包涵体蛋白溶解和纯化复性
包涵体蛋白质复性纯化
IEX Q Sepharose FF
Belew, M. et al. (1994) J.Chromatogr. A, 679: 67-83
GF Superdex 75 Prep Grade
E.g2:
大肠杆菌包涵体表达 (His)6 融
合蛋白的扩增，纯化和复性过程细胞培养 收获细胞 细胞破碎
32
离心 5 - 10 000g
2.去垢剂：如强的阴离子去垢剂SDS，可以 破坏蛋白内的疏水键，避免蛋白形成疏水核 心，可以增溶几乎所有的蛋白。但由于SDS 无法彻底的去除而不允许在制药过程中使用 （研究）。
3.极端pH：可以破坏蛋白的次级键从而增溶蛋 白。如在pH>9.0溶解牛生长激素和牛凝乳蛋白 酶包涵体。有些蛋白可以溶解在60mMHCl中。 这些方法只适合于少部分蛋白的增溶。
Market Proportion by Host Cells
(biopharmaceutical proteins or ”Pharmateins”)
Yeast: 28%
E. coli: 54%
Animal cell: 21% E. coli inclusion body route
occupies about a half
1.采用高浓度的变性剂，使其形成伸展的 肽链。常用的变性剂有尿素（8M）、盐酸胍 （GdnHCl 6-8M），通过离子间的相互作用， 破坏包涵体蛋白间的氢键而增溶蛋白。尿素的 增溶效果稍差，异氰硫酸胍（GdnSCN）最强。
变性剂的使用浓度和作用时间：一般在偏碱性的环 境中如pH8.0-9.0，尿素在碱性环境中不稳定。有些蛋 白只能用盐酸胍。增溶时一般室温过夜，但盐酸胍在 37度1小时便可以使多数蛋白完全变性溶解。
包涵体蛋白的纯化和复性
包涵体蛋白的纯化和复性包涵体蛋白的纯化和复性1．菌体的收集和破碎用50 ml离心管分别收集诱导表达后的培养物，8000 rpm 4℃离心10 min。
沉淀用适量的超声破菌缓冲液重悬。
【备注】超声破菌缓冲液（20 mmol/L Tris-HCl pH8.0、0.5 mol/L NaCl、1 mmol/L EDTA、1 mg/mL溶菌酶）重悬后的菌液于冰浴中进行超声波破碎，其条件为：功率为300W，占空比50%，每个循环30 s，总时间20 min。
破碎后的匀浆，4℃、 12000 rpm离心15 min。
分别取上清液和沉淀进行12% SDS-PAGE分析，确定目的蛋白是否以包涵体的形式表达。
2．包涵体的处理洗涤：沉淀用适量的包涵体洗涤缓冲液重悬后，搅拌洗涤20~30 min，于4℃，12000 rpm离心15 min，弃去上清液。
重复一次。
再用适量的50 mmol/L Tris pH8.0溶液洗涤一遍（以去除残留的EDTA），于4℃ 12000 rpm离心15 min，弃去上清液。
【备注】包涵体洗涤缓冲液（20 mmol/L Tris－HCl pH 8.0，0.5 mol/L NaCl，2 mol/L尿素，2％ Triton）2％Triton X-100溶液：量取2mlTriton X-100(聚乙二醇辛基苯基醚)液，加M缓冲液98ml即可。
溶解：沉淀用适量的包涵体溶解缓冲液重悬，室温搅拌5-6小时或过夜。
12000 rpm 4℃离心15 min，收集上清液。
【备注】包涵体溶解缓冲液（20 mmol/L Tris－HCl pH 8.0，0.5 mol/L NaCl，8 mol/L尿素，0.2 mmol/L DTT或100 mmol/L β-巯基乙醇，2％Triton）3．目的蛋白的纯化亲和层析基于目的蛋白与固相化的配基特异结合而滞留，其他杂蛋白会流过柱子。
谷胱甘肽S-转移酶（GST）是最常用的亲和层析纯化标签之一，带有此标签的重组蛋白可用交联谷胱甘肽的层析介质纯化，但本方法有以下缺点：首先，蛋白上的GST必须能合适的折叠，形成与谷胱甘肽结合的空间结构才能用此方法纯化；其次，GST标签多达220个氨基酸，如此大的标签可能会影响表达蛋白的可溶性，使形成包涵体，这会破坏蛋白的天然结构，难于进行结构分析，有时即便纯化后再酶切去除GST标签也不一定能解决问题。
包涵体变性、复性及纯化
一、菌体的裂解1、怎样裂解细菌？细胞的破碎方法1.高速组织捣碎：将材料配成稀糊状液，放置于筒内约1/3体积，盖紧筒盖，将调速器先拨至最慢处，开动开关后，逐步加速至所需速度。
此法适用于动物内脏组织、植物肉质种子等。
2.玻璃匀浆器匀浆：先将剪碎的组织置于管中，再套入研杆来回研磨，上下移动，即可将细胞研碎，此法细胞破碎程度比高速组织捣碎机为高，适用于量少和动物脏器组织。
3.超声波处理法：用一定功率的超声波处理细胞悬液，使细胞急剧震荡破裂，此法多适用于微生物材料，用大肠杆菌制备各种酶，常选用50-100毫克菌体/毫升浓度，在1KG至10KG 频率下处理10-15分钟，此法的缺点是在处理过程会产生大量的热，应采取相应降温措施，时间以及超声间歇时间、超声时间可以自己调整，超声完全了菌液应该变清亮，如果不放心可以在显微镜下观察。
对超声波及热敏感的蛋白和核酸应慎用。
4.反复冻融法：将细胞在-20度以下冰冻，室温融解，反复几次，由于细胞内冰粒形成和剩余细胞液的盐浓度增高引起溶胀，使细胞结构破碎。
5.化学处理法：有些动物细胞，例如肿瘤细胞可采用十二烷基磺酸钠（SDS）、去氧胆酸钠等细胞膜破坏，细菌细胞壁较厚，可采用溶菌酶处理效果更好，我用的浓度一般为1mg/ml。
无论用哪一种方法破碎组织细胞，都会使细胞内蛋白质或核酸水解酶释放到溶液中，使大分子生物降解，导致天然物质量的减少，加入二异丙基氟磷酸（DFP）可以抑制或减慢自溶作用；加入碘乙酸可以抑制那些活性中心需要有疏基的蛋白水解酶的活性，加入苯甲磺酰氟化物（PMSF）也能清除蛋白水解酶活力，但不是全部，而且应该在破碎的同时多加几次；另外，还可通过选择pH、温度或离子强度等，使这些条件都要适合于目的物质的提取。
这是标准配方:裂解液：50mM Tris-HCl(pH8.5~9.0), 2mM EDTA, 100mM NaCl, 0.5% Triton X-100, 1mg /ml溶菌酶。
包涵体的纯化和复性总结--最全的前人经验
<包涵体的纯化和复性总结二、包涵体的洗涤1、包涵体的洗涤问题通常的洗涤方法一般是洗不干净的，我以前是这么做的，先把包涵体用6M盐酸胍溶解充分，过滤除去未溶解的物质，注意留样跑电泳，然后用水稀释到4M,离心把沉淀和上清分别跑电泳，如此类推可以一直稀释到合适的浓度，你可以找到一个合适去除杂质的办法，其实这就是梯度沉淀的方法，我觉得比通常的直接洗脱效果好。
包涵体一般难溶解，所以你要注意未溶解的部分，你可以跑电泳对比，因为有时候难溶解的就是你的目标蛋白，所以每次处理都要把上清和沉淀跑电泳对比，免得把目标蛋白弄丢了。
此外刚处理完的包涵体好溶解。
冷冻后难溶解，溶解也需要长点时间，也需要大量的溶剂。
如果说是不少不溶解的不是你要的，那就不用管了。
2、如何得到比较纯的包涵体对于包涵体的纯化，包涵体的前处理是很重要的。
包涵体中主要含有重组蛋白,但也含有一些细菌成分,如一些外膜蛋白、质粒ＤＮＡ和其它杂质。
洗涤常用1%以下的中性去垢剂，如Tween、Triton、Lubel和NP40等加EDTA和还原剂2-巯基苏糖醇（DTT）、β-巯基乙醇等反复多次进行，因去垢剂洗涤能力随溶液离子强度升高而加强，在洗涤包涵体时可加50 mM NaCL。
这样提取的包涵体纯度至少可达50%以上，而且可保持元结构。
也可用低浓度的盐酸胍或尿素/中性去垢剂/EDTA/还原剂等洗去包涵体表面吸附的大部分不溶性杂蛋白。
洗涤液pH以与工程菌生理条件相近为宜，使用的还原剂为0.1-5mM。
EDTA为0.1-0.3 mM。
去垢剂如Triton X-100、脱氧胆酸盐和低浓度的变性剂如尿素充分洗涤去除杂质,这一步很重要,因为大肠杆菌外膜蛋白Omp T(37 KDa)在4-8mol/L尿素中具有蛋白水解酶活性,在包涵体的溶解和复性过程中可导致重组蛋白质的降解。
对于尿素和盐酸胍的选择：尿素和盐酸胍属中强度变性剂，易经透析和超滤除去。
它们对包涵体氢键有较强的可逆性变性作用，所需浓度尿素8-10M，盐酸胍6-8M。
包涵体蛋白质复性即纯化策略
(a) 0.5% SDS, (b) 8M urea, (c) 6M GuHCl at pH 9.0, RT except one buffer with (d) GuHCl at 4C. Dissolution efficiency was determined as the mass of the monomeric proteins detected by RP-HPLC divided by that of the total expressed proteins
Loading
(7M urea-solubilized IB)
Chasing
Urea washing
(Refolding)
Elution (1M NaCl)
Regeneration
Chromatogram from column refolding
Example page: Effect of Solution pH
Effect of pH on rhGH-GST Inclusion Body Dissolution
6 5 4 3 2 1 0
(e) (f) (g) (h)
Washed IB was placed in NaHCO3 buffer containing 0.5% SDS at pH (e) 5.0 (f) 7.0 (g) 9.5 (h) 12
- However, cleaving the fusion partner away from the refolded
protein can be costly and problematic.
• PEG (polyethyleneglycol)
- Some non-ionic surfactants such as PEG and Tween are
包涵体蛋白复性的方法简介与操作
活性蛋白整体方案包涵体蛋白复性的方法简介与实验操作摘要：本文主要讲解了包涵体蛋白复性的技术的原理及操作方法，并附有相关案例。
包涵体的纯化和复性总结包涵体折叠复性的方法应具备以下几个特点：较高的活性蛋白质回收率；复性产物易于与错误折叠蛋白质分离；折叠复性后能够得到较高浓度的蛋白；折叠复性方法易于放大等。
蛋白复性的过程通常分为以下几个步骤：包涵体的洗涤包涵体在溶解之前需要进行洗涤，包涵体中主要含有重组蛋白，但也含有一些杂质，如一些外膜蛋白、质粒DNA 等，这些杂质会与包涵体粘连在一起，可以通过洗涤去除大多数杂质，但无法将杂蛋白去除干净。
包涵体的洗涤通常选用浓度较低的变性剂，如2M尿素在50mM Tris，pH7.0-8.5，1mM EDTA中洗涤包涵体。
此外可以用温和去垢剂TritonX-100洗涤去除膜碎片和膜蛋白。
同时，因为去垢剂的洗涤能力会随溶液离子强度升高而加强，所以在洗涤包涵体时可加入低浓度的尿素或高浓度的NaCl，使包涵体的纯度达到50%以上。
包涵体的溶解变性剂如尿素、盐酸胍，主要是通过离子间的相互作用，打断包涵体蛋白分子间的各种化学键，使多肽延伸。
盐酸胍是较尿素强的变性剂，它能溶解尿素不溶的包涵体。
SDS、正十六烷基三甲基铵氯化物、Sarkosyl等也可以破坏蛋白内的疏水键，溶解一些包涵体蛋白质。
另外，从某些含有半胱氨酸的蛋白质中分离出的包涵体，通常含有一些链间形成的二硫键和链内的非活性二硫键，这就还需加入还原剂，如巯基乙醇、二硫基苏糖醇（DTT）、二硫赤藓糖醇、半胱氨酸等。
这种还原性试剂能够同半胱氨酸形成各种二硫化物中间体，也会被复性用的二硫化物置换试剂所取代。
二硫键的形成和断裂是可逆的，直到最有利的蛋白二硫键形成，这个平衡才会被破坏。
常用变性剂对比尿素（8-10M）较盐酸胍慢而弱，溶解度为70-90%用尿素溶解具有不电离，呈中性，成本低，蛋白质复性后除去不会造成大量蛋白质沉淀溶解的包涵体可选用多种色谱法纯化盐酸胍（6-8M）溶解能力达95%以上，且溶解作用快而不造成重组蛋白质的共价修饰成本高、在酸性条件下易产生沉淀、复性后除去可能造成大量蛋白质沉淀对蛋白质离子交换色谱有干扰包涵体的复性复性是指通过去除变性剂使目标蛋白从完全伸展的变性状态恢复到正常的折叠结构，同时去除还原剂确保二硫键正常形成。
包涵体提出、纯化、复性必胜技
下列方法已在本实验室验证，复性任何包涵体，必定能得到目的蛋白：菌体为超声法裂解，裂解溶液中含50mM Tris-HCl, pH 8.0，100mM NaCl，5mM EDTA，0.1% NaN3，0.5% Triton-X100，在使用前加入 0.1mM PMSF每250毫升裂解液中加入约50克菌体，工作15s，间隔15秒，超声破碎45分钟，超声后加入10mM MgSO4 和0.1mg/ml 的溶菌酶和Dnase 0.01mg/ml，室温放置20分钟，6000RPM离心15分钟，保留沉淀。
再次加入裂解液，超声破细胞后，加溶菌酶和Dnase, 上述过程重复三次。
用下述的溶液将包涵体悬浮，离心收集包涵体。
50mM Tris-HCl, pH 8.0100mM NaCl5mM EDTA0.1% NaN3用下述溶液悬浮包涵体，离心收集包涵体。
50mM Tris-HCl, pH 8.0100mM NaCl5mM EDTA0.1% NaN31M 尿素如暂时不用，放入－20℃保存。
包涵体的溶解将包涵体悬浮在下述溶液中，4℃振荡过夜。
100mM Tris50mM Glycine8.5M 尿素溶液用HCl调节到pH 8.0后加入25mM DTT6000RPM离心，取上清，去除不溶解物。
包涵体蛋白的复性将溶解的包涵体装入透析袋，在4℃下将透析袋浸入下列溶液依次透析：0.1M Tris0.4M L-Arginine1 mM EDTA0.2mM PMSF4M 尿素溶液pH调节到8.0透析24小时0.1M Tris0.4M L-Arginine1 mM EDTA0.2mM PMSF2M 尿素溶液pH调节到8.0透析24小时0.1M Tris0.4M L-Arginine1 mM EDTA0.2mM PMSF1M 尿素溶液pH调节到8.0透析24小时0.1M Tris0.4M L-Arginine1 mM EDTA0.2mM PMSF0 M 尿素溶液pH调节到8.0透析24小时0.025M Tris0.1M L-Arginine0.25 mM EDTA0.2mM PMSF0 M 尿素溶液pH调节到8.0透析24小时10mM Tris-HCl pH8.0150mM NaCl,1mM EDTA0.02% NaN3.透析24小时透析时注意透析袋的截留分子量下面的工作就简单了，因为复性的蛋白已经在生理缓冲液中，进行阴阳离子交换层析爱怎么整就怎么整它了。
包涵体蛋白纯化步骤
包涵体蛋白纯化步骤生物日记部落，这次将会擦掉黑板上曾经书写的知识笔记，转角进入“包涵体蛋白”。
包涵体蛋白纯化的步骤主要包括裂解、洗涤、溶解、复性、纯化。
在实验前线着手于瓶瓶罐罐的大家，实验所纠结的问题或许总会缠绕身前身后，闯入梦中。
在情理之中时，又是怎么看待“处理实验问题”的态度？两天一个周期的实验结束，没有结果，暂且随之不作为，接着重复做一次。
小伙伴们，这是一种正确的态度么？“如果你的工具只有一柄铁锤，你就可能认为所有的问题都是铁钉”。
回想，变通，将路延伸在嘴巴上请教，预测时间进程，交叉重复，这是在过去灰色的记忆里想起的一位老师给我讲的一种态度。
将态度按照个人的素养去演绎变幻，就会有多条路，意外到问题本身。
——看的见的问题是态度本身包涵体蛋白纯化步骤包涵体洗涤包涵体溶解包涵体复性包涵体纯化1、包涵体裂解细胞内重组蛋白的提取要依照蛋白的来源和性质选择合适的方法，蛋白一般来源于细菌、植物、哺乳动物细胞等。
细胞裂解常用的方法有：酶解法、研磨、匀浆、超声破碎法、冻融等。
（1） 细胞酶解：在稀释菌液中加入0.2-0.4 mg/ml 溶菌酶、1 mM MgCl 2、20 μg/mlDNase 、1mM PMSF ，混均匀，冰上或者室温放置30 min 。
根据目的蛋白对温度的敏感性选择合适的温度。
向着太阳是向日葵不变的态度（2）机械裂解：加入1% Triton X-100,充分混匀，冰上放置15 min，在冰上用超声波破碎细胞10 min，至细胞变澄清，或在-20℃下冰冻，室温溶解，反复冻融5次以上；4 ℃，5000 r/min离心15 min，弃上清，用0.45 μm或0.22 μm的滤膜过滤除去细胞碎片；在细胞裂解时应该注意：a 尽量选择比较温和的处理方法，避免太剧烈地操作导致目的蛋白变性，或者蛋白酶释放。
b 为了保持蛋白质的稳定性，在蛋白的提取时应迅速，低温，添加蛋白酶抑制剂，例如，加入DFP（二异丙基氟磷酸）抑制或者减慢自容，加入碘乙酸抑制巯基作用的蛋白水解酶活性，加入PMSF（苯甲磺酰基氟化物）抑制蛋白水解酶的活性，另外，选择合适的缓冲溶液稳定蛋白溶液的PH值及离子强度，添加DNA酶降低核酸的粘稠度。
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IFN-α重组蛋白包涵体溶解和蛋白纯化复性
一、表达产物处理
1、表达菌液8000rpm 4℃离心10min
2、菌体沉淀按10:1（菌重5g，加50ml）裂解缓冲液，冰上超声至清亮（250W，超声5s，间歇5s，功率35%）
3、取样取100ul 超声菌液并离心，标记超声上清，超声沉淀
4、12000g 4℃离心15min，上清备用，标记超声上清
5、超声沉淀用含2M 尿素的裂解缓冲液，以20:1 比例重悬，继续超声5min
6、12000g 4℃离心20min
7、超声沉淀用含1% Triton X-100 的裂解缓冲液重悬，4℃放置10min
8、12000g 4℃离心15min，获得包涵体
9、获得包涵体用Binding Bufer 重悬，4℃放置过夜
二、包涵体的纯化
1、放置过夜包涵体4℃高速离心，收集上清备用
2、取样取离心上清，标记柱前
3、使用Ni-NTA 基质进行纯化，用Binding Buffer 平衡Ni 柱，柱子平衡后低流速上样，整个上样过程使样品处于冰上，上样后用3~5 个柱体积的Wash Buffer 进行漂洗，最后用Elution Buffer 洗脱
4、取样取柱后，标记柱后
三、包涵体复性
1、透析袋处理方法：把透析袋剪成适当长度（10~20cm）小段，在大体积的2% （W/V）NaHCO 3 和1mM EDTA (PH8.0)中将透析袋煮沸10min。
用蒸馏水彻底清洗透析袋。
放在1mM EDTA(PH8.0)中将之煮沸10min。
冷却后存放于4℃，必须确保透析袋始终浸没在溶液内。
从此时起取用透析袋时必须戴手套保持清洁，用前在透析袋内装满水然后排出，将之清洗干净
2、复性采用梯度透析法，纯化后包涵体用含4M 尿素的透析缓冲液稀释蛋白浓度至约
100ug/ml，从4M、2M、2M、0.5M 依次降低透析液中尿素浓度，每个浓度均4℃透析，4~6h 换新鲜透析液一次，高速离心去除沉淀。
最后用PBS(PH7.2) 4℃透析过夜。
高速离心去除沉淀，超滤浓缩
试剂盒
Ni-Agarose His标签蛋白纯化试剂盒（康为）市场价¥398
配制溶液
裂解缓冲液500ml
50mM Tris
50mM Nacl
5%甘油
含2M 尿素裂解缓冲液250ml
50mM Tris
50mM Nacl
5%甘油
2M 尿素
含1% Triton X-100 裂解缓冲液250ml 50mM Tris
50mM Nacl
5%甘油
1% Triton X-100
Binding Buffer (PH8.0) 500ml
0.1M NaH 2 PO 4
0.01M Tris-Cl
8M 尿素Wash Buffer (PH6.3) 250ml
0.1M NaH 2 PO 4
0.01M Tris-Cl
8M 尿素
Elution Buffer (PH4.5) 250ml 0.1M NaH 2 PO 4
0.01M Tris-Cl
8M 尿素
透析袋处理液(PH8.0) 1L
2% NaHCO 3
1mM EDTA
透析缓冲液（PH7.2）各500ml 4M /2M/1M/0.5M 尿素
20mM PB（PH7.4）
0.2M PB (PH7.4) 1L
19ml 0.2M NaH 2 PO 4
81ml 0.2M Na 2 HPO 4
10mM PBS (PH7.2) 1L
50ml 0.2M PB
NaCl 8.5~9g
加水至1L。