realtime_pcr__绝对定量和相对定量 ppt课件

PPT荧光定量PCR(共31张PPT)

➢ 3’端标记有荧光淬灭集团（Quencher，Q） ➢ 探针完整，R发射的荧光能量被Q基团吸收，无荧光，R与Q分开，发
荧光
➢ Taq酶有5’→3’外切核酸酶活性，可水解探针
荧光标记物的选择
绝对定量：指的是用已知的标准曲线来推算未知的样本的量，绝对定量则需要使用标准曲线确定样本中基因的拷贝数或浓度
以不同稀释度的标准品为模板进行定量PCR并获得对应的CT，即可制作标准曲线
25
y = -3.2461x + 26.443
20
R2 = 0.9976
15
E=103.2647%
10
5
0
0
2
4
6
8
以lg（CT）为纵坐标，lg（拷贝数）为横坐标，绘制标准曲线扩增效率（E）= （10-1/斜率-1） × 100% 相关系数（R2）应大于0.99，越接近1越好 E应介于95%与105%，越接近100%越好
Ct值：每个反应管内的荧光信号达到荧光域值时所需的循环数。
✓ 每个模板的CT值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，
CT值越小
✓ 利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，因此只要获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数
非特异性荧光标记 ➢ SYBR Green I
❖ 引物质量尽可能避免自身及上下游错配、发卡结构
❖ 跨越内含子设计引物
❖ Primer-BLAST确认引物的特异性，避免扩增出 1000 bp以下的非目的产物
方法
优点
缺点
适用范围
绝对定量
定量准确
工作量较大，需额外绘制目标基因的标准曲线
所有
相对定量

Real-time PCRppt课件

特点：高灵敏：至少可检出20pg DNA，高于 EB染色法25-100倍。信噪比高：样品荧光信号强，背景信号低。操作简单：无须脱色或冲洗。适用范围广：可适用于多种电泳分析。使用方便：不影响其它修饰酶作用。经济：价格比银染便宜。
DNA交联荧光染料技术的评价
优点：成本较低，操作简单，无需对引物或探针进行预先特殊的荧光标记，适用于任何反应体系缺点：特异性弱，因为染料也会结合到非特异性扩增产生的双链分子和引物二聚体中，使反应体系中的荧光本底较高。
R F Q Intact probe - reporter quenched by FRET R Reporter Q Quencher
R
Q R
Q
During PCR, probe hybridizes to target sequence
Probe is partially displaced during extension Probe cleaved by 5’- 3’ nuclease activity of polymerase Free reporter exhibits unquenched fluorescence
原理：扩增过程中，探针与模板杂交时两种染料互相接近，两探针能够进行荧光共振能量的转移；转移过程中，外来光源首先刺激供体荧光染料，供体便发光刺激附近的受体荧光染料，使后者再发射出具另一种波长的信号而被检测系统接收。由于受体荧光染料只有在两个探针都与模板杂交时才会被激发而发射荧光信号，所以对信号的检测室在退火后进行。
供体荧光基团受体荧光基团
靶DNA
靶DNA
分子信标 (moclecular beacon )技术
该技术事一种基于荧光能量转移基础和碱基互补原则建立的技术。分子信标实际是一段荧光素标记的寡核苷酸，结构是有环状区和柄区组成，5’ 端标记报告基团R，3’ 端标记淬灭基团Q在自由状态下，分子信标的结构呈发夹状

Real-time PCR技术介绍ppt课件

两类染料法的差异
在进行 HRM 分析时，由于饱和染料占据了 DNA 双链上每一对碱基上的空位，所以在双链解链时，染料立即与双链脱离，使得荧光信号发生较大的变化，而非饱和染料常发生位置上的迁移，从而对荧光信号没有大的影响。除了LCGreen 染料外，常用的染料还有ResoLight、 EverGreen等，这些都是绿色荧光染料，最佳激发波长范围440-470nm，发射荧光波长470-520nm。下图显示了饱和荧光染料 LCGreen 和非饱和荧光染料 Sybr Green 的区别：
Real-time qPCR和常规PCR的区别
• 实时检测（在对数扩增时期）而不是终点检测 • 敏感性高 • 需要样品少 • 特异性高 • 精确定量
Real-time PCR概述
实时荧光定量PCR技术于1996年由美国Applied Biosystems公司推出，该技术是在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号的积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。
荧光阈值（threshold）的设定
PCR反应的前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号，荧光域值的缺省设置是3~15 个循环的荧光信号的标准偏差的10倍，即： threshold = 10 • SDcycle 3-15 。
同一模板在96孔PCR仪上做的96次重复实验
Ct值与起始模板的关系
研究表明，每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，Ct值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代Ct值。因此，只要获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。
荧光化学

实时荧光定量PCR (realtime PCR) 技术原理(Roche公司 PPT)

实时荧光定量PCR (realtime PCR) 技术原理(Roche公司PPT)Real Real--time time PCRPCR Principle 罗氏诊断产品罗氏诊断产品((上海上海广州办事处应用科学部实时荧光定量实时荧光定量PCR PCR PCR技术原理技术原理普通 PCR 技术原理基于嵌入式染料的荧光定量 PCR 原理基于探针的荧光定量 PCR 原理荧光定量 PCR 技术平台的功能开发实时荧光定量实时荧光定量PCR PCR PCR技术原理技术原理普通 PCR 技术原理基于嵌入式染料的荧光定量 PCR 原理基于探针的荧光定量 PCR 原理荧光定量 PCR 技术平台的功能开发PCR 原理信号放大原理PCR 产物的电泳检测和分析SYBR Green IHybProbe TaqMan Real-time PCR原理实时荧光定量实时荧光定量PCR PCR PCR技术原理技术原理普通 PCR 技术原理基于嵌入式染料的荧光定量 PCR 原理基于探针的荧光定量 PCR 原理荧光定量 PCR 技术平台的功能开发Green ICp(Crossingpoint or Ct (Cyclerthreshold实时荧光定量 PCR 的原理公式N =N 02n =N0(1+En logN= log(1+En +logN0 logN 0= -nlog(1+E+logN Cp =n= -logN 0/log(1+E +logN/log(1+E(Y=kX+b结论:Cp 值与模板起始浓度的负对数成线性关系N :扩增产物量 ;N 0:启始模板量 ; N :循环数 ; E :扩增效率(0 ≤E ≤1实时荧光定量实时荧光定量PCR PCR PCR技术原理技术原理普通 PCR 技术原理基于嵌入式染料的荧光定量 PCR 原理基于探针的荧光定量 PCR 原理荧光定量 PCR 技术平台的功能开发FRET 现象 (Fluorescence resonanceenergy transferTaqMan probeTaqMan probe principle Roche Applied Science 16杂交探针HybProbe－罗氏专利性技术－杂交探针 for sequence specific detection of DNA Fluorescein LC Red Denaturation Annealing Elongation End of Elongation Roche Applied Science 17实时荧光PCR检测结果 Roche Applied Science 18New Probe Format : SimpleProbe Format -高效低成本的新型探针 Denaturation phase: SimpleProbe free in solution; emission of reporter dye is quenched R Q R = Reporter (Fluorescein Q = Quencher 5‘ 3‘-p Annealing phase: Fluorescence from reporter dye increases when probe is annealed to it‘s complementary target R primer 3‘ Q 3‘-p 5‘ 5‘ Roche Applied Science 19实时荧光PCR技术的优势实时荧光PCR技术的优势 PCR 特异性强：引物和探针“双”，避免检测的假阳特异性强性。

Realtime PCR实验原理与技术 ppt课件

Realtime PCR实验原理与技术
qRT-PCR技术实验操作（优化）
标准品的选择：理论上可以以目的基因的PCR扩增产物为标准品，但是存在降解、污染等因素影响定量结果。
论坛网友给出了几种解决方法： ① 另设计一对引物用于荧光PCR； ② 将扩增序列插入T载体后作为标准品； ③ 设计一对外围引物扩增PCR,将产物连入T载体(①+②)
Realtime PCR实验原理与技术
qRT-PCR技术荧光标记方法的分类
1. 非特异性的DNA结合染料法：荧光染料能非特异结合DNA
双链结构的小沟中，而游离的荧光染料不发出荧光。
常用染料：Pico Green （灵敏度高,>=25pg/mL） SYBR I
缺点：易受到非特异性扩增和引物二聚体的影响。措施：设计特异性引物，优化PCR反应条件。
定量分析？
Realtime PCR实验原理与技术
qRT-PCR技术原理
a) Ct值(Cycle Threshold;每个反应管中荧光强度达到阈值所需的循环数)与样本初始拷贝数存在正比线性关系。
b) 以不同稀释倍数的已知模板制备标准曲线。 c) 实时监测未知样本的Ct值，对应标准曲线得到未知
样本的初始拷贝数。（定量分析）
Realtime PCR实验原理与技术
qRT-PCR技术实验操作（优化）
有研究建议在每一个循环中 PCR 延伸后增加一步，即将温度提高后再检测反应体系中的荧光。该检测温度大于引物二聚体的退火温度 Tm，而小于特异性扩增产物的 Tm值。在此温度下，引物二聚体都变性成单链，因此只检测到与特异性 PCR 产物结合的 SYBR Green I 所发出的荧光，消除了引物二聚体的干扰，降低了非特异性荧光，有助于目标基因的准确定量。

实时定量PCR课件

41
三、绝对定量
标准品倍比梯度稀释方法： 10v原液(标准品i) +90v稀释缓冲液，得标准品ii 10v标准品ii+90v稀释缓冲液，得标准品iii 10v标准品iii +90v稀释缓冲液，得标准品iv 10v标准品iv +90v稀释缓冲液，得标准品v
Why?
42
三、绝对定量
拷贝数的计算(以dsDNA为例）
1. 模板均一性问题：起始的细胞数、细胞的状态、均一性等
2. RNA制备：RNA纯化得率、均一性等 3. 反转录：反转录的效率等
48
内标/内参照
因RNA纯化后得率不同、RNA反转录为cDNA的效率不同等客观因素，用于定量分析的初始样品浓度可能不同。因此，在进行基因表达研究中都会用看家基因（house-keeping gene）对数据进行标准化，以校正因样品初始浓度不同而造成的差异。
待测样本浓度（ng/ul）＝OD260×50×稀释倍数样本分子量=碱基数×660 dalton/bp 待测样本拷贝数（copies/ul）=待测样本质量/样本
分子量×6×1014
43
三、绝对定量
拷贝数的计算举例：
3000 碱基质粒，浓度100 ng/ul MW= 3000 bp x 660 dalton/bp =1.98 x 106
7
ABI 7300 荧光定量PCR仪
ABI：Applied Biosystems Inc.
8
9
检测通道
2004年推出的7300和7500均为第三代产品， 2001推出的7900为第二代产品。
7300：4通道 7500：5通道均需加Rox染料进行校正
10
两种荧光标记法
1. 染料染色

实荧光定量PCR技术ppt讲课文档

ΔΔCT= ΔCT（test) - ΔCT（calibrator)
3、计算表达水平比率：
2 –ΔΔCT=表达量的比值
第二十八页，共38页。
相对定量分析方法2：双标准曲线法
目标基因与内参基因扩增效率不同
待测样品目的基因浓度
待测样品内参基因浓度
F=
对照样品目的基因浓度
对照样品内参基因浓度
第二十九页，共38页。
第二十一页，共38页。
•绝对定量(Absolute Quantification，AQ)
病原体检测
转基因食品检测
基因表达研究
•相对定量(Relative Quantification，RQ)
基因在不同组织中的表达差异
药物疗效考核
耐药性研究
第二十二页，共38页。
绝对定量与相对定量的定义
第二十三页，共38页。
差在 5％以内
1、用内参基因的CT值归一目标基因的CT值：
ΔCT（test)= CT （target,test) - CT （ref,test)
ΔCT（calibrator)= CT （target, calibrator) - CT （ref, calibrator)
2、用校准样本的ΔCT值归一试验样本的ΔCT值：
值，它可以设定在荧光信号指数扩增阶段任意
位置上，一般荧光域值的设置是基线（背景）
荧光信号的标准偏差的 10 倍。
每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所
经历的循环数被称为 CT 值（ threshold value
）。
第八页，共38页。
第九页，共38页。
定量PCR的数学原理
第十页，共38页。
绝对定量通过标准品定量