第十一章 基因重组蛋白包涵体的分离和复性
包涵体的复性总结
包涵体的复性总结关于包涵体的复性是一个令人头疼的问题,已经成为生物制药的瓶颈,包涵体的复性前期准备工作尤为重要,关于包涵体的处理一般包括这么几步:菌体的破碎、包涵体的洗涤、溶解、复性以及纯化,实验内容比较庞杂、繁琐。
一、菌体的裂解菌体的破碎方法很多:高速组织捣碎、玻璃匀浆器匀浆、超声波处理法、反复冻融法、化学处理法。
无论用哪一种方法破碎组织细胞,都会使细胞内蛋白质或核酸水解酶释放到溶液中,使大分子生物降解,导致天然物质量的减少,不同的菌体蛋白需要加入不同的抑制剂:二异丙基氟磷酸(DFP)可以抑制或减慢自溶作用;碘乙酸可以抑制那些活性中心需要有疏基的蛋白水解酶的活性,苯甲磺酰氟化物(PMSF)也能清除蛋白水解酶活力,但不是全部,而且应该在破碎的同时多加几次;另外,还可通过选择pH、温度或离子强度等,使用这些条件时都要适合于目的物质的提取。
在实验室研究多采用超声波处理法和匀浆器匀浆法。
二、包涵体的洗涤通常的洗涤方法一般是难以洗干净的,包涵体中主要含有重组蛋白,但也含有一些细菌成分,如一些外膜蛋白、质粒DNA和其它杂质。
洗涤常用1%以下的中性去垢剂,如Tween、Triton、Lubel和NP40等加EDTA反复多次进行,因去垢剂洗涤能力随溶液离子强度升高而加强,在洗涤包涵体时可加50 mM NaCL。
也可用低浓度的盐酸胍或尿素/中性去垢剂/EDTA/还原剂等洗去包涵体表面吸附的大部分不溶性杂蛋白。
洗涤液pH以与工程菌生理条件相近为宜。
根据不同的菌体选用与之相应的洗涤液,比如:2 M尿素+50mm Tris-HCl+0.2 mM NaCl +1%Triton x-100+2mmEDTA PH8.0,再用缓冲洗涤一次。
此外,刚处理完的包含体好溶解,冷冻后难溶解,且溶解时间和比例都会加大。
三、包涵体的溶解强的变性剂如尿素、盐酸胍,是通过离子间的相互作用,打断包涵体蛋白质分子内和分子间的各种化学键,使多肽伸展,SDS、正十六烷基三甲基铵氯化物等去垢剂,可以破坏蛋白内的疏水键,也可溶解一些包涵体蛋白质。
重组包涵体蛋白的变性溶解及复性研究
表达重组包涵体蛋白的变性溶解及复性研究概述高应瑞（译）目前，由于基因组序列数据库的快速扩增，重组蛋白的规模化生产已经成为迫切需要。
因此，通过基因重组生产蛋白质，必须考虑其蛋白特性和活性构象，以确定它们的生物学功能。
如果蛋白质的功能以及其基因的生物学功能未知，无论该蛋白质是在天然结构或在非天然结构，都不能通过生物活性评估来对其进行评估。
至今为止,有越来越多的异源重组蛋白成功得到表达。
其中大肠埃希氏菌（大肠杆菌）是最常使用的表达系统。
然而, 在大肠杆菌中异源表达外源基因往往会导致表达蛋白形成不溶性包涵体（IBS）。
包涵体必须经过变性溶解及复性过程后才会恢复其蛋白的生物活性。
包涵体复性过程的是一个非常复杂的过程，往往需要经过大量的反复试验才能确定其复性工艺参数。
在无活性的包涵体到具有生物活性蛋白的过程中，有两个最重要的影响因素:即包涵体的变性与复性。
包涵体蛋白的溶解必须使其蛋白肽链单分子进行分散并使最大程度减少蛋白质分子肽链内以及肽链之间的相互作用。
溶剂的选择，如尿素，盐酸胍，或洗涤剂等，在包涵体溶解过程中起关键作用，蛋白质变性溶解之后进行复性。
包涵体蛋白溶解后,即可进行蛋白复性。
蛋白复性过程不是单一反应,而蛋白的正确折叠与错误折叠和蛋白聚集的竞争过程。
在蛋白复性的竞争过程中,蛋白的复性率主要取决于变性剂的最终浓度以及溶剂的条件。
本文主要讨论的重点是复性工艺中对变性剂去除方式、溶剂、小分子添加剂以及工艺条件。
小分子添加剂的作用来自其在体内的功能定位。
小分子添加剂能够在生物体缺水的情况下维持体内蛋白质的稳定性，因此被命名为渗透剂[1,2]。
在另一个实例中，基因突变，蛋白的错误折叠常常导致蛋白的失活，从而导致机体生长的异常或某些细胞功能的异常。
实验已证明在某些小分子添加剂的存在时，这些失活蛋白质能够恢复正常功能，而且细胞能够生长正常。
由于小分子能够帮助蛋白质正确折叠，因此他们也被称为化学伴侣。
许多小分子添加剂都是渗透剂和化学伴侣。
包涵体蛋白的纯化和复性
包涵体蛋白的纯化和复性包涵体蛋白的纯化和复性1．菌体的收集和破碎用50 ml离心管分别收集诱导表达后的培养物，8000 rpm 4℃离心10 min。
沉淀用适量的超声破菌缓冲液重悬。
【备注】超声破菌缓冲液（20 mmol/L Tris-HCl pH8.0、0.5 mol/L NaCl、1 mmol/L EDTA、1 mg/mL溶菌酶）重悬后的菌液于冰浴中进行超声波破碎，其条件为：功率为300W，占空比50%，每个循环30 s，总时间20 min。
破碎后的匀浆，4℃、 12000 rpm离心15 min。
分别取上清液和沉淀进行12% SDS-PAGE分析，确定目的蛋白是否以包涵体的形式表达。
2．包涵体的处理洗涤：沉淀用适量的包涵体洗涤缓冲液重悬后，搅拌洗涤20~30 min，于4℃，12000 rpm离心15 min，弃去上清液。
重复一次。
再用适量的50 mmol/L Tris pH8.0溶液洗涤一遍（以去除残留的EDTA），于4℃ 12000 rpm离心15 min，弃去上清液。
【备注】包涵体洗涤缓冲液（20 mmol/L Tris－HCl pH 8.0，0.5 mol/L NaCl，2 mol/L尿素，2％ Triton）2％Triton X-100溶液：量取2mlTriton X-100(聚乙二醇辛基苯基醚)液，加M缓冲液98ml即可。
溶解：沉淀用适量的包涵体溶解缓冲液重悬，室温搅拌5-6小时或过夜。
12000 rpm 4℃离心15 min，收集上清液。
【备注】包涵体溶解缓冲液（20 mmol/L Tris－HCl pH 8.0，0.5 mol/L NaCl，8 mol/L尿素，0.2 mmol/L DTT或100 mmol/L β-巯基乙醇，2％Triton）3．目的蛋白的纯化亲和层析基于目的蛋白与固相化的配基特异结合而滞留，其他杂蛋白会流过柱子。
谷胱甘肽S-转移酶（GST）是最常用的亲和层析纯化标签之一，带有此标签的重组蛋白可用交联谷胱甘肽的层析介质纯化，但本方法有以下缺点：首先，蛋白上的GST必须能合适的折叠，形成与谷胱甘肽结合的空间结构才能用此方法纯化；其次，GST标签多达220个氨基酸，如此大的标签可能会影响表达蛋白的可溶性，使形成包涵体，这会破坏蛋白的天然结构，难于进行结构分析，有时即便纯化后再酶切去除GST标签也不一定能解决问题。
如何对包涵体蛋白进行表达与复性
如何对包涵体蛋白进行表达与复性包涵体即在某些生长条件下，在重组蛋白的表达过程中缺乏某些蛋白质折叠的辅助因子或环境不适，无法形成正确的次级键等原因形成的。
表达量越高越容易形成包涵体。
原因可能是合成速度太快，以至于没有足够的时间进行折叠，二硫键不能正确的配对，过多的蛋白间的非特异性结合，蛋白质无法达到足够的溶解度等。
关于包涵体的复性一直是生物制药的瓶颈，包涵体的处理一般包括这么几步：菌体的破碎、包涵体的洗涤、溶解、复性以及纯化。
一、包涵体蛋白的表达在平板上挑取单菌落，接种于含有氨苄青霉素和卡那霉素抗性的5 ml LB培养基中，37 ℃过夜培养，然后转接到100 ml LB 培养基中，37 ℃培养至A600 为0.4~0.6时，加入IPTG 至终浓度为0.5mmol/L 诱导3.5 h。
8000 r/min 离心5 min 收集菌体，加入10 ml 50 mmol/LTris-HCl，冰浴下超声波破碎后12000 r/min离心30 min收集沉淀。
二、包涵体的洗涤在包涵体中加入包涵体洗涤液：50 mmol/L Tris—HCl，1 mmol/L EDTA，50 mmol/LNaCl，w=0．5％TritonX-100，pH 8．0；，37℃振荡洗涤1～2 h，然后8 000 r/min 离心15 min，收集沉淀。
三、包涵体的溶解洗涤后的包涵体加入适量的(包涵体溶解液)：6 mol/L 尿素，50 mmol/L Tris—HCl，1 mmol/L EDTA，50mmol/L NaCl，10 mmol/L β-ME，pH 8．0(注：β-ME用时现加)，于磁力搅拌器上搅拌过夜，1000 r/min离心30 min，取上清即得包涵体溶解液。
四、包涵体的复性包涵体的复性目前常用的主要有两种方式：1，稀释溶液，但是操作的液体量大，蛋白稀释；2，透析，超滤或电渗透析去除变性剂。
1.包涵体的稀释复性设定不同的复性条件：蛋白质量浓度、尿素浓度、温度、氧化还原条件、加入Ttiton X-100与环糊精的量、复性时间等，使变性溶解的包涵体稀释复性，复性一定时间后取样测酶活性。
包涵体蛋白复性的方法简介与操作
活性蛋白整体方案包涵体蛋白复性的方法简介与实验操作摘要：本文主要讲解了包涵体蛋白复性的技术的原理及操作方法，并附有相关案例。
包涵体的纯化和复性总结包涵体折叠复性的方法应具备以下几个特点：较高的活性蛋白质回收率；复性产物易于与错误折叠蛋白质分离；折叠复性后能够得到较高浓度的蛋白；折叠复性方法易于放大等。
蛋白复性的过程通常分为以下几个步骤：包涵体的洗涤包涵体在溶解之前需要进行洗涤，包涵体中主要含有重组蛋白，但也含有一些杂质，如一些外膜蛋白、质粒DNA 等，这些杂质会与包涵体粘连在一起，可以通过洗涤去除大多数杂质，但无法将杂蛋白去除干净。
包涵体的洗涤通常选用浓度较低的变性剂，如2M尿素在50mM Tris，pH7.0-8.5，1mM EDTA中洗涤包涵体。
此外可以用温和去垢剂TritonX-100洗涤去除膜碎片和膜蛋白。
同时，因为去垢剂的洗涤能力会随溶液离子强度升高而加强，所以在洗涤包涵体时可加入低浓度的尿素或高浓度的NaCl，使包涵体的纯度达到50%以上。
包涵体的溶解变性剂如尿素、盐酸胍，主要是通过离子间的相互作用，打断包涵体蛋白分子间的各种化学键，使多肽延伸。
盐酸胍是较尿素强的变性剂，它能溶解尿素不溶的包涵体。
SDS、正十六烷基三甲基铵氯化物、Sarkosyl等也可以破坏蛋白内的疏水键，溶解一些包涵体蛋白质。
另外，从某些含有半胱氨酸的蛋白质中分离出的包涵体，通常含有一些链间形成的二硫键和链内的非活性二硫键，这就还需加入还原剂，如巯基乙醇、二硫基苏糖醇（DTT）、二硫赤藓糖醇、半胱氨酸等。
这种还原性试剂能够同半胱氨酸形成各种二硫化物中间体，也会被复性用的二硫化物置换试剂所取代。
二硫键的形成和断裂是可逆的，直到最有利的蛋白二硫键形成，这个平衡才会被破坏。
常用变性剂对比尿素（8-10M）较盐酸胍慢而弱，溶解度为70-90%用尿素溶解具有不电离，呈中性，成本低，蛋白质复性后除去不会造成大量蛋白质沉淀溶解的包涵体可选用多种色谱法纯化盐酸胍（6-8M）溶解能力达95%以上，且溶解作用快而不造成重组蛋白质的共价修饰成本高、在酸性条件下易产生沉淀、复性后除去可能造成大量蛋白质沉淀对蛋白质离子交换色谱有干扰包涵体的复性复性是指通过去除变性剂使目标蛋白从完全伸展的变性状态恢复到正常的折叠结构，同时去除还原剂确保二硫键正常形成。
包涵体蛋白复性的几种方法
基因重组蛋白包涵体的复性研究
蛋白质与介质的疏水 性相互结合
rhIFN-γ，rhIFN-β， 重组人粒细胞集落刺激因子rhGC-CSF
离子交换色谱 蛋白质与介质间存在 Papiloma virus(HPV)， E7MS2 fusion protein，
（IEC）
电荷作用力
重组白细胞分泌抑制因子rSLPI，抗原疫苗蛋白
亲和色谱 （AFC）
需要进行蛋白质翻译后修饰（如糖基化）就具有生物 活性的基因工程蛋白
基因重组蛋白包涵体的复性研究
51％
基因重组蛋白包涵体的复性研究
8.2 包涵体的形成
在大肠杆菌中表达的基因工程蛋白常常以包涵体的形式 沉积于细胞内，表现为无活性的不溶性聚集物
包涵体：外源目的基因在宿主系统中高水平表达时，因各 种原因导致基因表达产物的一级结构（即氨基酸序列）虽 然正确，而其高级结构是错误的，即：没有生物活性的包 涵体。包涵体直径约0.5-1μm，具有很高的密度（约1.3 mg/ml），相差显微镜下有折光性，呈非水溶性，只溶于高 浓度变性剂如尿素、盐酸胍等。
• 由于I向N转化是一个慢的过程，当蛋白质在此时放置较长 的一段时间，I就可以慢慢地向N转化
基因重组蛋白包涵体的复性研究
影响复性效率的因素
• 4）氧化还原环境
• 复性不仅要降低或去除变性剂，同时必须提供SH-氧化形 成S-S的环境→合适的氧化还原环境
• 采用配对的氧化型和还原型巯基物质 • 配对低分子量巯基试剂包括GSSG/GSH、半胱氨酸或巯基
基因重组蛋白包涵体的复性研究
包涵体形成的几种可能性
• 研究发现：低表达时很少形成包涵体，表达量越高越易形成包涵体。 • 1）少量蛋白产生时是可溶的，表达量过高，积聚量超过其在细胞
内溶解度时沉淀； • 2）合成速度太快，以至于没有足够的时间进行折叠，二硫键不能
包涵体表达的蛋白的复性
包涵体表达的蛋白的复性摘要综述了包涵体形成、包涵体分离和溶解、包涵体折叠复性的方法、复性产率低下的主要因素以及通过分子伴侣、低分子量添加物等的应用而提高了蛋白质复性产率。
关键词包涵体蛋白质复性Abstract Strategies for decreasing the formation of inclusion bodies, isolation and resolution of inclusion bodies, refolding of inclusion body proteins and the cause of decreased refolding yields were included. Renaturation yield of recombinant protein have been improved by using some additives, such as molecular chaperone, small molecules.Key words inclusion body , protein , renaturation外源基因在大肠杆菌中的高表达常常导致包涵体的形成，虽然包涵体具有富集目标蛋白质、抗蛋白酶、对宿主毒性小等优点，但包涵体蛋白质的复性率一般都很低,而分子伴侣、低分子量添加物等在复性过程中的应用及新的复性方法的建立都大大提高了重组蛋白质复性产率。
一、包涵体：1.1包涵体的定义、组成与特性：包涵体是指细菌表达的蛋白在细胞内凝集，形成无活性的固体颗粒。
一般含有50%以上的重组蛋白，其余为核糖体元件、RNA聚合酶、内毒素、外膜蛋白ompC、ompF和ompA等，环状或缺口的质粒DNA，以及脂体、脂多糖等，大小为0.5-1um，具有很高的密度（约1.3mg/ml），无定形，呈非水溶性，只溶于变性剂如尿素、盐酸胍等。
NMR等新技术的应用表明包涵体具有一定量的二级结构，他们可能在复性的启动阶段中具有一定的作用。
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包涵体溶解后，蛋白质成为失去了生物学活性伸展肽链
快
慢
天然态N
局部肽段先由氢键形成一些 二级结构构象单元，如α螺 旋、β折叠、β转角等
蛋白质复性机理
伸展态U
中间体I
蛋白质复性过程中，涉及两种疏水相互作用：
一是分子内的疏水相互作用
聚集体A
→促使蛋白质正确折叠 二是肽链分子间的疏水相互作用→导致蛋白质分子间聚集，形 成寡聚体和多聚体→再进一步聚集形成沉淀
复性液 浓 缩 ( 用 截 留 10kDa 的 超 滤 器 浓 缩 100 倍 ) ， 透 析 后 离 心 (15000r/min离心30min) 浓缩上清液
Sephacryl s-200柱层析分离：层析柱2100cm，pH 8.0 50mM Tris-HCl buffer 平衡洗脱
蛋白质体外复性的常用方法
(包涵体+8M 尿素 pH 8.0 50mM Tris-HCl buffer 0.2 mM EDTA, 10mM DTT室温搅拌2h, 离心(15000r/min, 30min)
例：人-干扰素的后处理工艺
变性蛋白液
稀释(取1份变性液+99份上述buffer(不含DTT与尿素)，使尿 素终浓度小于0.1M，4C下搅拌24h）
影响复性效率的因素
3）变性剂浓度和复性时间
在高浓度变性剂存在时，蛋白质主要以U存在（6mol/L 盐 酸胍、8mol/L Urea等）；在中间浓度时（较低浓度的盐 酸胍和Urea），主要以I存在，即能抑制蛋白质分子间的 疏水相互作用，又不会妨碍蛋白质分子内疏水相互作用 →A方向被阻止。 由于I向N转化是一个慢的过程，当蛋白质在此时放置较长 的一段时间，I就可以慢慢地向N转化
Refolded bioactive monomer
aggregate
IB in E.coli
固相复性的流程
多聚-Lys蛋白对肝素
变性剂去除 -琼脂糖凝胶具有较 强亲和活性
吸 附
固相基质： 肝素-琼 脂糖凝胶
柱上复性
洗脱
亲和层析
离子交换
用离子交换层析复性马细胞色素C、卵清蛋白、 凝乳酶原
疏水层析
影响复性效率的因素
2）蛋白质的复性浓度
I向N的转化是一级反应，而聚沉是二级或多级反应
聚沉的反应速度与蛋白质浓度的平方或高次方成正比 而复性反应过程与蛋白质浓度的一次方成正比，故浓度越 大，聚沉反应越明显。 →复性时蛋白质浓度宜低（低浓度时，获得的蛋白质复性 效率比高浓度要好的多） 另一方面浓度过低又给后处理带来不便，一般选择10－ 100μg／ml，以避免分子间相互作用力引起聚集。
下游加工过程的一般流程
不溶物的去除
理 与 固 液 分 离 1 发 酵 液 的 预 处
发酵液预处理
路线二
细胞－胞内产物 细胞破碎
细胞分离
路线一
清液－胞外产物
路线二B
包涵体
路线二A
碎片分离
溶解(盐酸胍、脲)
复 性 2、初步纯化(盐析、萃取、超滤等) 3、高度纯化(层析、电泳)脱盐浓缩 4、成品加工精制(结晶、干燥)
3）供给丰富的培养基，创造最佳培养条件，如供氧、 pH等。
包涵体形成：Advantages
1、包涵体形式表达的蛋白质浓度比较高，有时甚至可以达 到细胞总蛋白含量的40% 2、重组蛋白质以包涵体形式存在→包埋了酶攻击的位点， 可以最大限度地抵抗蛋白质酶的攻击 3、分离比可溶蛋白质的分离方法简便，造价低，使用简单 的离心或者过滤的手段就能使包涵体与宿主细胞的其他蛋白 质成分进行有效的分离 4、有些表达的外源蛋白质对细胞有毒性或者致死，大量表 达时会导致细胞的死亡，最终的细胞数量和产物相当低； 而包涵体形式的蛋白质因丧失了生物活性→高效地表达
影响复性效率的因素
4）氧化还原环境
复性不仅要降低或去除变性剂，同时必须提供SH-氧化形 成S-S的环境→合适的氧化还原环境
采用配对的氧化型和还原型巯基物质 配对低分子量巯基试剂包括GSSG/GSH、半胱氨酸或巯基 乙醇/胱氨酸等。通常还原型巯基物质的使用浓度为 l~3mmol/L，还原型/氧化型的摩尔比为10：1或5：1。
影响复性效率的因素
6）折叠促进剂
能够促进蛋白再折叠的化学物质统称为折叠促进剂，折叠 促进剂的作用原理在于稳定复性蛋白质的天然结构、抑制 肽链间的疏水相互作用。 应用于蛋白质复性并具有显著效果的折叠促进剂有表面活 性剂、聚乙二醇PFG、L－精氨酸、抗体、分子伴侣等。
包涵体的分离和蛋白质的复性
一、包涵体的形成
在大肠杆菌中表达的基因工程蛋白常常以包涵体的形式 沉积于细胞内，表现为无活性的不溶性聚集物 包涵体：外源目的基因在宿主系统中高水平表达时，因各 种原因导致基因表达产物的一级结构（即氨基酸序列）虽 然正确，而其高级结构是错误的，即：没有生物活性的包 涵体。包涵体直径约0.5-1μm，具有很高的密度（约1.3 mg/ml），相差显微镜下有折光性，呈非水溶性，只溶于高 浓度变性剂如尿素、盐酸胍等。
由于蛋白质的多样性、结构和折叠过程的复杂性，使得人 们不能对一种复性方法进行简单的移植，也很难找到具有 普适性而又低成本的高效复性方法。 实际操作过程中必须针对每种目标蛋白的特点 对影响复性的各个因素逐一优化 才能最终确定适用于该种蛋白质的复性方法
一般说来，在优化的条件下，大多数蛋白质体外复性效率 在20%左右
包涵体形成的几种可能性
研究发现：低表达时很少形成包涵体，表达量越高越易形成 包涵体。 1）少量蛋白产生时是可溶的，表达量过高，积聚量超过其在 细胞内溶解度时沉淀； 2）合成速度太快，以至于没有足够的时间进行折叠，二硫键 不能正确配对；
3）蛋白产生量过多，所需其他成分(如折叠酶和一系列翻译 后修饰酶及分子伴侣等)不足；
影响复性效率的因素
5）pH和温度
最适宜的复性pH值应大于7.0（一般8.0-9.0），以防止自 由SH-的质子化作用影响正确配对的S-S的形成。 应避免在蛋白质pI处进行复性（蛋白质的静电排斥力几乎 为零，相互间疏水作用区域就容易作用而形成A）。 温度过高，蛋白质的聚集将十分严重，低温下聚集和折叠 反应都很慢，随着温度的上升二者的速度都加快→常在室 温下进行
例：人-干扰素的后处理工艺
发酵液 离心(发酵液冷却至10C以下，4000r/min离心10min) 菌体
细胞破碎(1倍体积细胞+10倍体积PBS buffer, 冰浴超 声破碎5次, 30s/次, 4000r/min离心30min)，洗涤(0.1% Triton X-100溶液，1000r/min离心20min，重复三次) 包涵体提取变性
包涵体加工流程
机械破碎法
包涵体 提取
离
心
去除细胞碎片
（ 膜蛋白和脂类等）
如何对包涵体蛋白进行高效体外复性以获得活性产品是生物工程产 业化经常面临的一个难题
包涵体的洗涤
为除去包涵体上粘附的杂质，应用洗涤液洗涤包涵体沉淀 常用去污剂Triton X-l00或脱氧胆酸钠和低浓度变性剂（如 2mol/L尿素或盐酸胍等，注意：过高浓度的尿素或盐酸胍 会使包涵体溶解）洗涤以除去脂类和膜蛋白。 如：50mM Tris-HCl， pH7.0-8.5， 2M尿素，1mM EDTA
Using GF 凝胶过滤
由于凝胶基质微孔的体积排阻效应和减少的扩散效应，部 分折叠的蛋白质之间的相互作用受到有效的阻挡 →降低了发生聚集的可能性 可溶性的聚集物、复性的蛋白、变性剂和氧化还原剂依次 流出
固相复性（柱上复性）优缺点
优点：在蛋白质复性的同时，可使目标蛋白质与杂蛋白
分离达到纯化的目的，使复性和纯化同时进行；便于回收 变性剂，降低废水处理成本。
缺点：一旦复性时发生聚沉副反应，使得柱堵塞且不可
再生→经济损失较大
固相复性（柱上复性）装置
补充：蛋白质在E.coli中的表达
E.coli表达系统优点：
操作方便
遗传背景清楚 廉价培养基中迅速生长→发酵成本低、周期短 目的蛋白可获高水平表达 →E.coli是生产重组蛋白的首选表达系统，特别是对那 些不需要进行蛋白质翻译后修饰（如糖基化）就具有 生物活性的基因工程蛋白
51％
稀释和透析复性法 折叠促进剂协助复性法：表面活性剂、PEG、分子伴侣等 反相胶团复性法、双水相体系复性法 层析折叠复性（固相复性）：凝胶过滤层析（GF）、亲 和层析（AFC） 、离子交换层析（IEC） 、疏水层析 （HIC）等
refolding Solubilized IB(unfolded)
→两者互相竞争，影响蛋白质复性收率。 →复性过程中，抑制肽链间的疏水相互作用以防止聚集，是提 高复性收率的关键。
影响复性效率的因素
1）蛋白质本身的性质
有些蛋白非常容易复性，如牛胰RNA酶有12对二硫键， 在较宽松的条件下复性效率可以达到95%以上，而有一些 蛋白至今没有发现能够对其进行复性的方法如IL-11； 一般说来，在优化的条件下，大多数蛋白质体外复性效率 在20%左右
生化分离工程
第十一章 基因重Biblioteka 蛋白包涵体的分离和复性基因工程表达产物后处理的特殊性
包涵体的分离和蛋白质复性
随着基因工程技术的迅猛发展，人们可以在外来宿主 细胞中控制目的蛋白质的生产，从而为临床和工业生 产提供一些因自然原料缺乏而无法大量获得的蛋白质 多肽产品。 迄今为止，人们已经成功地实现了用多种原核、真核 表达系统生产基因工程蛋白