包涵体溶解及蛋白纯化
包涵体纯化蛋白复性的方法操作流程
包涵体纯化蛋白复性的方法操作流程返回:包涵体复性常见问题分析与解决包涵体的纯化和复性总结包涵体折叠复性的方法应具备以下几个特点：较高的活性蛋白质回收率;复性产物易于与错误折叠蛋白质分离；折叠复性后能够得到较高浓度的蛋白；折叠复性方法易于放大等。
蛋白复性的过程通常分为以下几个步骤:包涵体的洗涤包涵体在溶解之前需要进行洗涤,包涵体中主要含有重组蛋白,但也有一些杂质,如一些外膜蛋白、质粒DNA等，这些杂质会与包涵体粘连在一起,可以通过洗涤去除大多数杂质,但无法将杂蛋白去除干净。
包涵体的洗涤通常选用浓度较低的变性剂，如2M尿素在50mM Tris，pH7。
0—8。
5，1mM EDTA中洗涤包涵体。
此外可以用温和去垢剂TritonX—100洗涤去除膜碎片和膜蛋白。
同时，因为去垢剂的洗涤能力会随溶液离子强度升高而加强,所以在洗涤包涵体时可加入低浓度的尿素或高浓度的NaCl，使包涵体的纯度达到50%以上。
包涵体的溶解变性剂如尿素、盐酸胍，主要是通过离子间的相互作用，打断包涵体蛋白分子间的各种化学键，使多肽延伸.盐酸胍是较尿素强的变性剂，它能溶解尿素不溶的包涵体.SDS、正十六烷基三甲基铵氯化物、Sarkosyl等也可以破坏蛋白内的疏水键，溶解一些包涵体蛋白质。
另外，从某些含有半胱氨酸的蛋白质中分离出的包涵体,通常含有一些链间形成的二硫键和链内的非活性二硫键,这就还需加入还原剂,如巯基乙醇、二硫基苏糖醇(DTT)、二硫赤藓糖醇、半胱氨酸等。
这种还原性试剂能够同半胱氨酸形成各种二硫化物中间体，也会被复性用的二硫化物置换试剂所取代。
二硫键的形成和断裂是可逆的，直到最有利的蛋白二硫键形成,这个平衡才会被破坏。
常用变性剂对比尿素较盐酸胍慢而弱，溶解度为用尿素溶解具有不电离,呈中性，成(8-10M）70-90%本低，蛋白质复性后除去不会造成大量蛋白质沉淀溶解的包涵体可选用多种色谱法纯化盐酸胍（6-8M）溶解能力达95%以上，且溶解作用快而不造成重组蛋白质的共价修饰成本高、在酸性条件下易产生沉淀、复性后除去可能造成大量蛋白质沉淀对蛋白质离子交换色谱有干扰包涵体的复性复性是指通过去除变性剂使目标蛋白从完全伸展的变性状态恢复到正常的折叠结构，同时去除还原剂确保二硫键正常形成。
包涵体的复性总结
包涵体的复性总结关于包涵体的复性是一个令人头疼的问题,已经成为生物制药的瓶颈,包涵体的复性前期准备工作尤为重要,关于包涵体的处理一般包括这么几步:菌体的破碎、包涵体的洗涤、溶解、复性以及纯化,实验内容比较庞杂、繁琐。
一、菌体的裂解菌体的破碎方法很多:高速组织捣碎、玻璃匀浆器匀浆、超声波处理法、反复冻融法、化学处理法。
无论用哪一种方法破碎组织细胞,都会使细胞内蛋白质或核酸水解酶释放到溶液中,使大分子生物降解,导致天然物质量的减少,不同的菌体蛋白需要加入不同的抑制剂:二异丙基氟磷酸(DFP)可以抑制或减慢自溶作用;碘乙酸可以抑制那些活性中心需要有疏基的蛋白水解酶的活性,苯甲磺酰氟化物(PMSF)也能清除蛋白水解酶活力,但不是全部,而且应该在破碎的同时多加几次;另外,还可通过选择pH、温度或离子强度等,使用这些条件时都要适合于目的物质的提取。
在实验室研究多采用超声波处理法和匀浆器匀浆法。
二、包涵体的洗涤通常的洗涤方法一般是难以洗干净的,包涵体中主要含有重组蛋白,但也含有一些细菌成分,如一些外膜蛋白、质粒DNA和其它杂质。
洗涤常用1%以下的中性去垢剂,如Tween、Triton、Lubel和NP40等加EDTA反复多次进行,因去垢剂洗涤能力随溶液离子强度升高而加强,在洗涤包涵体时可加50 mM NaCL。
也可用低浓度的盐酸胍或尿素/中性去垢剂/EDTA/还原剂等洗去包涵体表面吸附的大部分不溶性杂蛋白。
洗涤液pH以与工程菌生理条件相近为宜。
根据不同的菌体选用与之相应的洗涤液,比如:2 M尿素+50mm Tris-HCl+0.2 mM NaCl +1%Triton x-100+2mmEDTA PH8.0,再用缓冲洗涤一次。
此外,刚处理完的包含体好溶解,冷冻后难溶解,且溶解时间和比例都会加大。
三、包涵体的溶解强的变性剂如尿素、盐酸胍,是通过离子间的相互作用,打断包涵体蛋白质分子内和分子间的各种化学键,使多肽伸展,SDS、正十六烷基三甲基铵氯化物等去垢剂,可以破坏蛋白内的疏水键,也可溶解一些包涵体蛋白质。
包涵体的纯化和复性总结--最全的前人经验
包涵体旳纯化和复性总结ﻫ二、包涵体旳洗涤ﻫ1、包涵体旳洗涤问题ﻫ一般旳洗涤措施一般是洗不干净旳,我此前是这样做旳，先把包涵体用6M盐酸胍溶解充足,过滤除去未溶解旳物质，注意留样跑电泳，然后用水稀释到4M,离心把沉淀和上清分别跑电泳,如此类推可以始终稀释到合适旳浓度，你可以找到一种合适清除杂质旳措施，其实这就是梯度沉淀旳措施，我觉得比一般旳直接洗脱效果好。
ﻫﻫ包涵体一般难溶解,因此你要注意未溶解旳部分,你可以跑电泳对比，由于有时候难溶解旳就是你旳目旳蛋白，因此每次解决都要把上清和沉淀跑电泳对比,免得把目旳蛋白弄丢了。
ﻫ此外刚解决完旳包涵体好溶解。
冷冻后难溶解,溶解也需要长点时间,也需要大量旳溶剂。
如果说是不少不溶解旳不是你要旳，那就不用管了。
２、如何得到比较纯旳包涵体对于包涵体旳纯化,包涵体旳前解决是很重要旳。
ﻫ包涵体中重要具有重组蛋白,但也具有某些细菌成分,如某些外膜蛋白、质粒ＤＮA和其他杂质。
洗涤常用1%如下旳中性去垢剂，如Ｔwｅen、Trｉton、Ｌuｂｅｌ和ＮP40等加ＥDＴA和还原剂２-巯基苏糖醇（DTT）、β-巯基乙醇等反复多次进行,因去垢剂洗涤能力随溶液离子强度升高而加强，在洗涤包涵体时可加5０ mM ＮaCL。
这样提取旳包涵体纯度至少可达50％以上，并且可保持元构造。
也可用低浓度旳盐酸胍或尿素/中性去垢剂/ＥDTＡ/还原剂等洗去包涵体表面吸附旳大部分不溶性杂蛋白。
洗涤液ｐH以与工程菌生理条件相近为宜，使用旳还原剂为0.1-5ｍM。
EDTA为0.1-0.3 mＭ。
去垢剂如Tｒiton X-1０0、脱氧胆酸盐和低浓度旳变性剂如尿素充足洗涤清除杂质，这一步很重要,由于大肠杆菌外膜蛋白Oｍp T(37 KDa)在4-8mｏｌ/L尿素中具有蛋白水解酶活性,在包涵体旳溶解和复性过程中可导致重组蛋白质旳降解。
对于尿素和盐酸胍旳选择:尿素和盐酸胍属中强度变性剂，易经透析和超滤除去。
它们对包涵体氢键有较强旳可逆性变性作用,所需浓度尿素8－10Ｍ，盐酸胍6-8M。
包涵体纯化实验报告
一、实验目的1. 掌握包涵体纯化的基本原理和操作步骤。
2. 学习利用离子交换层析法对包涵体进行纯化。
3. 评估包涵体纯化效果，并探讨优化纯化条件的方法。
二、实验原理包涵体是细菌表达外源蛋白时形成的一种不溶性蛋白质聚集体。
由于包涵体中的蛋白质缺乏生物活性，因此需要通过一系列操作将其溶解、复性，并最终纯化得到具有生物活性的蛋白质。
本实验采用离子交换层析法对包涵体进行纯化，通过改变缓冲液中的离子强度和pH值，使包涵体中的蛋白质与层析柱上的亲和基团结合，从而实现蛋白质的分离和纯化。
三、实验材料1. 包涵体样品2. 离子交换层析柱3. 标准蛋白样品4. 标准缓冲液5. 蛋白质浓度测定试剂盒6. 超声波破碎仪7. 离心机8. 荧光分光光度计9. 数据处理软件四、实验步骤1. 包涵体样品的处理将包涵体样品用超声波破碎仪处理，使包涵体溶解。
然后将溶液离心，取上清液作为后续实验的样品。
2. 样品预处理将样品用缓冲液稀释，调整离子强度和pH值，使包涵体中的蛋白质与层析柱上的亲和基团结合。
3. 离子交换层析将预处理后的样品上柱，用缓冲液进行洗脱，收集洗脱液。
4. 蛋白质纯化效果评估采用蛋白质浓度测定试剂盒对洗脱液进行蛋白质浓度测定，比较不同洗脱液中的蛋白质浓度，评估纯化效果。
5. 数据处理与分析利用数据处理软件对实验数据进行统计分析，探讨优化纯化条件的方法。
五、实验结果1. 包涵体样品经过超声波破碎后，溶液变得清澈，说明包涵体已成功溶解。
2. 通过离子交换层析法，成功将包涵体中的蛋白质与层析柱上的亲和基团结合，实现了蛋白质的分离和纯化。
3. 通过蛋白质浓度测定，发现洗脱液中的蛋白质浓度明显高于未处理的样品，说明纯化效果良好。
4. 通过数据分析，发现改变缓冲液中的离子强度和pH值对包涵体纯化效果有显著影响。
在一定范围内，增加离子强度和降低pH值有利于提高蛋白质的纯化效果。
六、实验结论1. 本实验成功实现了包涵体的纯化，并获得了具有生物活性的蛋白质。
包涵体纯化方法及包涵体蛋白制备
包涵体纯化方法及包涵体蛋白制备重组蛋白在大肠杆菌、酵母、哺乳动物中的表达可分为三种形式：胞外分泌表达、胞内可溶性表达和胞内不溶性表达（即产物以包涵体形式存在）。
以包涵体形式存在的重组蛋白是无生物活性的，需要进行复性处理，然后再进行分离纯化。
包涵体纯化与传统生物大分子的分离纯化方法相似，即以分子的等电点、溶解性、亲疏水性以及与其它分子的亲和性等特征为基础进行纯化。
一、常用的包涵体纯化方法1. 金属亲和层析该方法主要利用蛋白质表面暴露的一些氨基酸残基和金属离子之间的相互作用来进行蛋白纯化。
我们在载体构建时可以加上一些亲和性标签（如His标签、GST标签、Flag标签等），以便采取亲和纯化的方式纯化蛋白。
利用Ni2+和6×His tag之间的亲和性，通过在蛋白的N端或C端加上6～10个组氨酸，在一般或变性条件下借助它与Ni2+螯合柱的紧密结合能力，采用咪唑洗脱，或降低PH使组氨酸充分质子化，使其不再与Ni2+结合，从而分离纯化出带有6×His tag的融合蛋白，纯度通常能达到90%以上。
2．离子交换层析离子交换层析是根据在一定pH条件下，蛋白质所带电荷不同而进行的分离的方法。
常用的离子交换剂有羧甲基纤维素（阳离子交换剂，弱酸型）和二乙基氨基乙基纤维素（阴离子交换剂，弱碱型）。
阴离子交换基质结合带有负电荷的蛋白质，所以这类蛋白质被留在柱子上，需要通过提高洗脱液中的盐浓度等措施将其洗脱下来。
根据蛋白质结合能力不同，洗脱的速度会存在差异，通常结合较弱的蛋白质先被洗脱。
反之，阳离子交换基质会结合带有正电荷的蛋白质，可以通过提高洗脱液的PH或增加洗脱液中的盐浓度将蛋白洗脱下来。
3．凝胶过滤层析凝胶过滤层析通常又称为分子筛方法，主要是根据蛋白质的大小和形状达到分离和纯化的目的。
一般是大分子先流出来，小分子后流出来。
此方法的优点在于层析所用的凝胶属于惰性载体，不带电荷并且吸附力弱，可较广的温度范围内进行。
基因工程包涵体的纯化方法
基因工程包涵体的纯化方法基因工程可真是个神奇的领域，像是现代科技的魔法师，把DNA这个小家伙们玩弄得团团转。
在这片神秘的土地上，包涵体就像是隐藏的宝藏，得先把它们找出来，再通过纯化的方法把这些小宝贝洗净，才能让它们为我们所用。
今天，我们就来聊聊基因工程包涵体的纯化方法，让这趟旅程轻松愉快。
1. 什么是包涵体？首先，包涵体可不是某种古怪的生物，它们其实是细胞在生产某些蛋白质时，形成的一种颗粒。
就像是做饭时，锅里油烟聚集的那些小油滴，虽然它们看起来不太好，但里面可藏着好东西。
你要知道，包涵体里面有大量的目标蛋白质，但通常它们会和其他杂质混在一起，像是大海捞针，得费点功夫才能捞出来。
1.1 包涵体的形成当细胞用上基因工程的技术，强行让某种蛋白质“上班”时，有时候它们就会不太乖，聚集成包涵体。
这就像你在做作业时，有的题目就特别难，结果一堆答案写错了，最后只好把它们堆到一边。
虽然包涵体一开始可能看起来像个废物，但其实它们是生产特定蛋白质的一种“副产品”。
1.2 包涵体的用途那包涵体有什么用呢？别小看了它们，它们可是制药、疫苗开发的重要角色。
有的包涵体能转化为活跃的蛋白质，成为我们需要的药物，甚至可以用于研究新治疗方法，简直就是科研界的“黑马”。
所以，找到它们、纯化它们，那可是相当重要的任务。
2. 包涵体的纯化步骤接下来，我们就要聊聊如何把这些包涵体给纯化出来，步骤其实不复杂，但得有点耐心。
2.1 细胞裂解首先，得把细胞给撬开，就像剥开一个鸡蛋，才能见到里面的蛋黄。
这里我们通常会用一些裂解缓冲液，像是加盐的水，帮助细胞膜变得松软。
然后，咱们可以用超声波处理、化学试剂或者冷冻融化的方式把细胞打散，让包涵体慢慢浮出来。
2.2 离心分离一旦细胞裂解，包涵体就会在液体中游荡。
这时候，就要用离心机来大显身手了。
离心机就像是一位厨师，用强大的“旋转功力”把细胞残骸和包涵体分开。
你可以想象，把一大锅汤放进离心机，旋转后，沉淀物就会在底下，清汤会在上面。
包涵体蛋白纯化步骤
包涵体蛋白纯化步骤生物日记部落，这次将会擦掉黑板上曾经书写的知识笔记，转角进入“包涵体蛋白”。
包涵体蛋白纯化的步骤主要包括裂解、洗涤、溶解、复性、纯化。
在实验前线着手于瓶瓶罐罐的大家，实验所纠结的问题或许总会缠绕身前身后，闯入梦中。
在情理之中时，又是怎么看待“处理实验问题”的态度？两天一个周期的实验结束，没有结果，暂且随之不作为，接着重复做一次。
小伙伴们，这是一种正确的态度么？“如果你的工具只有一柄铁锤，你就可能认为所有的问题都是铁钉”。
回想，变通，将路延伸在嘴巴上请教，预测时间进程，交叉重复，这是在过去灰色的记忆里想起的一位老师给我讲的一种态度。
将态度按照个人的素养去演绎变幻，就会有多条路，意外到问题本身。
——看的见的问题是态度本身包涵体蛋白纯化步骤包涵体洗涤包涵体溶解包涵体复性包涵体纯化1、包涵体裂解细胞内重组蛋白的提取要依照蛋白的来源和性质选择合适的方法，蛋白一般来源于细菌、植物、哺乳动物细胞等。
细胞裂解常用的方法有：酶解法、研磨、匀浆、超声破碎法、冻融等。
（1） 细胞酶解：在稀释菌液中加入0.2-0.4 mg/ml 溶菌酶、1 mM MgCl 2、20 μg/mlDNase 、1mM PMSF ，混均匀，冰上或者室温放置30 min 。
根据目的蛋白对温度的敏感性选择合适的温度。
向着太阳是向日葵不变的态度（2）机械裂解：加入1% Triton X-100,充分混匀，冰上放置15 min，在冰上用超声波破碎细胞10 min，至细胞变澄清，或在-20℃下冰冻，室温溶解，反复冻融5次以上；4 ℃，5000 r/min离心15 min，弃上清，用0.45 μm或0.22 μm的滤膜过滤除去细胞碎片；在细胞裂解时应该注意：a 尽量选择比较温和的处理方法，避免太剧烈地操作导致目的蛋白变性，或者蛋白酶释放。
b 为了保持蛋白质的稳定性，在蛋白的提取时应迅速，低温，添加蛋白酶抑制剂，例如，加入DFP（二异丙基氟磷酸）抑制或者减慢自容，加入碘乙酸抑制巯基作用的蛋白水解酶活性，加入PMSF（苯甲磺酰基氟化物）抑制蛋白水解酶的活性，另外，选择合适的缓冲溶液稳定蛋白溶液的PH值及离子强度，添加DNA酶降低核酸的粘稠度。
包涵体蛋白的纯化及复性讨论专贴
包涵体蛋白的纯化及复性讨论专贴！zbbnet wrote:最近实验遇到了大麻烦，说出来大伙帮忙想想法。
实验所用菌株为BL21，载体pMAL-p2X，与MBP融合表达，目的蛋白有三对二硫键。
最初的设计思想是想通过MBP的信号肽实现可分泌表达，但实验发现主要是包涵体表达。
菌体超声破碎后12000rpm离心，所获得的沉淀不能很好的贴在离心管底，而是处于部分溶解状态，对沉淀再作如下处理：1、2M尿素洗涤，pH8.5，12000rpm离心，获得的上清不是澄清透明而是略显混浊，这次的沉淀能够牢固的贴在管底。
2、4M尿素洗涤，pH9.0，12000rpm离心，获得的上清不是澄清透明而是略显混浊，这次的沉淀为半溶状态的冻状物。
3、8M尿素溶解上述2中的沉淀，几乎不见不溶的颗粒，但溶液还是略显混浊。
上述三溶液取样电泳，均见较多的目的蛋白。
对3中的溶液取样调pH至12溶液依然混浊。
0.22um过滤，无法去除混浊物。
考虑到混浊物是多聚体，样品中加入1％SDS和0.2％β-Me，都无法改善。
做上述处理，主要考虑到混浊物是目的蛋白，因为目的蛋白设计了6HIS但不能成功的结合Ni柱。
主要想请教这样几个问题：1、有没有那位战友也碰上我上述的问题，这种问题是如何解决的？2、我所描述的包涵体的状态说明了什么问题？3、对与蛋白溶液混浊有什么好的处理方法？暂不讨论分泌表达的问题。
回答：1. 你的情况很正常，根据三次沉淀处理情况，应该可以肯定你的蛋白在8MUrea中是完全可以裂解的。
并且该蛋白如若作复性应该可溶性较佳。
但根据我个人的经验。
如果MBP融合蛋白还是以包含体表达的话是很没有意思的，建议作单独表达，除非单独表达不行。
否则即使完全复性，目的蛋白活性也大打折扣。
另可优化表达条件，有可能可容表达的，不要放弃，你的破菌上清也可以跑胶看看有没有目的蛋白。
2. 说明蛋白蔬水性不强。
3。
有些蛋白裂解后有浑浊非常正常，尤其是MBP融合的，即使做到可容也会有白乎乎浑浊的现象，只要不影响使用就行，没必要在意。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
IFN-α包涵体溶解和蛋白纯化
操作程序
用N-十二烷基胺酸钠溶解包涵体沉淀
1.加18mL缓冲液A和2mL 20% DOC储存于包涵体沉淀中。
用组织破碎器充分重悬
沉淀，室温下静置至少10min。
2.悬液于4℃、13000r/min离心10min。
弃去上清（注意留样，样品C），为确保沉
淀得到充分洗涤，再次按步骤一的操作重悬沉淀。
将悬液分成俩个相等的部分，编号#1和#2，于4℃、13000r/min离心10min。
3.对#1管中的沉淀，加19.7mL的缓冲液A和0.3mL的20%SKL储液。
剧烈搅动使
沉淀慢慢溶解。
然后静置30min。
4.#1管中溶解的蛋白悬液，置于4℃、13000r/min离心10min。
收集上清液，弃去
沉淀。
缓冲液A（1000mL）配制：
1mol/L Tris-HCl（PH 7.9）50mL，50mmol/L
0.5mol/L EDTA 1mL，0.5mmol/L
5mol/LNaCl 10ml，50mmol/L
甘油 50mL，5%
缓冲液A+50%甘油
脱氧胆酸钠（DOC）
N-十二烷基胺酸钠（SKL）。