肝干细胞移植治疗终末期肝病的研究进展

干细胞（ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）是指一群在胚胎发育早期末分化的细 胞，理论卜具有无限制分裂能力，可分化成特定组织或器官。 其分裂如下图所示。
干细胞分裂图
作者单位：２３００３１合肥解放军１０５医院消化内科
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【关键词］ 肝干细胞；移植；终末期肝病 ｄｏｉ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ／１０００－０３９９．２００９．１ １．０４３
１ 引言
常规的内科保肝治疗效果不佳，原位肝移植仍然是日前治 疗终末期肝炎致肝硬化最有效的措施。近５年来，我国肝移植 事业更呈专业化和规模化发展，每年肝移植例数已超过２ ０００ 例，据中国肝移植注册（Ｃｈｉｎａ ｌｉｖｅｒ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ ｒｅｇｉｓｔｒｙ，ＣＬＴＲ）统 计显示，我国大陆肝移植例数９ １１８例中，总体１年、３年和５ 年生存率分别达８４％、８０％和７６％。在肝移植乃至活体肝移 植蓬勃发展的过程中，积累了富有中国特色的自身经验，并逐 渐融入网际移植界这一大家庭。但是，它存在的三大缺陷阻碍 着它的更广泛开展和应用¨Ｊ：①供肝缺乏是永恒的矛盾。我国 是肝病大国，慢性乙肝病毒性肝炎患者近３ ０００多万，其中 ２０％发展为肝硬化，仅此类终末期患者至少约６００万人，以 ２００４年为例１年中仅有约３ ０００例患者有“幸”接受肝移植治 疗。即潜在适合肝移植的患者中，仅有０．０４％接受肝移植治 疗，即使在美围，尽管活体肝移植率已达３０％，但每年还有数千 人在等待器官移植中死亡，而在等待器官移植的患者却以每年 １ １％的速度递增。②免疫排斥反应是难以根本解决的问题：供 体肝与受体存在免疫排斥反应，肝移植术后需长期应用免疫抑 制剂，使患者免疫力下降，易患各种疾病。③从医疗经济学角 度分析，器官移植费用昂贵，对国家、社会、个人都是一种沉重 的经济负担。
高志良等ⅢＪ报道了自体骨髓干细胞经肝固有动脉介入法 自体移植治疗３２例肝衰竭患者、结果肝功能、凝血功能、自觉 症状、转归和预后方面的改善均优于对照组。可见骨髓干细胞 移植治疗肝衰竭，可在一定程度上恢复肝功能，缩短治疗时间， 改善预后，但目前对移植细胞在体内的定植与示踪、其具体分 化过程，功能重建程度以及具体疗效评价，尚需进一步深入分 析。姚鹏等¨副对３０例失代偿期肝硬化患者进行自体骨髓干 细胞移植，亦取得了良好疗效。
肝衰竭雌性小鼠。结果移植组小鼠中位生存时间较对照组延 长（分别为１２３．４ ｈ对７０．４ ｈ）；血氨、谷丙转氨酶、总胆红素各 时间点均低于对照组；肝脏病理损伤逐渐减轻，存活２周小鼠 肝脏组织中性别决定因子呈阳性表达，随时间延长表达逐渐增 强。此外，Ｔｅｒａｔａｎｉ等¨副研究表明胚胎干细胞叮以分化为肝细 胞，胚胎丁细胞移植对小鼠肝硬化有显著疗效。Ｓａｋａｉｄａ等¨４１ 研究证明自体骨髓干细胞移植能够改善肝硬化小鼠的肝功能， 提高其存活率。 ４．２临床研究 自体骨髓十细胞作为一种肝干细胞已用于临 床，目前常用的移植方法【１引是在数字减影血管造影下经股动 脉穿刺插管，置管于肝固有动脉并造影，观察肝内血管情况及 有无占位性病变。将待用的细胞悬液于３ ｈ内分别经左、右肝 动脉缓慢注入。术毕拔管，穿刺点加压包扎后患者返同病房， 术侧Ｆ肢制动６ ｈ。姚鹏等Ｊ刮行肝动脉介入分别将分离的自 体骨髓干细胞移植入６０例肝衰竭患者的肝脏，结果患者症状 明显改善，血氨、谷丙转氨酶及总胆红素等指标明显下降，而清 蛋白和凝血酶原活动度逐渐卜升，食管静脉曲张未见明显改 变，未见严蓖并发症。自体骨髓十细胞移植对肝衰竭患者的治 疗有效且副作用小，安全，能够促进患者肝功能改善，但对门静 脉高压食管静脉曲张及脾功能九进等顽固并发症无明显改善。 此外自体骨髓干细胞移植不存在免疫排斥反应，创伤小。
５干细胞对肝脏损伤修复作用的研究进展¨州及面临的问题
近年来，有关肝干细胞的研究逐渐深入，越来越多的研究 表明，肝丁细胞移植具有极其诱人的临床应用价值。首先，体 外培养肝干细胞为牛物型人工肝提供一种新的细胞来源，其强 大的增殖能力为解决用于移植肝十细胞的增殖困难及供体缺 乏提供ｒ新思路；其次，肝干细胞移植不但可以替代坏死的组 织，还可以刺激受体组织再牛，以治疗各种原因所致的肝脏损 、伤；此外，通过体外基凶修饰肝干细胞，再移植给相应基因缺陷 的受体以分化为具有ＪＦ常功能的肝细胞，作为体外基阗治疗用 以改善肝脏代谢疾病的良好载体。干细胞移植相对肝移植有 着尤可比拟的优点。第一，肝干细胞移植使用了同基因细胞， 有效避免－ｒ移植后的排斥反应；第二，肝干细胞具有增殖能力， 肝移植仅仅替代了患者坏死的肝组织，其本身町能不具有再生 的能力；第三，肝干细胞移植的治疗不涉及医学伦理问题；第 四，治疗费用比较低，一般经济家庭可以接受。因此，肝干细胞
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３ 肝干细胞的来源及其分离方法
Ｆａｔｈｅｒ（１９５６年）将肝内具有分化潜力的细胞描述为卵圆 细胞，Ｗｉｌｓｏｎ和Ｌｃ捆ｕｃ（１９５８年）提ｆｌｊ肝于细胞的概念∞１１。肝 干细胞可分为肝源性和非肝源性两大类，前者主要包括卵圆细 胞、分化的肝细胞、胚胎干细胞和胆管上皮细胞，后者则为源于 胚胎干细胞、骨髓造血ｆ细胞及胰腺，卜皮干细胞等不同来源的 肝脏十细胞。虽然已明确肝内具有肝干细胞特性的卵圆细胞， 但对其来源、增殖、调控分化及其与肝脏疾病的关系仍缺乏深 入、足够的了解。目前研究重点主要是致力于阐明卵圆细胞的 增殖和调控分化的机制，同时建立一个优化的肝卵圆细胞分离 培养系统，以求在体外进行ｆ预卵圆细胞增殖和分化的实验。 骨髓中的干细胞主要包括造血干细胞和间充质干细胞。已有 颇多相关研究表明，这两还处于体外实验 阶段。Ｋｕｍａｓｈｉｒｏ等邛１为获得町供体内移植用的胚胎十细胞源 性肝细胞，采用密度梯度离心法、免疫磁珠分选法和流式细胞 仪分选法进行纯化细胞。对于肝十细胞进行体外分离鉴定和 长期培养是对肝干细胞进行深入研究的基础，同时也是对肝干 细胞进行临床应用的前提。近年来，随着分子生物学、细胞生 物学、细胞培养技术及免疫学的发展，肝干细胞的分离鉴定和 培养也取得了一些进展。目前多用两步胶原酶灌流消化法获 得胚肝细胞，进一步用密度梯度离心法和离心沟洗技术、荧光 激活细胞筛选法及免疫磁珠细胞筛选法进行纯化ｐ川，后两种 方法都是以免疫亲和力技术为基础，细胞被抗体标记后用免疫 磁珠颗粒或流式细胞计数等方法分离。
虽然，目前大多数研究还处于在动物试验及部分临床前研 究阶段，但已有大量资料显示肝干细胞移植在暴发性、慢性、遗 传性肝病等方面取得较大的突破。相信随着对肝再生过程的 进一步研究，以及干细胞在肝修复过程中作用的进一步了解， 将会不断成熟干细胞体外分离纯化扩增方法，解决干细胞体内 归巢、定植、增殖等难题，进一步完善监测手段，建立和研究更 多的临床研究模型，干细胞移植必将会作为治疗终末期肝病的 一种重要手段而广泛应用于临床。
４肝干细胞移植治疗终末期肝病的现状
４．１基础研究Ｍａｔｓｕｓａｋａ等…１利用富含卵圆细胞行肝细胞 移植发现，受体鼠脾内不含卵圆细胞的肝细胞增殖数量增加。 Ｓｈｉ等经脾脏进行胚胎干细胞移植治疗Ｗｉｌｓｏｎｓ病模型鼠，移植 后第２～４周，在肝内可见胚胎干细胞来源的干细胞增殖，说明 脾脏内移植的胚胎干细胞有分化为成熟肝细胞的能力。同时， Ｋｕｓｈｉｄａ等通过门静脉进行千细胞移植治疗Ｗｉｌｓｏｎｓ病模型小 鼠，移植后１４天，肝内发现下细胞来源的肝细胞，而腹腔内移 植则无此发现。Ｆａｎ等在此途径进行干细胞移植时亦有类似发 现，并发现干细胞可经肝脏种植于脾及骨髓中。在经门静脉移 植临床应用中，由于移植后门静脉及肝小静脉的血栓形成而影 响其广泛应用。杜智等采用Ｄ一氨基半乳糖制备大鼠暴发性 肝衰竭模型，以列系大鼠来源的肝于细胞经肝脏移植，结果表 明肝干细胞移植组大鼠一般情况改善中位生存时间延长，血 氨、谷丙转氨酶及总胆红素等指标明显低于对照组；肝脏病理 减轻。可见核／质比例较大的小细胞增殖，杜智等¨引还进行了 肝千细胞异种移植研究，其采用纯化中期妊娠流产的男性胎儿 肝干细胞，经肝脏注射移植治疗Ｄ一氨基半乳糖诱发的爆发性
２０世纪末，生命科学研究领域２项莺大突破对人类医学科 学及伦理、道德产生了强烈冲击。第１项是１９９７年２月英国罗 斯林研究所利用体细胞核移植术获得克隆羊多莉，在实践上证 明了利用体细胞进行动物克隆“无性繁殖”的技术是呵行的；第 ２项是１９９８年美国威斯康星大学建立５株可长期传代培养的 胚胎干细胞，并可诱导分化成不同细胞组织或器官。这两项莺 大突破使得干细胞移植迅速成为生物技术领域最具发展前景 的前沿技术。２００７年ｌＯ月胚胎干细胞相关研究荣获诺贝尔医 学奖，而其后不久来自美国和日本的３个独立科研小组几乎同 时发表论文宣布，已成功将人类成体干细胞逆分化为具备胚胎 干细胞功能的新型细胞悼。４１。这一干细胞研究领域的重大突
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移植仅仅帮助患者度过危险期，等待病人肝脏的再生。毫无疑 问，于细胞移植具有明显的优势。
尽管干细胞移植疗法为终末期肝病患者带来新的希望，但 要真正将干细胞移植广泛应用于临床目前还有很多的问题需 要进一步探究。主要有：①移植干细胞的数量：临床有效的移 植要求干细胞数量达到一定的程度，郭晓钟等¨副获取单个核 细胞计数在１０８与ｌ ０１ｌ数嚣级之间，最好的效果是达到１０９ 数量级以上。②干细胞的归巢与定植：不同肝外干细胞在不同 肝脏疾病中的归巢和定植还有待于进一步研究。③监测手段： 干细胞移植体内后的分化增殖、细胞的功能状态尚缺少切实可 行的监测手段。目前最常用的体内移植细胞示踪剂多为荧光 物质（如ＧＦＰ报告基因、ＣＦＤＡ—ＳＥ等），国外也有报道将携带 Ｙ染色体的肝干细胞移植带雌性动物肝内，通过Ｙ染色体示 踪【２１１。但这些方法存在的问题是了解移植细胞体内定居、增 殖情况时，均需取得肝组织作病理切片检查，这就失去ｒ动态 观察移植细胞在宿主体内连续性变化的机会，同时不适合临床 应用。活体示踪剂町动态连续观察移植细胞在受体肝内的定 居、增殖情况ｍ瑙】，成为近年研究的热点，但活体示踪剂标记 效率不高的问题尚未解决。所以，寻找一种良好的示踪剂成为 细胞移植必须攻克的难题。
参考文献
［１］陈积圣，商昌珍．肝干细胞移植及其应用前景．新医学，