度进行控制，缺点是不适合样品量较少的情况，且有些蛋白可能在超滤过程中不可逆的变性。
4柱上复性：是最近研究较多并成功的在生产中应用的一种复性方法，包涵体蛋白变性后，在色谱柱上复性，大致可分成疏水柱复性及凝胶柱复性两类。
其中的凝胶柱复性均是用Sephacry1S-100或Superdex75 等分子筛填料，柱较长（40cm-100cm不等）。
相比稀释和透析两种方法，色谱柱复性回收率高（高达90%以上）、快速、易放大，样品稀释倍数小（一般五倍左右）5高蛋白质浓度下的复性：通常有两种方法，一是缓慢地连续或不连续地将变性蛋白加入到复性缓冲液中，使得蛋白质在加入过程中或加入阶段之间有足够的时间进行折叠复性；二是采用温度跳跃式复性，即让蛋白质先在低温下折叠复性以减少蛋白质聚集的形成，当形成聚集体的中间体已经减少时，迅速提高温度以促进蛋白质折叠复性。
此外，吸附法、反胶束法和双水相萃取法等都可用蛋白质的复性。
如果均失败只有换载体。
包涵体蛋白复性的几种方法
包涵体复性
包涵体复性
结合液80mm 300mm
Tris: 0.4 0.1 0.1
咪唑：0.1 0.4 1.5
氯化钠： 2 0.5 0.5
尿素：9.6g 2.4g 2.4g
水：补足至20mL 补足至5mL 补足至5mL
1.菌体用裂解液重悬，加入溶菌酶，冰上30min或者时间更长一点。
2.破碎，离心，收集沉淀。
加入包涵体溶解液，10min左右包涵体会溶解。
在冰上进行，可放在摇床上。
3.处理镍柱，放出酒精，水洗2遍，结合液3ml平衡2遍。
4.将包涵体蛋白加入柱子中，结合1小时左右。
5.结合液冲洗柱子。
6.80mm 洗脱蛋白
7.300mm洗脱蛋白，收集2ml洗脱蛋白。
8.准备2个超滤管，分别加入1ml洗脱蛋白液，再加入不含尿素的PBS （可加入EDTA等），离心。
再次加入PBS，离心，收集大约2ml的液体分装保存。
包涵体复性方法
实用标准文案包涵体复性方法：一个有效的、理想的折叠复性方法应具备以下几个特点：活性蛋白质的回收率高；正确复性的产物易于与错误折叠蛋白质分离；折叠复性后应得到浓度较高的蛋白质产品；折叠复性方法易于放大；复性过程耗时较少。
（即回收高，易分离，浓度高，易放大，耗时少。
）1. 透析、稀释和超滤复性法：这三种方法是最传统也是应用最普遍的蛋白质折叠复性方法，复性活性回收率低，而且难于与杂蛋白分离。
透析法耗时长，易形成无活性蛋白质聚集体；超滤法在膜上聚集变性（不可逆变性），易造成膜污染；稀释法（直接加入水或缓冲液，放置过夜，缺点是体积增加较大，变性剂稀释速度太快，不易控制）处理量太大，不利于工业放大。
2. 凝胶过滤层析复性凝胶过滤层析复性又称体积排阻复性(SEC)，是一种广泛应用的层析技术。
与常用的稀释复性法相比，凝胶过滤层析复性能在高的起始蛋白浓度下对蛋白进行复性，活性回收率较高，同时又能使目标蛋白得到一定程度的纯化。
凝胶过滤复性时，除了蛋白质在胶粒中的传质和扩散外，蛋白质与介质之间并不发生其它任何作用。
复性过程始终发生在溶液中。
蛋白质在伸展状态中，每个蛋白质分子的伸展状态都会有差别，而不同伸展状态的蛋白质分子在凝胶颗粒内部扩散所受到的限制也不相同，有的会扩散入颗粒内部深一些，有的会浅一些，这使不同伸展状态的蛋白质分子达到一定程度的分离，这样蛋白质分子问相互作用的机会就大大减少，从而起到一定抑制凝集的作用；即使发生了部分凝集，凝集的蛋白质会附着在胶粒上，而不随着溶液向下运动，这样后面的变性剂可以赶上凝集的蛋白质，使其重新溶解并变性；并且在凝胶过滤中脲等变性剂脱除得相对较慢，这对有些蛋白质的复性是有利的。
在普通凝胶过滤中，变性剂和还原剂的脱除（？？）虽较稀释复性慢，但变性蛋白质仍会经历变性剂浓度突然变化的过程。
脲梯度复性是样品上柱前用复性缓冲液平衡柱子，接着使变性剂浓度递减(如从6M盐酸胍或8M尿素下降到复性缓冲液中预先确定的变性剂的浓度)。
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Ｋｅ ｙ ｗｏｒｄｓ ： Ｉｎｃｌｕｓｉｏｎ ｂｏｄｙ Ｒ ｅｆｏｌｄｉｎｇ
１ 包涵体形成的原因
重组蛋白在宿主系统中高水平表达时， 无论是 用原核表达体系或酵母表达体系甚至高等真核表 达体系， 都可形成包涵体。事实上， 内源性的蛋白 质， 如果表达水平过高， 也会聚集形成包涵体。因 此， 包涵体形成的原因主要是高水平表达的结果。 动 力 学 模 型 表 明 ［１］： 活 性 蛋 白 的 产 率 取 决 于 蛋 白 合 成 的 速 率 、蛋 白 折 叠 的 速 率 和 蛋 白 聚 集 的 速 率 。 在 高水平表达时， 新生肽链的聚集速率一旦超过蛋白 正确折叠的速率就会导致包涵体的形成。实验证 明， 硫氧还蛋白还原酶活性缺失突变的大肠杆菌菌 株 ＡＤＡ４９４， ＡＤＡ４９４ （ ＤＥ３） 等 有 利 于 二 硫 键 在 细 胞 质内的形成［２］。重组 蛋白在大肠杆菌中 表达时， 缺乏 一些蛋白折叠过程中需要的酶和辅助因子， 如折叠 酶和分子伴侣等， 是包涵体形成的又一原因。包涵 体虽然由无活性的蛋白组成， 但包涵体形成对于重 组蛋白的生产也提供了几个优势： 包涵体具有高密 度， 易于分离纯化； 组蛋白以包涵体的形式存在有 效地抵御了大肠杆菌中的蛋白酶对目的蛋白的降
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子。对于细胞周质内形成的包涵体， 则需采用原位 溶 解 的 方 法 ［５］。 各 种 溶 解 方 法 都 各 有 利 弊 ， 一 般 来 讲， 盐酸胍优于脲， 因为盐酸胍是较脲强的变性剂， 而且脲中常含有的异氰酸盐或酯会不可逆地修饰 蛋 白 质 的 氨 基 或 巯 基［６］。
３ 包涵体蛋白的复性 ３．１ 复性机制
收稿日期： ２００７－０４－０９ 基金项目： 宁夏自然科学基金资助（ 项目号： ＮＺ０５０５） 作者简介： 罗惠霞（ １９７６－） ， 女， 分子生物与生物化学硕士研究生 通讯作者： 王玉炯， 男， 教授， Ｅ－ｍａｉｌ： ｗｙｊ＠ｎｘｕ．ｅｄｕ．ｃｎ
２００７ 年第 ５ 期
罗惠霞等： 包涵体蛋白复性的几种方法
剂 或 表 面 活 性 剂 ： 如 ＣＨＡＰｓ、ＴｒｉｔｏｎＸ１００、 磷 脂 、 ｌａｕｒｙｌａｍｌｔｏｓｉｄ、Ｓａｒｋｏｓｙｌ、磺 基 甜 菜 碱 （ ＮＤＳＢ） 等 对 蛋 白 质 复 性 有 促 进 作 用［９］。 使 用 去 垢 剂 和 表 面 活 性 剂 的一个不利之处是由于它们能与蛋白质结合或形 成胶束， 故很难将它们完全除去。（ ５） 单克隆抗体： 待折叠复性的蛋白质的抗体可有效协助其复性， 但 仅 该 蛋 白 质 特 异 的 抗 体 具 有 明 显 的 助 折 叠 作 用 ［１０］。 研究发现， 特异性抗体可以与待折叠蛋白的远离蛋 白质活性中心的疏水区结合， 从而有效地阻止了无 活 性 聚 集 体 形 成 。（ ６） 分 子 伴 侣 和 折 叠 酶 等 ： 这 类 蛋 白 质 主 要 包 括 硫 氧 还 蛋 白 、二 硫 键 异 构 酶 （ ＰＤＩ） 、肽 酰 脯 氨 酰 顺 反 异 构 酶 （ ＰＰＩ） 、分 子 伴 侣 、ＦＫ５０６ 结 合 蛋 白 等 。分 子 伴 侣 和 折 叠 酶 等 不 仅 可 在 细 胞 内 调 节 蛋白质的折叠和聚集过程的平衡， 而且可在体外促 进 蛋 白 质 的 折 叠 复 性 。由 于 分 子 伴 侣 和 折 叠 酶 在 蛋 白质折叠复性后要除去， 而这类蛋白质又十分昂 贵， 因此采用可回收利用的方法如固定化方法为 好 。（ ７） 人 工 伴 侣 ： 为 了 模 仿 分 子 伴 侣 ＧｒｏＥＬ ＧｒｏＥＳ 的 作 用 ， Ｒｏｚｅｍａ 和 Ｇｅｌｌｍａｎ［１１］将 变 性 蛋 白 质 首 先 加 入到含去垢剂的溶液中以防止聚集， 然后用环糊精 ｃｙｃｌｏｄｅｘｔｒｉｎ 除 去 去 垢 剂 以 促 进 折 叠 复 性 ． 这 种 方 法 被 称 作 人 工 分 子 伴 侣 促 折 叠 技 术 。（ ８） 稀 释 复 性 ： 稀 释 变 性 蛋 白 质 溶 液 、降 低 变 性 剂 浓 度 ， 从 而 为 蛋 白 质 折 叠 创 造 适 宜 的 外 部 环 境 ， 是 一 种 最 简 单 、也 是 传统的蛋白质复性方法。蛋白质折叠为分子内反 应， 为一级反应过程， 而聚集体的生成为二级以上 的反应过程。所以， 低蛋白质浓度有利于获得较高 的 复 性 收 率 。因 此 ， 目 前 蛋 白 质 复 性 的 浓 度 均 较 低 。 尽管在低浓度条件下多数蛋白质可获得较高的复 性收率， 但是降低蛋白质浓度势必增大蛋白质溶液 体 积 ， 给 后 续 的 分 离 纯 化 增 加 困 难 。因 此 ， 在 提 高 蛋 白质复性收率的同时必须设法增大蛋白质浓度。 （ ９） 复性色谱： 复性色谱作为蛋白质分离纯化的重 要手段， 色谱技术对蛋白质复性的作用近年来得到 了广泛的认识， 其中引人注目的有尺寸排阻色谱和 固 定 化 辅 助 因 子 色 谱 。 （ １０） 吸 附 复 性 法 ： 将 变 性 蛋 白质吸附到某种介质上可以有效地抑制蛋白质分 子间的非特异性相互作用， 从而提高蛋白质的复性 率 ． 肝 素 琼 脂 糖 层 析 法 、金 属 螯 和 层 析 法 等 是 实 现 吸 附 复 性 的 有 效 方 法 。 将 单 抗 、分 子 伴 侣 等 蛋 白 质
·技 术 与 方 法·
生物技术通报
ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ ＢＵＬＬＥＴＩＮ
２００７ 年第 ５ 期
包涵体蛋白复性的几种方法
Байду номын сангаас
罗惠霞 李敏 王玉炯
（ 宁 夏 大 学 生 命 科 学 学 院 ， 银 川 ７５００２１）
摘 要： 外源基因在大肠杆菌中高水平表达时， 通常会形成无活性的蛋白聚集体即包涵体。包涵体富含表达的重组 蛋白， 经分离、变性溶解后须再经过一个合适的复性过程实现变性蛋白的重折叠， 才能够得到生物活性蛋白。
（ １） 氧 化— —— 还 原 转 换 系 统 ： 如 蛋 白 质 含 有 二 硫键， 在复性缓冲液中需加入还原型及氧化型低分 子 质 量 巯 基 试 剂 的 混 合 物 ， 如 谷 胱 甘 肽 、半 胱 氨 酸 、 半 胱 胺 等 。其 还 原 型 （ １～３ｍｍｏｌ／Ｌ） 与 氧 化 型 的 摩 尔 比 为 １： １ 到 １０： １［７］。这 样 的 氧 化 还 原 系 统 实 际 上 给 蛋 白 质 形 成 的 是 一 个 还 原 环 境 。正 确 形 成 的 二 硫 键 在 这 样 的 环 境 中 还 是 有 可 能 被 还 原 的 。针 对 这 种 情 况， 还需在后续步骤加入一步强的氧化步骤， 即加 入 过 量 的 氧 化 型 巯 基 试 剂 或 采 用 Ｃｕ２＋诱 导 的 空 气 氧 化 ， 以 保 证 形 成 稳 定 的 二 硫 键 。（ ２） 小 分 子 质 量 添 加剂： 如盐酸胍或脲， 以及其他一些化合物如烷基 脲 、碳 酸 酰 胺 类 等 ， 在 非 变 性 浓 度 下 是 很 有 效 的 促 进 剂 。 蛋 白 质 的 辅 因 子 、配 基 或 底 物 亦 可 起 到 很 好 的 促 折 叠 作 用 ， 如 蛋 白 质 的 辅 因 子 Ｚｎ２＋或 Ｃｕ２＋可 以 稳定蛋白质的折叠中间体， 从而防止了蛋白质的聚 集 ， 加 入 浓 度 大 于 ０．４ｍｏｌ／ＬＴｒｉｓ 缓 冲 液 可 提 高 包 涵 体 蛋 白 质 的 折 叠 效 率 。（ ３） 聚 乙 二 醇 （ ＰＥＧ） ： Ｃｌｅｌａｎｄ 等 ［８］在 研 究 ＰＥＧ 对 包 涵 体 蛋 白 质 折 叠 复 性 的 影 响 中 发 现 ， ＰＥＧ 的 存 在 能 减 少 一 些 蛋 白 质 的 聚 集 。 蛋 白质的折叠通过一疏水融球态中间体， 这种中间体 的 聚 集 将 导 致 蛋 白 质 回 收 率 的 降 低 。ＰＥＧ 通 过 与 中 间体特异地形成非聚集的复合物而阻止了疏水中 间 体 的 聚 集 。 所 有 的 折 叠 反 应 在 ＰＥＧ 存 在 下 具 有 相 同 的 速 率 ， 复 性 率 与 ＰＥＧ 的 分 子 质 量 及 浓 度 相 。 （ ４） 非离子型去垢剂尤其是离子型或两性离子去垢
关键词： 包涵体 复性
Ｒｅｆｏｌｄｉｎｇ ｏｆ Ｉｎｃｌｕｓｉｏｎ Ｂｏｄｙ
Ｌｕｏ Ｈｕｉｘｉａ Ｌｉ Ｍｉｎ Ｗａｎｇ Ｙｕｊｏｎｇ
（ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｎｉｎｇｘｉａ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｙｉｎｃｈｕａｎ ７５００２１）
Ａｂｓ ｔｒａ ｃｔ： Ｗｈｅｎ ｅｘｔｒｉｎｓｉｃ ｇｅｎｅｓ ｈｉｇｈｌｙ ｅｘｐｒｅｓｓ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ， ｉｎｃｌｕｓｉｏｎ ｂｏｄｙ （ ｉｎａｃｔｉｖｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ） ｗｉｌｌ ｂｅ ｆｏｒｍｅｄ．Ｉｎｃｌｕｓｉｏｎ ｂｏｄｙ ｃｏｎｔａｉｎｓ ｍｕｃｈ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ．Ｔｈｅｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ｗｉｔｈ ｂｉｏａｃｔｉｖｉｔｙ ｗｉｌｌ ｂｅ ｇｏｔ ｔｈｒｏｕｇｈ ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ， ｄｅｎａｔｕｒａｔｉｏｎ ｄｉｓｓｏｌｕｔｉｏｎ， ａｎｄ ｐｒｏｐｅｒ ｒｅｆｏｌｄｉｎｇ．
解； 对于生产那些处于天然构象时对宿主细胞有毒 害的蛋白时， 包涵体形成无疑是最佳选择。
２ 包涵体的分离及溶解
包涵体是聚集的蛋白质形成的非常致密的颗 粒 ， 它 们 可 直 接 用 反 相 显 微 镜 在 活 细 胞 中 观 察 到［３］。 包涵体的分离包涵体分离的第一步是对培养收集 的重组菌细胞进行破碎， 所采用的破碎技术包括高 压 匀 浆 、超 声 波 破 碎 等 ， 为 了 提 高 破 碎 率 ， 可 以 加 入 一定量的溶菌酶。包涵体高度抗剪切力， 用以上破 碎 法 破 碎 后 仍 可 保 持 完 整 的 结 构 。离 心 除 去 破 碎 上 清液后的沉淀部分用含有低浓度的变性剂如脲和 盐 酸 胍 、去 垢 剂 如 ＴｒｉｔｏｎＸ１００、脱 氧 胆 酸 钠 等 化 合 物 的 缓 冲 液 进 行 洗 涤［４］。 包 涵 体 的 溶 解 一 般 都 用 强 的 变 性 剂 如 脲 、盐 酸 胍 或 硫 氰 酸 盐 ， 或 去 垢 剂 如 ＳＤＳ、 正 十 六 烷 基 三 甲 基 铵 氯 化 物 、对 于 含 有 半 胱 氨 酸 的 蛋 白 质 ， 还 需 加 入 还 原 剂 如 巯 基 乙 醇 、二 硫 赤 藓 糖 醇 和 半 胱 氨 酸 。 温 度 一 般 选 择 在 ３０℃以 促 进 溶 解 。 此外， 由于金属离子具有氧化催化作用， 还常常需 要 加 入 金 属 螯 合 剂 如 ＥＤＴＡ、ＥＧＴＡ 以 除 去 金 属 离