包涵体表达的蛋白的复性-生物谷
包涵体蛋白复性及其影响因素
第24卷第5期河北工业科技Vol.24,No.5 2007年9月Hebei Journal of Industrial Science and Technology Sept.2007 文章编号:100821534(2007)0520314203包涵体蛋白复性及其影响因素于文国,陶秀娥(河北化工医药职业技术学院制药工程系,河北石家庄 050026)摘 要:针对包涵体需经过细胞破碎、变性溶解、复性处理后才能形成具有一定空间构象的生物活性蛋白,且复性处理是一个非常复杂的生化反应过程,只有选择合理的方法,控制适宜的条件,才能提高蛋白的复性效率,综述了包涵体蛋白复性的方法,分析了影响复性的有关因素。
关键词:包涵体;溶解;复性;影响因素中图分类号:Q512 文献标识码:AWays and influence factors for renat uration of protein inclusion bodiesYU Wen2guo,TAO Xiu2e(Department of Pharmaceutical Engineering,Hebei Chemical and Pharmaceutical Vocational Technology College,Shijiazhuang Hebei050026,China)Abstract:To form active protein with an active conformation,processes such as crushing,dissolving and renaturalizing are needed.The renaturation is a very complicated biochemistry process.Only by selecting the proper way and controlling suitable conditions can we raise the efficiency of protein renaturation.This paper summarizes the strategies for renaturation of inclusion bodies,and analyses the factors that influnce renaturation of protein inclusion bodies.K ey w ords:inclusion body;dissolve;renaturation;influnce factors 包涵体是指大肠杆菌高效表达的重组蛋白在细胞内凝集,形成不溶的、无活性的固体颗粒。
包涵体表达的蛋白的复性
包涵体表达的蛋白的复性外源基因在大肠杆菌中的高表达常常导致包涵体的形成，虽然包涵体具有富集目标蛋白质、抗蛋白酶、对宿主毒性小等优点，但包涵体蛋白质的复性率一般都很低,而分子伴侣、低分子量添加物等在复性过程中的应用及新的复性方法的建立都大大提高了重组蛋白质复性产率。
一、包涵体：1.1包涵体的定义、组成与特性：包涵体是指细菌表达的蛋白在细胞内凝集，形成无活性的固体颗粒。
一般含有50%以上的重组蛋白，其余为核糖体元件、RNA聚合酶、内毒素、外膜蛋白ompC、ompF和ompA等，环状或缺口的质粒DNA，以及脂体、脂多糖等，大小为0.5-1um，具有很高的密度（约1.3mg/ml），无定形，呈非水溶性，只溶于变性剂如尿素、盐酸胍等。
NMR等新技术的应用表明包涵体具有一定量的二级结构，他们可能在复性的启动阶段中具有一定的作用。
[1]1.2包涵体的形成：主要因为在重组蛋白的表达过程中缺乏某些蛋白质折叠的辅助因子，或环境不适，无法形成正确的次级键等原因形成的。
1.2.1、基因工程菌的表达产率过高，超过了细菌正常的代谢水平，由于细菌的δ因子的蛋白水解能力达到饱和，使之表达产物积累起来。
研究发现在低表达时很少形成包涵体，表达量越高越容易形成包涵体。
原因可能是合成速度太快，以至于没有足够的时间进行折叠，二硫键不能正确的配对，过多的蛋白间的非特异性结合，蛋白质无法达到足够的溶解度等。
1.2.2、重组蛋白的氨基酸组成：一般说含硫氨基酸越多越易形成包涵体，而脯氨酸的含量明显与包涵体的形成呈正相关。
1.2.3、重组蛋白所处的环境：发酵温度高或胞内pH接近蛋白的等电点时容易形成包涵体。
1.2.4、重组蛋白是大肠杆菌的异源蛋白，由于缺乏真核生物中翻译后修饰所需酶类和辅助因子，如折叠酶和分子伴侣等，致使中间体大量积累，容易形成包涵体沉淀。
1.2.5、蛋白质在合成之后，于中性pH或接近中性pH的环境下，其本身固有的溶解度对于包涵体的形成比较关键，即是说，有的表达产率很高，如Aspartase和Cyanase,表达产率达菌体蛋白的30%,也不形成包涵体，而以可溶形式出现。
包涵体蛋白复性的几种方法
收稿日期： ２００７－０４－０９ 基金项目： 宁夏自然科学基金资助（ 项目号： ＮＺ０５０５） 作者简介： 罗惠霞（ １９７６－） ， 女， 分子生物与生物化学硕士研究生 通讯作者： 王玉炯， 男， 教授， Ｅ－ｍａｉｌ： ｗｙｊ＠ｎｘｕ．ｅｄｕ．ｃｎ
２００７ 年第 ５ 期
罗惠霞等： 包涵体蛋白复性的几种方法
白 质 吸 附 到 ＣＮＢｒ 活 化 的 琼 脂 糖 凝 胶 Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ 上 使 得 设 计 复 杂 蛋 白 的 复 性 过 程 成 为 可 能 。 然 而 ， 不
而实现蛋白质的复性的报道， 只是洗脱条件苛刻， 同蛋白的复性过程不同， 特异的复性环境， 包括缓冲
难 以 保 证 蛋 白 质 的 回 收 率 且 步 骤 繁 琐 。离 子 交 换 层 液的组成、蛋白浓度、温 度、ｐＨ 等应根据蛋 白 的 不 同
（ １） 氧 化— —— 还 原 转 换 系 统 ： 如 蛋 白 质 含 有 二 硫键， 在复性缓冲液中需加入还原型及氧化型低分 子 质 量 巯 基 试 剂 的 混 合 物 ， 如 谷 胱 甘 肽 、半 胱 氨 酸 、 半 胱 胺 等 。其 还 原 型 （ １～３ｍｍｏｌ／Ｌ） 与 氧 化 型 的 摩 尔 比 为 １： １ 到 １０： １［７］。这 样 的 氧 化 还 原 系 统 实 际 上 给 蛋 白 质 形 成 的 是 一 个 还 原 环 境 。正 确 形 成 的 二 硫 键 在 这 样 的 环 境 中 还 是 有 可 能 被 还 原 的 。针 对 这 种 情 况， 还需在后续步骤加入一步强的氧化步骤， 即加 入 过 量 的 氧 化 型 巯 基 试 剂 或 采 用 Ｃｕ２＋诱 导 的 空 气 氧 化 ， 以 保 证 形 成 稳 定 的 二 硫 键 。（ ２） 小 分 子 质 量 添 加剂： 如盐酸胍或脲， 以及其他一些化合物如烷基 脲 、碳 酸 酰 胺 类 等 ， 在 非 变 性 浓 度 下 是 很 有 效 的 促 进 剂 。 蛋 白 质 的 辅 因 子 、配 基 或 底 物 亦 可 起 到 很 好 的 促 折 叠 作 用 ， 如 蛋 白 质 的 辅 因 子 Ｚｎ２＋或 Ｃｕ２＋可 以 稳定蛋白质的折叠中间体， 从而防止了蛋白质的聚 集 ， 加 入 浓 度 大 于 ０．４ｍｏｌ／ＬＴｒｉｓ 缓 冲 液 可 提 高 包 涵 体 蛋 白 质 的 折 叠 效 率 。（ ３） 聚 乙 二 醇 （ ＰＥＧ） ： Ｃｌｅｌａｎｄ 等 ［８］在 研 究 ＰＥＧ 对 包 涵 体 蛋 白 质 折 叠 复 性 的 影 响 中 发 现 ， ＰＥＧ 的 存 在 能 减 少 一 些 蛋 白 质 的 聚 集 。 蛋 白质的折叠通过一疏水融球态中间体， 这种中间体 的 聚 集 将 导 致 蛋 白 质 回 收 率 的 降 低 。ＰＥＧ 通 过 与 中 间体特异地形成非聚集的复合物而阻止了疏水中 间 体 的 聚 集 。 所 有 的 折 叠 反 应 在 ＰＥＧ 存 在 下 具 有 相 同 的 速 率 ， 复 性 率 与 ＰＥＧ 的 分 子 质 量 及 浓 度 相 。 （ ４） 非离子型去垢剂尤其是离子型或两性离子去垢
重组包涵体蛋白的变性溶解及复性研究
表达重组包涵体蛋白的变性溶解及复性研究概述高应瑞（译）目前，由于基因组序列数据库的快速扩增，重组蛋白的规模化生产已经成为迫切需要。
因此，通过基因重组生产蛋白质，必须考虑其蛋白特性和活性构象，以确定它们的生物学功能。
如果蛋白质的功能以及其基因的生物学功能未知，无论该蛋白质是在天然结构或在非天然结构，都不能通过生物活性评估来对其进行评估。
至今为止,有越来越多的异源重组蛋白成功得到表达。
其中大肠埃希氏菌（大肠杆菌）是最常使用的表达系统。
然而, 在大肠杆菌中异源表达外源基因往往会导致表达蛋白形成不溶性包涵体（IBS）。
包涵体必须经过变性溶解及复性过程后才会恢复其蛋白的生物活性。
包涵体复性过程的是一个非常复杂的过程，往往需要经过大量的反复试验才能确定其复性工艺参数。
在无活性的包涵体到具有生物活性蛋白的过程中，有两个最重要的影响因素:即包涵体的变性与复性。
包涵体蛋白的溶解必须使其蛋白肽链单分子进行分散并使最大程度减少蛋白质分子肽链内以及肽链之间的相互作用。
溶剂的选择，如尿素，盐酸胍，或洗涤剂等，在包涵体溶解过程中起关键作用，蛋白质变性溶解之后进行复性。
包涵体蛋白溶解后,即可进行蛋白复性。
蛋白复性过程不是单一反应,而蛋白的正确折叠与错误折叠和蛋白聚集的竞争过程。
在蛋白复性的竞争过程中,蛋白的复性率主要取决于变性剂的最终浓度以及溶剂的条件。
本文主要讨论的重点是复性工艺中对变性剂去除方式、溶剂、小分子添加剂以及工艺条件。
小分子添加剂的作用来自其在体内的功能定位。
小分子添加剂能够在生物体缺水的情况下维持体内蛋白质的稳定性，因此被命名为渗透剂[1,2]。
在另一个实例中，基因突变，蛋白的错误折叠常常导致蛋白的失活，从而导致机体生长的异常或某些细胞功能的异常。
实验已证明在某些小分子添加剂的存在时，这些失活蛋白质能够恢复正常功能，而且细胞能够生长正常。
由于小分子能够帮助蛋白质正确折叠，因此他们也被称为化学伴侣。
许多小分子添加剂都是渗透剂和化学伴侣。
如何对包涵体蛋白进行表达与复性
如何对包涵体蛋白进行表达与复性包涵体即在某些生长条件下，在重组蛋白的表达过程中缺乏某些蛋白质折叠的辅助因子或环境不适，无法形成正确的次级键等原因形成的。
表达量越高越容易形成包涵体。
原因可能是合成速度太快，以至于没有足够的时间进行折叠，二硫键不能正确的配对，过多的蛋白间的非特异性结合，蛋白质无法达到足够的溶解度等。
关于包涵体的复性一直是生物制药的瓶颈，包涵体的处理一般包括这么几步：菌体的破碎、包涵体的洗涤、溶解、复性以及纯化。
一、包涵体蛋白的表达在平板上挑取单菌落，接种于含有氨苄青霉素和卡那霉素抗性的5 ml LB培养基中，37 ℃过夜培养，然后转接到100 ml LB 培养基中，37 ℃培养至A600 为0.4~0.6时，加入IPTG 至终浓度为0.5mmol/L 诱导3.5 h。
8000 r/min 离心5 min 收集菌体，加入10 ml 50 mmol/LTris-HCl，冰浴下超声波破碎后12000 r/min离心30 min收集沉淀。
二、包涵体的洗涤在包涵体中加入包涵体洗涤液：50 mmol/L Tris—HCl，1 mmol/L EDTA，50 mmol/LNaCl，w=0．5％TritonX-100，pH 8．0；，37℃振荡洗涤1～2 h，然后8 000 r/min 离心15 min，收集沉淀。
三、包涵体的溶解洗涤后的包涵体加入适量的(包涵体溶解液)：6 mol/L 尿素，50 mmol/L Tris—HCl，1 mmol/L EDTA，50mmol/L NaCl，10 mmol/L β-ME，pH 8．0(注：β-ME用时现加)，于磁力搅拌器上搅拌过夜，1000 r/min离心30 min，取上清即得包涵体溶解液。
四、包涵体的复性包涵体的复性目前常用的主要有两种方式：1，稀释溶液，但是操作的液体量大，蛋白稀释；2，透析，超滤或电渗透析去除变性剂。
1.包涵体的稀释复性设定不同的复性条件：蛋白质量浓度、尿素浓度、温度、氧化还原条件、加入Ttiton X-100与环糊精的量、复性时间等，使变性溶解的包涵体稀释复性，复性一定时间后取样测酶活性。
包涵体蛋白的复性研究进展
Ａｂ ｔ ａ ｔ Ｔｈ ｓ ｉ ，ｄ ｎ ｔ ｒｔｏ ｎ ｅ ａｕ ａｉｎ ｍｅｈ ｄ ｆｉｃｕｓｏ ｄ ｒ ｎｒ ｄ ｃ ｄ．Ｃｈ ｏ ｔ ｇａ ｈ ｅ ａｕ ａｉｎ ｍｅｈ ｄ ｏ ｓｒ ｃ ｅ ｗａ ｈｎｇ ｅ ａｕ ａｉｎ ａ ｄ ｒｎ ｔｒ ｔｏ ｔ ｏ ｓ ｏ ｎ ｌ ｉｎ ｂｏ ｙ ｗｅｅ ｉ ｔｏ ｕ ｅ ｒ ｍａｏ ｐ ｙ ｒ ｎ ｔｒ ｔ ｔ ｏ ｆ ｒ ｏ
级键 等原 因形 成 的。 ２ 包涵 体 的前 处 理
由于包 涵体 无 生物学 活 性 ， 因此需 要进 行 复性 。 复性 主 要 是通 过缓 慢 去除变 性剂 使 目标 蛋 白从 变性 的完 全伸 展状 态 恢 复 到 正常 的折 叠 结构 ， 同时 去 除还 原 剂 使 二硫 键 正 常 形成。 还原 剂一 般 和变性 剂 的去 除一 起慢 慢 地氧 化 去除 ， 使 二 硫键慢 慢 形 成 。 常用 的氧 化方 法有 空 气氧 化法 、 谷胱 甘 肽 氧 化法 和混合 二 硫化 物氧 化法 。
为 ５ ～０ ０ １ ０ｍｍ １ － ０／ ２ ＢＭＥ或 Ｄ Ｔｏ Ｌ Ｔ ３ 包涵体 的 复性
供了可能 ， 大肠杆菌因其易于操作 、 遗传背景清楚 、 发酵成 本低和白表达水平高等优点 ， 成为生产重组蛋 白的首选 表达系统。 外源基因在大肠杆 菌中的高表达常常导致包涵
体 的形 成 ， 包涵 体易 于分 离纯 化 ， 能避 免 蛋 白酶对 外源 蛋 并
白的降解 ， 但包涵体不溶且无 生物学活性 。 因此 ， 如何高效 地复性包涵体蛋白是基 因工程技术面临的一个难题。 笔者
对包 涵体 蛋 白的复 性研 究 进展 作 一 综 述 ， 旨在 为 促进 基 因 工 程技 术 的发展 提供 理论 依据 。 １ 包 涵体简 介 包涵 体是 指 细菌 表达 的蛋 白在 细胞 内凝 集 形成 的无 活 性 固体颗 粒 。 一般 含 有 ５ ％以上 的重组 蛋 白， ０ 其余 为核糖 体 元件 、 Ｎ Ｒ Ａ聚合 酶 、 内毒 素 、 膜蛋 白、 外 质粒 Ｄ Ａ以及脂 体 、 Ｎ 脂 多糖 等 ， 般 直径 大 小 为 ０ ～ ． Ｌ 呈 非水 溶 性 。 涵 一 ． １ ｍ， ５ ０Ｌ 包 体 主要 是 因 为重 组蛋 白 的表 达量 过 高 ， 达过 程 中缺乏 某 表 些 蛋 白质 折叠 的辅 助 因子或 环 境 不 适 ， 法 形 成 正确 的次 无
重组包涵体蛋白质的折叠复性
重组包涵体蛋白质的折叠复性冯小黎*(中国科学院遗传学研究所人类基因组中心,北京100101)摘要 综述了减少包涵体形成、包涵体分离和溶解以及包涵体折叠复性的策略及其最新进展.详细讨论了包涵体蛋白质折叠复性的基本原则、包涵体折叠复性促进剂和包涵体折叠复性方法.关键词 包涵体,重组蛋白质,折叠复性学科分类号 Q51外源基因在大肠杆菌中的高表达常常导致包涵体的形成.虽然包涵体具有富集目标蛋白质、抗蛋白酶、对宿主毒性小等优点,但包涵体蛋白质的复性率一般都很低,这大大增加了基因工程蛋白质产物的成本.解决包涵体蛋白质复性率低的问题一方面可以从上游水平进行解决,另一方面则需要从生物工程下游技术角度去解决这一问题,以获得具有潜在临床和工业应用价值的蛋白质.1 减少包涵体形成的策略1 1 降低重组菌的生长温度降低培养温度是减少包涵体形成的最常用方法.较低的生长温度由于降低了蛋白质的合成速度、降低了无活性聚集体形成的速率和疏水相互作用,因此可减少包涵体的形成[1].1 2 促进重组蛋白质可溶性表达的生长添加剂培养E.coli时添加高浓度的多醇类、蔗糖或非代谢糖可以阻止分泌到周质的蛋白质聚集反应,在最适浓度范围内这些添加剂不会影响细胞的生长、蛋白质的合成或运输[2].多醇或蔗糖不会渗透进细胞,它们对胞质蛋白质折叠的影响是由于它们所形成的渗透压会导致胞内抗渗物如甘氨酸甜菜碱的积累,而这些抗渗物具有与蔗糖类似的蛋白质稳定作用.其他促重组蛋白质可溶性表达的生长添加剂还有乙醇(诱导热休克蛋白的表达)、低分子质量的巯基或二硫化合物(影响细胞周质的还原态,从而影响二硫键的形成)和NaCl.也有报道认为丰富的培养基有利于活性蛋白质的表达,当培养条件不佳时如供氧不足或pH控制不佳时易形成包涵体[2].2 包涵体的分离及溶解2 1 包涵体的分离包涵体分离的第一步是对培养收集的重组菌细胞进行破碎,所采用的破碎技术包括高压匀浆、超声波破碎等,为了提高破碎率,可以加入一定量的溶菌酶.包涵体高度抗剪切力,用以上破碎法破碎后仍可保持完整的结构.离心除去破碎上清液后的沉淀部分用含有低浓度的变性剂如脲和盐酸胍、去垢剂如Triton X 100、脱氧胆酸钠等化合物的缓冲液进行洗涤[3].如果需要对包涵体进行纯化,一般多采用蔗糖密度梯度离心法.2 2 包涵体的溶解包涵体的溶解一般都用强的变性剂如脲、盐酸胍或硫氰酸盐,或去垢剂如SDS、正十六烷基三甲基铵氯化物、Sarkosyl等[4].对于含有半胱氨酸的蛋白质,还需加入还原剂如巯基乙醇、二硫基苏糖醇(DTT)、二硫赤藓糖醇、半胱氨酸[5].温度一般选择在30 以促进溶解.此外,由于金属离子具有氧化催化作用,还常常需要加入金属螯合剂如EDTA、EGTA以除去金属离子.对于细胞周质内形成的包涵体,则需采用原位溶解的方法[6].包涵体的溶解需要打断包涵体蛋白质分子内和分子间的各种化学键,使多肽链伸展.各种溶解方法都各有利弊.一般来讲,盐酸胍优于脲,因为盐酸胍是较脲强的变性剂,而且脲中常含有的异氰酸盐或酯会不可逆地修饰蛋白质的氨基或巯基[7].*通讯联系人.Tel:010 ********,010 ********E mail:fengxiaoli@收稿日期:2000 09 25,接受日期:2000 11 033 重组蛋白质的折叠复性3 1 蛋白质折叠复性的基本原则3 1 1 一般原则:包涵体蛋白质折叠复性的效率实际上取决于正确折叠过程与聚集过程的竞争[8].由于蛋白质的折叠复性过程不会受到其他存在于同一复性环境中蛋白质的明显影响,一般情况下并不需要对待复性蛋白质进行纯化.然而一些情况下,由于非天然状态蛋白质的聚集常常会由于其中其他一些易于聚集蛋白质的存在而加强,或一些杂蛋白在与重组蛋白质一起复性时易形成杂合分子而聚集.因此,复性时最好使蛋白质达到一定的纯度.常用的纯化变性还原状态蛋白质的方法主要是还原剂和变性剂存在下的各种层析方法.为减少聚集,蛋白质的浓度应很低,一般在10~100g/L较好,这是蛋白质在体外折叠复性过程中一个十分关键的因素.变性剂去除速率在折叠中间物的积累和蛋白质聚集中起着重要的作用.复性应尽量不采用突然改变变性剂浓度的办法,因为这样会导致折叠中间体的聚集[7].不同的蛋白质应采用不同的变性剂去除速率[9].3 1 2 环境条件:应注意折叠复性的环境条件,如温度、pH值、离子强度、复性时间.折叠复性的温度范围为0~40 ,20~25 比较常用[7].在这个温度范围内,随着温度的升高,蛋白质的复性率和复性速度也提高;如果温度超出了这个范围,蛋白质折叠复性的效率则降低.同时也要考虑到较低的温度可以减少蛋白质的聚集反应.一般来说,碱性pH环境有利于蛋白质的折叠和二硫键的交换.盐类对蛋白质的稳定作用与它对蛋白质溶解性的影响有关,各种正负离子对蛋白质的稳定性和折叠复性的影响符合H ofmeister顺序.3 2 包涵体蛋白质折叠复性的促进剂包涵体蛋白质折叠复性促进剂的促进作用可以分为[4]:稳定正确折叠蛋白质的天然结构、改变错误折叠蛋白质的稳定性、增加折叠复性中间体的溶解性、增加非折叠蛋白质的溶解性.但事实上很难估计在蛋白质折叠复性过程中所加入的添加剂促进折叠的准确机制[9].一般而言,这些促进剂并未显示出对折叠复性过程的加速作用,但它们确实抑制或减少了导致蛋白质无活性的聚集反应.3 2 1 氧化 还原转换系统:如蛋白质含有二硫键,在复性缓冲液中需加入还原型及氧化型低分子质量巯基试剂的混合物,如谷胱甘肽、半胱氨酸、半胱胺等.其还原型(1~3m mol/L)与氧化型的摩尔比为1 1到10 1[8].这样的氧化还原系统实际上给蛋白质形成的是一个还原环境.正确形成的二硫键在这样的环境中还是有可能被还原的.针对这种情况,还需在后续步骤加入一步强的氧化步骤,即加入过量的氧化型巯基试剂或采用Cu2+诱导的空气氧化,以保证形成稳定的二硫键.3 2 2 小分子质量添加剂:如盐酸胍或脲,以及其他一些化合物如烷基脲、碳酸酰胺类等,在非变性浓度下是很有效的促进剂[10].蛋白质的辅因子、配基或底物亦可起到很好的促折叠作用,如蛋白质的辅因子Zn2+或Cu2+可以稳定蛋白质的折叠中间体,从而防止了蛋白质的聚集[9].加入浓度大于0 4mol/L Tris缓冲液可提高包涵体蛋白质的折叠效率.浓度为0 5mol/L的L 盐酸精氨酸可大幅度提高包涵体蛋白的折叠效率[6,11].精氨酸可使得不正确折叠的蛋白质结构以及不正确连接的二硫键变得不稳定,而使折叠过程向正确方向进行.但也有研究表明精氨酸略使蛋白质不稳定并可能干扰寡聚体蛋白质的缔合[4].3 2 3 聚乙二醇(PEG):Cleland等[12]在研究PEG对包涵体蛋白质折叠复性的影响中发现, PEG的存在能减少一些蛋白质的聚集.蛋白质的折叠通过一疏水融球态中间体,这种中间体的聚集将导致蛋白质回收率的降低.PEG通过与中间体特异地形成非聚集的复合物而阻止了疏水中间体的聚集.所有的折叠反应在PEG存在下具有相同的速率,复性率与PEG的分子质量及浓度相关. PEG对蛋白质折叠复性的促进作用与分子伴侣的作用机理相似.3 24 非离子型去垢剂尤其是离子型或两性离子去垢剂或表面活性剂:如CHAPs、Triton X 100、磷脂、laurylmaltosid、Sarkosyl、磺基甜菜碱(NDSB)等对蛋白质复性有促进作用[13].使用去垢剂和表面活性剂的一个不利之处是由于它们能与蛋白质结合或形成胶束,故很难将它们完全除去.3 2 5 单克隆抗体:待折叠复性的蛋白质的抗体可有效协助其复性,但仅该蛋白质特异的抗体具有明显的助折叠作用[14].研究发现,特异性抗体可以与待折叠蛋白的远离蛋白质活性中心的疏水区结合,从而有效地阻止了无活性聚集体形成.3 2 6 分子伴侣和折叠酶等:这类蛋白质主要包括硫氧还蛋白、二硫键异构酶(PDI)、肽酰 脯氨酰顺反异构酶(PPI)、分子伴侣、FK506结合蛋白、Cyclophilin等.分子伴侣和折叠酶等不仅可在细胞内调节蛋白质的折叠和聚集过程的平衡,而且可在体外促进蛋白质的折叠复性[15].由于分子伴侣和折叠酶在蛋白质折叠复性后要除去,而这类蛋白质又十分昂贵,因此采用可回收利用的方法如固定化方法为好.3 2 7 人工伴侣:为了模仿分子伴侣GroEL GroES的作用,Rozema和Gellm an[16]将变性蛋白质首先加入到含去垢剂的溶液中以防止聚集,然后用环糊精cy clodextrin除去去垢剂以促进折叠复性.这种方法被称作人工分子伴侣促折叠技术.3 2 8 其他:多聚离子化合物如肝素不仅可以促进蛋白质的复性[11],而且具有稳定天然蛋白质的作用.Builder等[6]在折叠复性类胰岛素生长因子 方法中,除了加入金属铜离子和镁离子、2mol/L脲、盐类如1mol/L NaCl、DT T外,还加入了乙醇、甘油等.短链醇类、高渗物等可以有效降低聚集体的形成,这可能归结为它们对蛋白质的稳定作用.3 3 包涵体蛋白质折叠复性方法一个有效的、理想的折叠复性方法应具备以下几个特点:a 活性蛋白质的回收率高;b 正确复性的产物易于与错误折叠蛋白质分离;c 折叠复性后应得到浓度较高的蛋白质产品;d 折叠复性方法易于放大;e 复性过程耗时较少[17].就商业应用而言,要求折叠复性过程必须快速、低成本、高效.虽然蛋白质的折叠复性已有很多方法,但针对每一种蛋白质仍需通过实验摸索出最佳的方法.3 3 1 透析、稀释和透滤复性法:这三种方法是最传统的也是应用最普遍的蛋白质折叠复性方法,这三种方法各具特点[4].透析法耗时长,易形成无活性蛋白质聚集体.透滤是借助超滤实现复性的方法.该法速度较快,但由于蛋白质在超滤过程中易在膜上聚集变性(膜污染),从而限制了这种方法的应用.稀释法简单,也较透析、透滤法有效,但处理的料液量大,不利于复性方法的工业放大.目前稀释法主要有一次性稀释、分段稀释和连续稀释三种方式.分段稀释法和连续稀释法的复性回收率要高于一次性稀释法.分段稀释法一般采用两步稀释法,即先将变性剂的浓度降至一个中间浓度,最后再完全除去;或者是将强变性剂改为弱变性剂,最后再完全除去变性剂.3 3 2 已变性多肽的二硫键形成方法:对于具有二硫键的蛋白质,由于在包涵体中其二硫键(分子内或分子间)多有错配,复性时还涉及正确二硫键的重建.目前,正确二硫键的形成方法主要有以下几种[5]:a 空气氧化法,一般是利用空气中的氧气在折叠期间氧化巯基,痕量金属离子如Cu2+的存在可具有催化作用[10,14].此法简单,成本低,但复性率低且氧化过程难以准确控制.b 加入氧化 还原转换试剂,如还原型谷胱甘肽/氧化型谷胱甘肽等.c 复性前,加入氧化型谷胱甘肽,可使得氧化型谷胱甘肽与还原的蛋白质半胱氨酸之间形成二硫复合物,然后通过在复性过程中除去谷胱甘肽和变性剂,并加入低浓度的半胱氨酸取代蛋白质 S S 谷胱甘肽中的谷胱甘肽而使二硫键正确形成.d 用还原试剂或亚硫酸纳/连四硫酸钠使变性蛋白质磺化以保护巯基,复性时加入少量的还原试剂即可移去保护基团而使二硫键正确配对.e 加入DTT等还原剂.3 3 3 吸附复性法:将变性蛋白质吸附到某种介质上可以有效地抑制蛋白质分子间的非特异性相互作用,从而提高蛋白质的复性率.肝素琼脂糖层析法、金属螯和层析法等是实现吸附复性的有效方法.将单抗、分子伴侣等蛋白质的亲和配基固定在凝胶介质上促进蛋白质的折叠复性[14,15],也是一种吸附复性法,只不过介质上固定的配基单独也具有促进折叠的作用.也有将变性的蛋白质吸附到CNBr活化的琼脂糖凝胶Sepharose上而实现蛋白质的复性的报道,只是洗脱条件苛刻,难以保证蛋白质的回收率且步骤繁琐.离子交换层析、疏水相互作用层析等吸附纯化技术亦是很有效的吸附折叠复性法.3 34 凝胶过滤层析复性法:凝胶过滤层析除了可进行缓冲液交换式的蛋白质复性外,亦可对蛋白质进行一定程度的纯化[18].凝胶过滤层析已成功地用于许多蛋白质的复性.但在柱中进行缓冲液交换时,蛋白质可能会发生聚集现象.3 3 5 高蛋白质浓度下的复性方法:在高蛋白质浓度下实现蛋白质折叠的高产率,目前有几种成功的例子.一种是缓慢地连续或不连续地将变性蛋白质加入到复性缓冲液中[19],使得蛋白质在加入过程中或加入阶段之间有足够的时间进行折叠复性.一种是采用温度跳跃式复性,即让蛋白质先在低温下折叠复性以减少蛋白质聚集体的形成,当形成聚集体的中间体已经减少时,迅速提高温度以促进蛋白质折叠复性[1].另外,还可以通过优化方法选择稀释法中变性剂的终浓度.凝胶过滤层析也可以实现高蛋白质浓度下的蛋白质的折叠复性,此外,吸附法、反胶束法和双水相萃取法等都可用于高浓度蛋白质的复性.3 3 6 反胶束复性法[20]:由于蛋白质在反胶束内水相中可以保持其构象和活性,运用相转移技术可以将蛋白质分子包于反胶束中,由于这样可使得蛋白质分子相互分离,减少了蛋白质折叠过程的聚集作用,通过逐渐降低变性剂的浓度和加入氧化 还原剂,则可使变性蛋白质复性.但表面活性剂对蛋白质具有变性作用.3 3 7 双水相法复性法[17]:Forciniti用硫氰化钠、氯化钠、溴化锂与聚乙二醇构成的双水相系统使得包涵体的溶解与蛋白质的折叠复性在一步双水相技术操作中完成.由于PEG具有稳定蛋白质构象的作用、高浓度盐则具有去稳定的作用,这样正确折叠的蛋白质会不断进入到另一相中,直到蛋白质的折叠与去折叠达到一个平衡.参 考 文 献1 Xie Y,W etl aufer D B.Control of aggregati on in protein refolding:the temperature leap tactic.Protein Sci,1996,5(3):517~5232 Georgi ous G,Valax P.Expression of correctly folded proteins inE.coli.Curr Opin Bi otechnol,1996,7(2):190~1973 Rudolph R,Bohm G,Lilie H,et al.Folding protei ns.In:Crei ghton T E 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Patent,00393725A 1,1986 10 2311Dabora J M,S anyal G,M iddaugh C R.Effect of pol yani on on the refolding of human acidic fibroblast grow th factor.J Biol Chem, 1991,266(35):23637~2364012Clelan d J L,Bui lder S E,Sw artz J R,e t al.Polyethylene glycol enhan ced protein refolding.Bio/Technol,1992,10(9):1013~ 101913W etlaufer D B,Xie Y.Control of aggregation in protein refolding:a variety of surfactants promote renaturation of carbonic anhydrase.Protei n Sci,1995,4(8):1535~154314Sadana A.Protein refolding and inactivation duri ng bioseparation: bioprocessing implications.Biotech Bioeng,1995,48(5):481~ 48915Thomas J G,Ayling A,Baneyx F.M olecular chaperones,folding catalysts,an d the recovery of active recombinant proteins fomE.coli:to fold or refold.Appl Biochem Bi otechnol,1997,66(3):197~23816Rozema D,Gellman S H.Artificial chaperone assisted refolding of denatured reduced lysozyme:modulation of the competition between renaturati on and aggregation.Bi ochemi 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reviewed in detail.Key words inclusion body,recombinant protein,refolding*Corresponding author.T el:86 10 64871664,86 10 80494199,E mai l:fengxiaoli@Received:September25,2000 Accepted:November3,2000。
(整理)包涵体表达的蛋白的复性
包涵体表达的蛋白的复性外源基因在大肠杆菌中的高表达常常导致包涵体的形成，虽然包涵体具有富集目标蛋白质、抗蛋白酶、对宿主毒性小等优点，但包涵体蛋白质的复性率一般都很低,而分子伴侣、低分子量添加物等在复性过程中的应用及新的复性方法的建立都大大提高了重组蛋白质复性产率。
一、包涵体：1.1包涵体的定义、组成与特性：包涵体是指细菌表达的蛋白在细胞内凝集，形成无活性的固体颗粒。
一般含有50%以上的重组蛋白，其余为核糖体元件、RNA聚合酶、内毒素、外膜蛋白ompC、ompF和ompA等，环状或缺口的质粒DNA，以及脂体、脂多糖等，大小为0.5-1um，具有很高的密度（约1.3mg/ml），无定形，呈非水溶性，只溶于变性剂如尿素、盐酸胍等。
NMR等新技术的应用表明包涵体具有一定量的二级结构，他们可能在复性的启动阶段中具有一定的作用。
[1]1.2包涵体的形成：主要因为在重组蛋白的表达过程中缺乏某些蛋白质折叠的辅助因子，或环境不适，无法形成正确的次级键等原因形成的。
1.2.1、基因工程菌的表达产率过高，超过了细菌正常的代谢水平，由于细菌的δ因子的蛋白水解能力达到饱和，使之表达产物积累起来。
研究发现在低表达时很少形成包涵体，表达量越高越容易形成包涵体。
原因可能是合成速度太快，以至于没有足够的时间进行折叠，二硫键不能正确的配对，过多的蛋白间的非特异性结合，蛋白质无法达到足够的溶解度等。
1.2.2、重组蛋白的氨基酸组成：一般说含硫氨基酸越多越易形成包涵体，而脯氨酸的含量明显与包涵体的形成呈正相关。
1.2.3、重组蛋白所处的环境：发酵温度高或胞内pH接近蛋白的等电点时容易形成包涵体。
1.2.4、重组蛋白是大肠杆菌的异源蛋白，由于缺乏真核生物中翻译后修饰所需酶类和辅助因子，如折叠酶和分子伴侣等，致使中间体大量积累，容易形成包涵体沉淀。
1.2.5、蛋白质在合成之后，于中性pH或接近中性pH的环境下，其本身固有的溶解度对于包涵体的形成比较关键，即是说，有的表达产率很高，如Aspartase和Cyanase,表达产率达菌体蛋白的30%,也不形成包涵体，而以可溶形式出现。
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包涵体表达的蛋白的复性摘要综述了包涵体形成、包涵体分离和溶解、包涵体折叠复性的方法、复性产率低下的主要因素以及通过分子伴侣、低分子量添加物等的应用而提高了蛋白质复性产率。
关键词包涵体蛋白质复性Abstract Strategies for decreasing the formation of inclusion bodies, isolation and resolution of inclusion bodies, refolding of inclusion body proteins and the cause of decreased refolding yields were included. Renaturation yield of recombinant protein have been improved by using some additives, such as molecular chaperone, small molecules.Key words inclusion body , protein , renaturation外源基因在大肠杆菌中的高表达常常导致包涵体的形成，虽然包涵体具有富集目标蛋白质、抗蛋白酶、对宿主毒性小等优点，但包涵体蛋白质的复性率一般都很低,而分子伴侣、低分子量添加物等在复性过程中的应用及新的复性方法的建立都大大提高了重组蛋白质复性产率。
一、包涵体：1.1包涵体的定义、组成与特性：包涵体是指细菌表达的蛋白在细胞内凝集，形成无活性的固体颗粒。
一般含有50%以上的重组蛋白，其余为核糖体元件、RNA聚合酶、内毒素、外膜蛋白ompC、ompF和ompA等，环状或缺口的质粒DNA，以及脂体、脂多糖等，大小为0.5-1um，具有很高的密度（约1.3mg/ml），无定形，呈非水溶性，只溶于变性剂如尿素、盐酸胍等。
NMR等新技术的应用表明包涵体具有一定量的二级结构，他们可能在复性的启动阶段中具有一定的作用。
[1]1.2包涵体的形成：主要因为在重组蛋白的表达过程中缺乏某些蛋白质折叠的辅助因子，或环境不适，无法形成正确的次级键等原因形成的。
1.2.1、基因工程菌的表达产率过高，超过了细菌正常的代谢水平，由于细菌的δ因子的蛋白水解能力达到饱和，使之表达产物积累起来。
研究发现在低表达时很少形成包涵体，表达量越高越容易形成包涵体。
原因可能是合成速度太快，以至于没有足够的时间进行折叠，二硫键不能正确的配对，过多的蛋白间的非特异性结合，蛋白质无法达到足够的溶解度等。
1.2.2、重组蛋白的氨基酸组成：一般说含硫氨基酸越多越易形成包涵体，而脯氨酸的含量明显与包涵体的形成呈正相关。
1.2.3、重组蛋白所处的环境：发酵温度高或胞内pH接近蛋白的等电点时容易形成包涵体。
1.2.4、重组蛋白是大肠杆菌的异源蛋白，由于缺乏真核生物中翻译后修饰所需酶类和辅助因子，如折叠酶和分子伴侣等，致使中间体大量积累，容易形成包涵体沉淀。
1.2.5、蛋白质在合成之后，于中性pH或接近中性pH的环境下，其本身固有的溶解度对于包涵体的形成比较关键，即是说，有的表达产率很高，如Aspartase和Cyanase,表达产率达菌体蛋白的30%,也不形成包涵体，而以可溶形式出现。
[2]1.2.6、在细菌分泌的某个阶段，蛋白质分子间的离子键、疏水键或共价键等化学作用导致了包涵体的形成。
1.3包涵体破菌、分离、洗涤及溶解1.3.1基因工程菌发酵液，经离心浓缩后，可用：机械破碎、超声破碎：单纯超声破碎，在小规模下且菌量较少的情况下效果较好，由于能量传递和局部产热等原因，很难用于大体积细胞悬液的破碎，这样部分未破碎细胞与包涵体混在一起，给后期纯化带来困难。
因此，在较大规模纯化时先用溶菌酶破碎细菌的细胞膜，再结合超声破碎方法，可显著提高包涵体的纯度和回收率。
以及化学方法破碎使细菌裂解,然后以5000-20000g 15min离心，可使大多数包涵体沉淀，与可溶性蛋白分离。
1.3.2洗涤：为了除去包涵体上粘附的杂质，如膜蛋白或核酸，应用洗涤液洗涤包涵体，通常用低浓度的变性剂,过高浓度的尿素或盐酸胍会使包涵体溶解，如2M尿素在50mM Tris pH7.0-8.5左右,1mM EDTA 中洗涤。
此外可以用温和去垢剂TritonX-100洗涤去除膜碎片和膜蛋白。
[3]1.3.3溶解：一般用强的变性剂如尿素（6-8M）、盐酸胍（GdnHCl 6M），通过离子间的相互作用，打断包涵体蛋白质分子内和分子间的各种化学键，使多肽伸展，一般来讲，盐酸胍优于尿素，因为盐酸胍是较尿素强的变性剂，它能使尿素不能溶解的包涵体溶解，而且尿素分解的异氰酸盐能导致多肽链的自由氨基甲酰化，特别是在碱性pH值下长期保温时。
或用去垢剂，如SDS、正十六烷基三甲基铵氯化物、Sarkosyl 等，可以破坏蛋白内的疏水键，也可溶解一些包涵体蛋白质。
Kandula Suntha等人用TritonX-100来溶解Zymononas mobilis levansucrase包涵体蛋白。
另外，对于含有半胱氨酸的蛋白质，分离的包涵体中通常含有一些链间形成的二硫键和链内的非活性二硫键。
还需加入还原剂，如巯基乙醇、二硫基苏糖醇（DTT）、二硫赤藓糖醇、半胱氨酸。
还原剂的使用浓度一般是50-100mM 2-BME或DTT，也有文献使用5mM浓度。
在较粗放的条件下，可以使用5ml/l的浓度。
还原剂的使用浓度与蛋白二硫键的数目无关，而有些没有二硫键的蛋白加不加还原剂无影响，如牛生长激素包涵体的增溶。
对于目标蛋白没有二硫键某些包涵体的增溶，有时还原剂的使用也是必要的，可能由于含二硫键的杂蛋白影响了包涵体的溶解。
[4]二、复性：由于包涵体中的重组蛋白缺乏生物学活性，加上剧烈的处理条件，使蛋白的高级结构破坏，因此重组蛋白的复性特别必要。
通过缓慢去除变性剂使目标蛋白从变性的完全伸展状态恢复到正常的折叠结构，同时去除还原剂使二硫键正常形成。
一般在尿素浓度4M左右时复性过程开始，到2M 左右时结束。
对于盐酸胍而言，可以从4M开始，到1.5M 时复性过程已经结束。
2.1包涵体蛋白复性方法2.1.1稀释复性：直接加入水或缓冲液，放置过夜，缺点是体积增加较大，变性剂稀释速度太快，不易控制。
目前稀释法主要有一次稀释、分段稀释和连续稀释三种方式。
2.1.2透析复性：好处是不增加体积，通过逐渐降低外透液浓度来控制变性剂去除速度，有人称易形成无活性蛋白质聚体，且不适合大规模操作，无法应用到生产规模。
2.1.3超滤复性：在生产中较多的使用，规模较大，易于对透析速度进行控制，缺点是不适合样品量较少的情况，且有些蛋白可能在超滤过程中不可逆的变性。
2.1.4柱上复性：是最近研究较多并成功的在生产中应用的一种复性方法，包涵体蛋白变性后，在色谱柱上复性，大致可分成疏水柱复性及凝胶柱复性两类。
其中的凝胶柱复性均是用Sephacry1S-100或Superdex75 等分子筛填料，柱较长（40cm-100cm不等）。
相比稀释和透析两种方法，色谱柱复性回收率高（高达90%以上）、快速、易放大，样品稀释倍数小（一般五倍左右）[5]2.1.5高蛋白质浓度下的复性：通常有两种方法，一是缓慢地连续或不连续地将变性蛋白加入到复性缓冲液中，使得蛋白质在加入过程中或加入阶段之间有足够的时间进行折叠复性；二是采用温度跳跃式复性，即让蛋白质先在低温下折叠复性以减少蛋白质聚集的形成，当形成聚集体的中间体已经减少时，迅速提高温度以促进蛋白质折叠复性。
此外，吸附法、反胶束法和双水相萃取法等都可用蛋白质的复性。
2.2包涵体蛋白复性效率复性是一个非常复杂的过程，除与蛋白质复性的过程控制相关外，还很大程度上与蛋白质本身的性质有关，有些蛋白非常容易复性，如牛胰RNA酶有12对二硫键，在较宽松的条件下复性效率可以达到95%以上，而有一些蛋白至今没有发现能够对其进行复性的方法如IL-11，很多蛋白的复性效率只有百分之零点几，如在纯化IL-2时以十二烷基硫酸钠溶液中加入铜离子（0.05%SDS，7.5-30u mol/l CuCl2）的方法，25-37°C下反应3小时，再EDTA至1m mol/l终止反应，复性后的二聚体低于1%。
[6]一般说来，蛋白质的复性效率在20%左右。
2.2.1影响复性效率的因素：2.2.1.1蛋白质的复性浓度：正确折叠的蛋白质的得率低通常是由于多肽链之间的聚集作用，蛋白质的浓度是使蛋白质聚集的主要因素，因而，一般浓度控制在0.1-1mg/ml；如果变性蛋白加入复性液中过快，容易形成絮状沉淀，可能是蛋白重新凝聚的缘故。
所以我们采用再水浴和磁力搅拌下，逐滴加入变性蛋白，使变性蛋白在复性液中始终处于低浓度状态。
2.2.1.2pH和温度：复性缓冲液的pH值必须在7.0以上，这样可以防止自由硫醇的质子化作用影响正确配对的二硫键的形成，过高或过低会降低复性效率，最适宜的复性pH值一般是8.0-9.0。
[12] 此外，影响复性效率的因素还有，变性剂的起始浓度和去除速度、氧化还原电势、离子强度、共溶剂和其他添加剂的存在与否等。
2.2.2提高包涵体蛋白的复性产率2.2.2.1氧化-还原转换系统对于含有二硫键的蛋白，复性过程应能够促使二硫键形成。
常用的方法有：空气氧化法、使用氧化交换系统、混合硫化物法、谷胱甘肽再氧化法及DTT再氧化法.最常用的氧化交换系统是GSH/GSSG,而cysteine/cystine、cysteamine/cystamine、DTT/GSSG、DTE/GSSG 等也都有应用。
氧化交换系统通过促使不正确形成的二硫键的快速交换反应提高了正确配对的二硫键的产率。
通常使用1-3m mol/l还原型巯基试剂,还原型和氧化型巯基试剂的比例通常为10：1—5：1。
[7]2.2.2.2添加低分子化合物低分子化合物自身并不能加速蛋白质的折叠，但可能通过破坏错误折叠中间体的稳定性，或增加折叠中间体和未折叠分子的可溶性来提高复性产率。
如盐酸胍、脲、烷基脲、以及碳酸酰胺类等，在非变性浓度下是很有效的促进剂。
蛋白质的辅因子、配基或底物亦可起到很好的促折叠作用，如蛋白质的辅因子Zn2+或Cu2+可以稳定蛋白质的折叠中间体,从而防止了蛋白质的聚集，加入浓度大于0.4 mol/lTris缓冲液可提高包涵体蛋白质的折叠效率。
浓度为0.4-0.6M L-Arg有助于增加复性中间产物的溶解度。
成功的应用于很多蛋白如t-PA的复性中，可以抑制二聚体的形成。
NDSBs是近年来出现的可促进蛋白复性的新家族, NDSBs由一个亲水的硫代甜菜碱及一个短的疏水集团组成，故不属于去垢剂,不会形成微束,易于透析去除，目前，常用的有NDSB-195，NDSB-201，NDSB-256。