不对称PCR扩增检测土壤中的肠道病原菌
病原菌的分类与识别技术
病原菌的分类与识别技术病原菌是人类健康的威胁之一，对于能够区分不同病原菌的分类与识别技术，医学和生物科技行业都有极大的需求。
本文将从病原菌的分类以及识别技术两个方面来进行阐述。
一、病原菌的分类病原菌的种类众多，各自具有不同的特征和病毒特征，根据病原体的形态、结构、生理特性等方面的不同，病原微生物分为细菌和真菌两大类。
1.细菌细菌是一类极微小的生物，按照菌形可分为球菌、链球菌、杆菌、弧菌、螺旋菌、丝状菌、放线菌等多种。
细菌的特征是单细胞生物、具有细胞壁、无真核膜、无细胞核，具有多样的代谢途径。
2.真菌真菌是一类单细胞或多细胞、无色或有色、寄生或自养且寄生常以半腐生、腐生为主的菌类，包括酵母菌、担子菌、接合菌和真菌等几个门。
真菌的特征是菌丝状、营养方式多样、细胞壁含有几丁质或纤维素等成分。
二、病原菌的识别技术1.PCR技术PCR（聚合酶链反应）是一种非常常用的分子生物学技术，可在非常短的时间内扩增某个DNA序列，从而通过检测扩增产物来进行病原菌的识别。
PCR技术在病原体检测中已经得到了广泛的应用，例如肺炎支原体、结核分枝杆菌、沙门菌、大肠杆菌等。
2.细胞学检查技术细胞学检查技术是一种较为简单的病原体检测技术，主要是通过显微镜观察，结合特异性染色，来验证病原体在患者的细胞样本中是否存在，比如疱疹病毒和巨细胞病毒等的检测就可以采用这种方法。
3.质谱技术质谱技术是一种通过分析样品中分子的质量和相对强度来确定其化学成分的方法，细菌分类鉴定可采用生物质谱判定鉴定方法。
利用质谱技术还可以检测细菌代谢产物、细胞表面蛋白和核酸序列等属性，因此当用于微生物检测时，质谱技术尤为有用，可以检测出极小浓度的病原菌和其他微生物。
4.免疫学检测技术免疫学检测技术通过检测病原菌特异性抗原或特异性抗体来识别病原菌，是一种快速、准确、灵敏的病原体检测方法。
这种方法的优势是在于对病原体特异性较强，而且检测能力也比较高，例如ELISA、免疫印迹法和荧光素酶标记等。
PCR自测题
PCR自测题一、名词解释1.PCR2.变性3.退火4.延伸5.逆转录PCR6.停滞效应7.共享引物PCR8.多重PCR9.反向PCR10.原位PCR11.LCR二、单项选择题1．PCR反应中，所设计引物的长度一般为（）A．5～10核苷酸 B. 15～30核苷酸 C. <50个核苷酸 D.长度任意E. 以上答案均不对2．引物设计时G＋C含量在引物中一般占（ c ）A.20～40﹪B. 30～60﹪C. 45～55﹪D.越高越好E.含量随意3．以下说法错误的是（ e ）A引物中的碱基组成应该尽可能的随机分布。
B引物自身不应该存在互补序列C设计引物时应考虑使3‘端引物和5‘端引物具有相似的Tm值D引物的5‘和3’端必须和模板严格配对结合E引物与非特异扩增区的序列的同源性不要超过70﹪4．下列说法正确的是（）C.PCR反应常用的缓冲液为10－50mmol/L的Tris-HCl（室温PH 8.3－8.8）D.10mmol/L的KCl能促进引物的退火E.加入的BSA有利于破坏模板的二级结构F.二甲基亚砜有利于保护TaqDNA酶的活性。
E. Mg2+能降低Taq DNA聚合酶的活性。
5. TaqDNA聚合酶活性需要以下哪种离子（ c ）A．K+ B. Na+ C. Mg2+ D. Ca2+ E. Cl-6．适用于DNA序列中单个碱基突变的检测的方法是：( d )A．筑巢PCR B. 多重PCR C. 锚定PCR D. LCR7．以下哪种PCR技术广泛应用于组织胚胎学和肿瘤学的研究（a ）A．原位PCR B．差异显示PCR C．不对称PCR D．反向PCR8.已知一段设计好的引物的序列为GTGGATCCATGGCTCCTCTGAAGATTC,其Tm值为（）A. 78B. 80C. 82D. 84E. 无法计算9．以下哪种PCR技术可以克服序列未能全知的障碍而获取目的扩增片段（ c ）A.共享引物PCR B不对称PCR C锚定PCR D.筑巢PCR 10．一位疑似杜氏肌营养不良症的患者，可以采用以下哪种方法协助诊断（）A.原位PCRB.多重PCRC.不对称PCR.D. 锚定PCR11．以下关于dNTP的说法错误的是（e ）B.dNTP具有较强的酸性，使用时应将pH调至7.0-7.5C.PCR反应中，四种dNTP必须按比例配制，以减少反应的错配率。
《临床微生物学检验》题目 单选 多选 简答 论述
临床微生物学检验题目一、单选题1.下列检查中除哪项外均可用于霍乱的诊断：EA.大便悬滴法检查B.大便碱性蛋白胨水培养C.大便涂片革兰染色D.霍乱血清凝集试验找特异性抗体E.血培养找霍乱弧菌2.近年来发现对痢疾杆菌较敏感的抗菌药物为：DA.卡那霉素B.庆大霉素D.氟喹诺酮类E.氨苄青霉素3.在钩端螺旋体病血清学试验中,国内以下列哪种试验有较高的特异性和敏感性：AA.显凝试验B.炭凝试验C.红细胞凝集试验D.红细胞溶解试验E.补体结合试验4.乙脑患者早期的特异性诊断检查：EA.腰穿检测脑压B.脑脊液化验检查C.头颅CT检查D.补体结合试验检测乙脑IgG抗体E.酶联免疫吸附试验,检测乙脑IgM抗体5.流行性斑疹伤寒的实验室诊断方法常选：CA.血常规B.病原体接种分离C.外斐反应D.立克次体凝集试验E.补体结合试验6.血清流行病学调查时,若需要长期保存血清应置于：DA.－4℃冰箱B.－8℃冰箱C.－10℃冰箱D.－20℃冰箱E.以上都不对7.用于血清流行病学调查的静脉采血量一般为：E以下～2ml～3ml～5ml以上8.能长期或永久保存血清的温度条件是：E℃℃℃℃℃9.志贺菌属中,下列哪一项不正确：EA.在普通琼脂平板上生长形成中等大小、半透明的光滑型菌落抗原为型特异型抗原抗原为群特异性抗原D.分解葡萄糖,产酸不产气E.分解乳糖,产酸产气10.宋内氏志贺氏菌有两个变异相,急性患者分离的菌株一般是：AA.Ⅰ相B.Ⅱ相C.Ⅰ相或Ⅱ相D.Ⅰ相和Ⅱ相E.以上都不对11.有关细菌培养基的描述,哪项是不正确的：BA.按物理状态可分为液体、固体和半固体三类培养基属于鉴别培养基C.血琼脂平板属于营养培养基D.蛋白胨水为常用的基础培养基E.庖肉培养基属于厌氧培养基12.新从病人分离的肠道杆菌菌落是：B型型或S型和S型E.以上都不对13.接种立克次体的鸡胚应置于下列哪一个温度的孵卵箱中孵育：AA. 32～35℃B. 37～38℃C. 38～39℃D. 39～40℃E. 40～41℃14.用吉姆尼茨染色法染色立克次体时加石炭酸复红染色液一般需要：CA. 1分钟B. 2分钟C. 5分钟D. 10分钟E. 15分钟15.最早采用的检测方法为：BA. 分离培养B. 直接涂片镜检C. 血清学试验D. 动物试验E. 电镜检查16.下列哪种细菌的最适生长温度为25℃：CA. 肠炎沙门菌B. 空肠弯曲菌C. 假结核耶尔森菌D. O157：H7大肠杆菌E. 宋内志贺菌17.常用琼脂扩散试验的琼脂浓度为：B～2%～4%～6%～8%18.宋内志贺菌：DA. 快速发酵乳糖B. 为B群C. 包括10型D. 培养中常出现扁平的粗糙型菌落E. 为A群19.下列哪一项是痢疾志贺菌的特性：AA. 可产生志贺毒素B. 只有1型C. 迟缓发酵乳糖D. 有15个型E. 培养中常出现扁平的粗糙型菌落20.测定HIV感染的最简便方法是下列哪一个：AA. 测定HIV抗体B. 分离HIV病毒C. 测定HIV抗原D. 测定HIV核酸E. HIV基因测序21.庆大霉素培养基适用于培养何种细菌：CA. 鼠疫杆菌B. 布鲁氏菌C. 霍乱弧菌D. 白喉杆菌E. 奈瑟氏菌的抗原成分中哪一种与病毒的中和性作用有关：BA. HBvAgB. HBsAgC. HBcAgD. HBeAgE. HBuAg23.甲型肝炎实验室诊断方法主要依赖于检测患者血清中的下列哪种成分：CA. 抗HAV的IgAB. 抗HAV的IgGC. 抗HAV的IgMD. 抗HAV的IgDE. 抗HAV的IgE24.沙门菌属在普通平板上的菌落特点为：AA. 中等大小,无色半透明B. 针尖状小菌落,不透明C. 中等大小,粘液型D. 针尖状小菌落,粘液型E. 扁平粗糙型25.立克次体病原学检查,脏器组织和节肢动物可做切片检查,切法要求越薄越好,一般不超过：A～4微米～8微米～15微米～25微米～40微米26.做补体结合试验前血清加热灭活以破坏它所含有的补体,通常羊血清用下列哪一个温度灭活：BA. 48℃B. 58℃C. 68℃D. 78℃E. 88℃27.在CFT反应中为了查Ag,常常降低反应温度,称为冷CFT,冷CFT反应温度通常是：EA. 37℃B. 18℃C. 24℃D. 30℃E. 4℃28.当进行抗球蛋白试验查不完Ab时,其中一个重要试剂是第二Ab,在抗球蛋白试验中第二抗体是：AA. 双价抗体B. 单价抗体C. IgE抗体D. 半抗体E. IgD抗体29.在CFT反应中有5种成份：Ag、被检血清、补体、溶血素和SRBC,CFT反应中补体的作用是：EA. 特异性结合B. 指示剂C. 抑制剂D. 中和作用E. 非特异性结合30.在进行免疫血清学检查时进行Ag-Ab反应,进行此反应有许多影响因素,一般Ag-Ab反应中无电解质时：BA. 敏感性下降B. 不反应C. 敏感性上升D. 反应正常E. 提高特异性31.某菌属的一个血清群只有1个血清型,诊断时需同时含有Ⅰ相和Ⅱ相抗血清,这一菌属为：AA.志贺氏菌B.艾希氏菌C.沙门氏菌D.大肠杆菌E.耶尔森氏菌32.某菌属的一个血清群只有1个血清型,诊断时需同时含有Ⅰ相和Ⅱ相抗血清,这一菌属分为几个血清群：B33.某菌属的一个血清群只有1个血清型,诊断时需同时含有Ⅰ相和Ⅱ相抗血清,所述血清群为第几群：D群群群群E.以上都不对34.有关放射免疫测定,哪种说法是不正确的：DA.放射性强度常用毫居里mCi或微居里μCi表示B.广泛应用于蛋白质、酶的测定C.广泛应用于半抗原和药物的测定D.其特点是特异性强,但敏感性低E.可能存在的放射性污染为其缺点之一试验是测试细菌：CA.产生志贺样毒素的能力B.产生肠毒素的能力C.侵袭力D.产生内毒素的能力E.粘附能力36.军团菌培养时,BCYE-α琼脂与BCYE琼脂成分不同之处在于前者含有：BA.苏氨酸B.酮戊二酸C.头孢羟唑D.多粘菌素E.茴香霉素37.鲎试验用于何种物质的测定：CA. 外毒素B. 类毒素C. 内毒素D. 神经毒素E. 肠毒素38.可用于扩增未知序列的PCR方法是：BA. 对称PCRB. 反向PCRC. RT-PCRD. 不对称PCRE. 嵌套PCR39.把外源质粒导入细菌中的方法称为：BA. 转导B. 转化C. 转染D. 转入E. 克隆40.从有正常菌群存在的部位所采取的标本应接种在哪种培养基中分离培养病原菌：CA.增菌培养基B.营养培养基C.选择鉴别培养基D.基础培养基E.特殊培养基二、多选题1.可从粪便标本中分离的病毒有：ACDEA.甲型肝炎病毒B.麻疹病毒C.脊髓灰质炎病毒D.人类轮状病毒病毒2.血清学诊断法,正确的是：ABCDA.伤寒—肥达反应B.风湿病—抗“O”试验C.斑疹伤寒—外斐反应D.梅毒—瓦色曼试验E.莱姆病—IgA抗体检测三、简答题1.什么是PCR技术,典型的PCR技术分几个步骤答：PCR技术全称聚合酶链式反应Polymerase Chain Reacti-on技术,是一种扩增、复制小分子核酸片段的分子生物学技术;典型的PCR技术分为预变性,变性,退火,延伸,最后延伸5个步骤;2.什么是ELISA技术,依据原理不同ELISA技术一般可分为几类答：ELISA技术全称为酶联免疫吸附技术;依据原理不同ELISA技术可分为双抗体夹心法、双抗原夹心法、间接法、竞争法和捕获包被法;3.常用的药物敏感性测试AST技术有哪些答：纸片扩散法K-B法、E-Test法、琼脂稀释法、肉汤稀释法仅列出要点;4.细菌培养基按照其用途不同可分为哪五类答：基础培养基、营养培养基、选择培养基、鉴别培养基、厌氧培养基仅列出要点;5.霍乱弧菌在碱性蛋白胨水中培养形成菌膜的原因是什么答：霍乱弧菌为好氧、动力活泼菌,繁殖迅速,故在气液面形成菌膜仅列出要点;6.核酸探针杂交技术有哪几种答：共分为两种,分别为DNA印迹杂交Southern blot与RNA印迹杂交Northern blot 仅列出要点;三、论述题1.在食源性疾病暴发疫情的现场处置过程中,针对细菌性病原,如何进行样本采集与分离鉴定答：采集粪便用于细菌检测,最好是在病人使用抗菌药物之前,采集新鲜粪便;既可以使用灭菌棉拭子直接从消化道下端采集,也可以蘸取病人排泄物样本;采集的粪便样品一般有两种处理办法：1立即投入到相应致病菌增菌液中进行培养增菌,如用于霍乱增菌的APW和用于检测EHEC的mEC增菌肉汤中;2将采集的粪便拭子插入到Cary-Blair运送培养基中送至相关实验室进行检测;在进行分离鉴定时：1针对霍乱等弧菌,可将粪便拭子样本投入碱胨水APW中增菌6-8小时后用四号琼脂、庆大霉素琼脂或TCBS琼脂划线分离培养用于检测霍乱弧菌;而继续增菌16-18小时,接种麦康凯琼脂划线分离培养,可用以检测嗜水气单胞菌与类志贺邻单胞菌、副溶血弧菌等;2针对肠杆菌,可将粪便拭子投入SBG/SF/SC增菌液中增菌16-18小时后用沙门科玛嘉平板划线分离检测沙门氏菌;可将粪便拭子投入mEC肉汤中增菌16-18小时后用O157免疫磁珠富集/科玛嘉平板划线分离检测EHEC O157;还可直接将粪便拭子转种麦康凯/SS培养基37度培养16-18小时检测志贺菌与大肠杆菌;对于可疑大肠埃希氏菌,可用多重PCR的方法检测EA/ET/EI/EP/EH五种致泻大肠杆菌;3针对弯曲菌,可将粪便拭子转种与CCDA或skirrow绵羊血平板,37度微需氧环境下培养24-48小时检测空肠、结肠弯曲菌等;在整个分离培养过程中获得的可疑菌落也可以根据实际情况使用API、Vitek等系统生化鉴定方法进行鉴定与报告;4在应急检测中,也可以使用PCR技术进行致病菌的核酸检测;技术近年来在传染性病原的快速诊断领域中得到越来越广泛的应用,请概述PCR技术的原理,反应的基本成分,基本步骤及操作注意事项;答：PCR技术的原理是：双链DNA在高温条件下可以变性解旋成单链,在DNA聚合酶的参与下,根据碱基互补配对原则复制成同样的两分子挎贝,当温度降低后又可以复性成为双链;因此,通过温度变化控制DNA的变性和复性,加入设计引物,DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的体外复制;典型PCR反应的基本成分为：特异性引物,热稳定DNA聚合酶/缓冲液包含Mg离子,4种dNTPs,模板、灭菌去离子水;PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的变性：模板DNA经加热至94-98℃左右一定时间后,使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离,使之成为单链,以便它与引物结合,为下轮反应作准备；②模板DNA与引物的退火复性：模板DNA经加热变性成单链后,温度降至40-55℃左右,引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下,以dNTP为反应原料,靶序列为模板,按碱基互补配对与半保留复制原理,合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链,重复循环变性--退火--延伸三过程就可获得更多的“半保留复制链”,而且这种新链又可成为下次循环的模板;每完成一个循环需2～4分钟,2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍;PCR操作注意事项：1.严格操作,避免交叉污染与气溶胶污染； 2.确保引物、试剂与扩增模板质量与配比； 3.产物电泳小心处理EB染料,防止污染和对人体造成危害;3.请解释伤寒诊断中肥达氏反应O抗体与H抗体的诊断意义;答：肥达反应是诊断伤寒副伤寒的辅助诊断;其结果的解释必须结合临床变现和病程,病史,以及地区流行病学情况;机体患伤寒、副伤寒,一般于发病后1—2周内血液中出现特异性抗体并且随着病程延长而效价渐升,此时即可为阳性,第4周可达峰值,以后又逐渐降低;一般以“O”凝集效价在1:80或以上和“H”在1:160或以上为阳性;抗体主要是IgM,出现较早；H抗体主要是IgG,出现较晚;根据此特点,肥达试验结果有如下诊断价值：二者均超过正常值,患伤寒的可能性大;二者均在正常值内,患伤寒的可能性小;H抗体效价超过正常值,O抗体效价正常,可能是接种了伤寒菌苗或者是接种的回忆反应;O抗体效价超过正常值,H抗体效价正常,可能是伤寒早期或者其他沙门氏菌感染;一般间隔1—2周复查,若抗体效价比前次结果增高2—4倍,则具有诊断价值;4.霍乱是我国传染病防治法规定的甲类传染病,请列举霍乱弧菌实验室检测的方法及步骤,包括采样、增菌、分离培养、生化/血清学鉴定等环节; 答：霍乱检测的采样主要对象是病人呕吐物,粪便与环境水样;对于粪便与呕吐物,可直接分离培养或用碱性蛋白胨水APW37度增菌6小时必要时可二次增菌后进行检测；对于环境水样,可用10×APW进行增菌;增菌处理结束后可用接种环挑取表面增菌液划线分离于四号琼脂/庆大霉素琼脂/TCBS琼脂37度培养16-18小时后观察是否有可疑菌落生长四号琼脂上为无色半透明黑心菌落,庆大霉素琼脂为无色半透明菌落,TCBS琼脂上为黄色菌落;挑取可疑菌落进行氧化酶/拉丝试验,氧化酶阳性/拉丝试验阳性菌落可初步判定为霍乱弧菌,可将其转种于营养平板培养后进行系统生化鉴定;鉴定为霍乱弧菌的菌株还需进一步进行O1/O群、小川/稻叶血清分型;有条件的话还可以使用PCR/荧光定量PCR的方法检测其是否产CTX肠毒素;。
pcr技术在病原生物鉴定中的应用实验报告
pcr技术在病原生物鉴定中的应用实验报告PCR技术，在分子生物学研究和临床医学中有着广泛的应用。
PCR通过利用酶在体外合成一条特定DNA序列，从而扩增目标DNA。
PCR技术在病原生物鉴定中特别有用，因为许多病原体的数量太少，不易被传统培养方法检测出来。
本实验报告将描述PCR技术在病原生物鉴定中的应用。
材料和方法材料：1.病原菌：分别收集大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、肺炎支原体和结核分枝杆菌的菌株。
2. PCR试剂盒：包括PCR模板DNA（菌落），PCR反应缓冲液，聚合酶，dNTPs（脱氧核酸三磷酸），MgCl2，PCR引物，溶剂等。
3. 电泳仪：含有10％（w/v）聚丙烯酰胺和TBE缓冲液的平板，以及Agarose凝胶，乙溴化物（EB）等。
方法：1.从培养基上挑出适当的菌落，用管涂器转移到已添加生理盐水的96孔板中。
标记菌株。
抖动并在37℃下催化24小时。
2.收集菌株，将其离心，将细胞沉淀加入200μl 的 Tris-EDTA （TE）缓冲液，用超声波压碎。
使菌株的DNA完全释放，可用乙醇沉淀法纯化DNA。
3.设置PCR反应环境：将PCR反应管中加入20μl PCR反应缓冲液，2μl PCR模板DNA，1μl MgCl2溶液，0.5μl聚合酶（Taq酶），0.5μl PCR 引物，4μl dNTPs，72μl 的水。
混合物在PCR热循环器中按照以下条件扩增目标DNA：先以95℃处理2分钟进行热变性，其次以94℃56秒脱氧，然后以50℃45秒回收，之后以72℃1.5分钟延长扩增。
4.扩增完成后，取出反应体积2μl用于电泳分析，将其与DNA分子量标准品一起电泳于聚丙烯酰胺凝胶上，之后通过紫外线扫描进行可视化。
结果PCR为常用的病原体鉴定方法，以下是病原菌的PCRF结果。
表格一：病原菌的PCR结果菌株名称PCR扩增的目标片段（bp）大肠杆菌640沙门氏菌258金黄色葡萄球菌 583肺炎支原体235结核分枝杆菌386通过对扩增的目标DNA的大小范围进行分析，可以准确确定菌株的种类和数量。
PCR技术的原理与应用
多重PCR的用途主要有两方面：
1.多种病原微生物的同时检测或鉴定，它是在同一PCR反应 管中同时加上多种病原微生物的特异性引物，进行PCR扩增。 可用于同时检测多种病原体或鉴定出是那一型病原体感染。
2.病原微生物，某些遗传病及癌基因的分型鉴定:某些病原 微生物，某些遗传病或癌基因，型别较多，或突变或缺失 存在多个突变部位，多重PCR可提高其检出率并同时鉴定其 型别及突变等。
dNTP的质量与浓度：注意4种dNTP的浓度要相等(等摩尔配 制)。如其中任何一种浓度不同于其它几种时，就会引起错 配；浓度过低又会降低PCR产物的产量。dNTP能与Mg2+结 合，使游离的Mg2+浓度降低。
模板：模板核酸的量与纯化程度，是PCR成败与否的关键 环节之一。传统的DNA纯化方法通常采用SDS和蛋白酶K 来消化处理标本。SDS的主要功能是： 溶解细胞膜上的 脂类与蛋白质，因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜，并解离 细胞中的核蛋白，SDS 还能与蛋白质结合而沉淀； 蛋白 酶K能水解消化蛋白质，特别是与DNA结合的组蛋白，再 用有机溶剂酚与氯仿抽提掉蛋白质和其它细胞组份，用
多重PCR的特点有：
①高效性，在同一PCR反应管内同时检出多种病原微生物，或 对有多个型别的目的基因进行分型，特别是用一滴血就可检 测多种病原体；
②系统性，多重PCR很适宜于成组病原体的检测，如肝炎病毒， 肠道致病性细菌，性病，无芽胞厌氧菌，战伤感染细菌及细 菌战剂的同时侦检；
③经济简便性，多种病原体在同一反应管内同时检出，将大 大的节省时间，节省试剂，节约经费开支，为临床提供更多 更准确的诊断信息。
锚定PCR原理示意图
标记PCR和彩色PCR：
标记PCR(Labelled Primers，LP-PCR)，LP-PCR是利用同位 素或荧光素对PCR引物的5‘端进行标记，用来检测靶基因 是否存在。彩色PCR(Color Complementation assay PCR， CCAPCR)，是LP-PCR的一种。它用不同颜色的荧光染料标记 引物的5’端，因而扩增后的靶基因序列分别带有引物 5‘的染料，通过电泳或离心沉淀，肉眼就可根据不同荧光 的颜色判定靶序列是否存在及其扩增状况，此法可用来检 测基因的突变，染色体重排或转位，基因缺失及微生物的 型别鉴定等。
聚合酶链反应技术在病原菌检测中的应用
聚合酶链反应技术在病原菌检测中的应用病原菌是一种可能引起疾病或感染状况的生物体，它们可能存在于生活周围的许多物体中，例如水、食物和空气中。
传统的病原菌检测方法是通过培养和观察细菌来确定是否存在病原菌。
但是，这种方法存在着许多问题，比如需要很长的时间和耗费大量的资源。
聚合酶链反应技术(PCR)解决了这些问题，这种技术能够更加快速、准确地检测病原菌，因此在医学诊断、食品安全以及环境检测等领域得到广泛应用。
PCR技术的原理PCR技术是一种基于DNA分子互补匹配的技术，能够在体外复制DNA分子。
PCR技术的实现需要引入一种叫做聚合酶的酶，这种酶能够识别特定的DNA序列并在这些序列的两侧进行复制，从而使得该序列得以扩增。
此外，PCR技术还需要反向引物和正向引物，这些引物是针对特定区域的两个小分子。
在PCR反应中，这两个引物将与DNA序列的两端结合，确保只有位于特定位置的序列扩增。
PCR反应的结果是产生大量的复制子，扩增出了感兴趣的DNA序列。
PCR技术的应用PCR技术是一种高灵敏度、高专一性的技术，这种技术不仅能够检测病菌，同时还可以检测病菌的药物耐药性和基因变异性。
下面，我们将介绍PCR技术在不同领域的应用。
医学诊断PCR技术在疾病诊断领域得到了广泛应用。
病原菌的DNA序列能够明确识别病原菌，并且在感染期间其DNA形状也能够发生变化，因此，通过PCR技术能够确定病人是否被感染。
此外，PCR技术可以检测病原菌的抗药性和基因变异性，从而为治疗提供更加精确的信息。
食品安全食品中可能存在着大量的病原菌，如果食用这些食品将有可能导致感染。
采用PCR技术能够更加快速的检测食品中的病原菌，这将有助于及早防范食品安全风险。
环境检测PCR技术还能够用于环境检测，例如检测污染的水、空气以及土壤中是否存在病原菌。
此外，环境检测也可以运用PCR技术来检测是否存在特定的非病原菌微生物，这将有助于判断环境的安全性。
总结PCR技术通过体外复制DNA分子、引入聚合酶和引物等手段，在体外复制出感兴趣的特定DNA序列。
不对称PCR
• 3 反应体系的优化 • 优化反应体系扩增产物的琼脂糖电泳分析表明(图4) , 不对
称PCR 反应最佳体系为: 第1 轮PCR反应时5′末端引物与突 变引物配比为50∶1和100∶1 , 第2 轮PCR 反应的退火温 度为65～70 ℃。PCR 突变产物1 (290 bp) 和突变产物4 (267 bp) 经上海生工生物公司测序分析, 结果验证引入的 突变位点与原来设计的突变位点完全一致。
• Wangh还开发了一系列的Elixirs试剂这些试剂以一 Wangh还开发了一系列的Elixirs试剂这些试剂以一
种独特的方式与反应中的分子相互作用，以避免 引物错配，他们是高性能DNA聚合酶HoT Start的 引物错配，他们是高性能DNA聚合酶HoT Start的 替代物，但与HoT Start不同， 替代物，但与HoT Start不同， HoT Start只在零 Start只在零 度及第一次热反应后存在。 Elixirs试剂与其他成 Elixirs试剂与其他成 分混合在一起，可以避免引物错配的情况发生， 但是也会将分离开的基因组链清除掉，他们制止 了引物二聚体的出现，改善了有若干成分的多路 反应结构。
• 采用分子信标（beacons),或者是Applied 采用分子信标（beacons),或者是Applied
Biosystems公司的TaqMan探针检测退火， Biosystems公司的TaqMan探针检测退火， 因为探针温度必须高于引物温度，因此， Wangh认为可以引入一种较低的温度检测 Wangh认为可以引入一种较低的温度检测 步骤。方案一是让热循环与退火步骤一样， 但是要在限制性引物用尽之后或者是延伸 步骤延伸之后引入，另一个方法是将退火 温度与检测温度分开。
不同16SrDNA引物对肠道菌群分析差异的比较
论著 不同16S rDNA引物对肠道菌群分析差异的比较李娟 孙强正 叶长芸 徐建国摘要 目的 分析不同16s rDNA 通用引物 扩增靶序列在研究肠道微生物菌群分析时的差异,为选择合适的通用引物扩增肠道微生物菌群提供基础数据。
方法 从一健康成人的粪便中提取总DNA,以两对 通用引物27F/519R和27F/533R扩增16S rDNA序列,扩增产物分别克隆到PGE M-T载体,建立克隆文库;两个克隆文库分别挑取65个克隆进行测序,通过序列同源性比对和构建系统发育树,比较两对引物在分析肠道菌群多样性上的差异。
结果 成功构建了L519和L533克隆文库,阳性克隆率分别达到95 3%和92 3%。
533文库和519文库中非培养或不可培养的克隆比例分别占69 1%和76 6%(P<0 05)。
两文库优势菌群相同,均为梭状芽孢杆菌、拟杆菌、芽孢杆菌和变形杆菌,但各菌群的比例及低丰度菌群的分布稍有差异;在种群多样性上,533文库和519文库中分别得到22个和17个可操作分类单元,533文库比519文库有更丰富的种群多样性(P<0 05)。
结论 在分析肠道菌群多样性时,引物27F/533R较27F/519R有更好的兼并性,更适宜于进行肠道菌群结构和多样性的分析。
关键词 16S r DNA;引物;粪便;菌群多样性中图分类号 R511.7 文献标识码 A 文章编号 1006-2483(2010)03-0005-05Co mparison of two sets of un i versal p ri m er s of16S r DNA by anal ysis of m icrob ial co mmun ities of stoolsa mp les L I Juan,SUN Q iang-zheng,YE Chang-yun,X U J ian-guo. State K e y Laboratory for Infectious D isease Preventi on and Control,N ational Instit u te for Co mmun icableD isease Control and P revention,China CDC,Beijing 102206, ChinaCorres p onding author:X U J i an-guo,Email:xujianguo@Ab stract O bjective T o co m pa re the t wo sets o f un i ve rsal pr i m ers of16S rDNA by investi ga ting t he d iffe rence o fm i crobial co mm un iti es o f stoo l sa m ples based on t he a m plificati on products.M ethod s The to tal of DNA fro m the stoo l o f a healthy adult w as ex tracted and used as temp l a te to a m plify the conserved reg ion of16S r DNA w ith t w o se ts of pri m ers (27F/519R and27F/533R).A fter pur ificati on,the PCR products w ere c l oned i nto PGE M-T vecto rs and sequenced.T he obta i ned sequences w ere b l asted i n G enbank to ana l y ze the co mmun ity structure of bacter i a.Resu lts T he L519c l oneli brary based on pr i m ers27F/519R and the L533c l one li brary based on pr i m ers27F/533R w ere successfull y constructed.T he cove rage of positi ve clones attached to95 3%and92 3%respectively.Am ong65c l ones of each li brary,62and60 positi ve clones w ere obta i ned respecti v ely i n L519li brary and i n L533li brary.T he sequence analysis i nd ica ted that t he t woli braries had si m ilar propo rti on o f predom i nant species i nc l ud i ng C l ostr i d i a,Bactero i detes and Bac ill.i A s for m i nor spec ies, there we re d ifferences bet ween the t wo li braries.A c l one belong i ng to Be taproteobacteria was detected i n L533li brary,butnot i n L519li brary.M eanwh ile a c l one o f unclass ified bacte ria was detected i n L519library,but no t i n L533li brary.T he number o f opera ti ona l taxonom ic un its(OUT s)i n L519li brary and i n L533li brary w ere17and22respecti ve l y (P<0 05).F urt her m ore,t he frequenc ies of c l ones be l ong i ng to uncultured or unknown bacter ia i n L519library and i nL533li brary w ere69 1%and76 6%respecti v ely(P<0 05).Con clusi ons Pr i m ers27F/533R w as mo re e ffecti ve t han27F/519R i n ana l yz i ng the d i versity o fm icrobia l communities o f st oo l samp l es.K ey words 16S rDNA;P r i m e rs;Stoo;l Community d i versity基金项目:科技部卫生行业科研专项(项目编号:200802016)作者单位:102206 北京,中国疾病预防与控制中心传染病预防与控制所第一作者简介:李娟(1977-),女,博士,助理研究员,主要从事肠道病原菌快速检测工作通讯作者:徐建国,Em ai:l xu ji anguo@ 近年来,对不同种属16s r DNA序列的大量测定及数据库的建立,为16S r DNA序列分析方法在细菌鉴定中的应用提供了可能。
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不对称PCR扩增检测土壤中的肠道病原菌作者：刘燕孙学明邹晓琳
来源：《科技资讯》2016年第32期
摘要：主要研究内容为通过对最佳反应总体系、反应时间和反应温度等条件进行探索，建立用不对称PCR扩增技术检测土壤中典型肠道病原菌的实验条件。
实验主要目的是通过不对称PCR扩增技术获得大量的单链DNA，为用基因芯片方法检测土壤中的典型肠道病原菌做准备。
应用不对称PCR扩增检测技术对样品进行荧光标记后，与寡核苷酸基因芯片进行杂交，可以提高杂交效率。
关键词：不对称PCR 土壤典型病原菌
中图分类号：X17 文献标识码：A 文章编号：1672-3791（2016）11（b）-0062-02
不对称PCR是指反应体系中两条浓度不一样的引物，在PCR扩增的后期，当其中量少的一条引物被消耗完以后，另一条继续以线性扩增的方式，产生大量的扩增产物单链 DNA。
部队称PCR扩增检测技术可以应用的范围相对较为广泛：如配合RT-PCR扩增技术研究真核DNA外显子、制备单链探针、DNA序列分析等，在寡核苷酸基因芯片的检测应用方面，不对称PCR在标记单链样品方面比常规PCR更有优势，与寡核苷酸芯片杂交效率也较高。
1 材料与方法
1.1 土壤样品
研磨过筛（20目），-80 °C保存备用。
1.2 主要试剂及试剂盒
主要试剂及试剂盒：引物、dNTP、50 bp DNA Ladder，100 bp DNA Ladder、Taq DNA聚合酶、琼脂糖、FastDNASPIN Kit for Soil试剂盒（MP Biomedicals，Solon，OH，USA）。
1.3 主要仪器
凝胶成像系统（Bio-Rad Laboratories，Segrate，Italy），PTC-100 PCR仪（MJ Research，Waltham，MA，USA），Mini-BeadBeater-16TM核酸提取仪（Biospec products，USA），DYY-8B型电泳仪（北京市六一仪器厂）FastPrepTM FP120核酸提取仪（Bio 101，Carlsbad，USA），高速离心机（上海安亭）。
1.4 DNA提取
利用FastDNA SPIN Kit for Soil试剂盒与Mini-BeadBeater-16TM核酸提取仪提取土壤DNA。
主要过程参见FastDNASPIN Kit for Soil试剂盒。
1.5 引物合成
参照文献[1-2]合成引物：UP1：GAAGTCATCATGACCGT
TCTGCAYGCNGGNGGNAARTTYGA，P2r：AGCAGGGTACGGATGTGCGAGCCRTCNACRTCNGCRT
CNGTCAT（R指的是A或者G，Y指的是C或者T，N代表任何碱基）。
1.6 PCR产物电泳检测
0.5×TBE缓冲液，6×上样缓冲溶液，1%（w/v）琼脂糖凝胶，200 V恒压，电泳25～35 min。
2 结果与分析
引物的浓度比up1∶up2r依次为：1∶1、5∶1、10∶1、25∶1、50∶1、75∶1和
100∶1。
从图1可以看出：当引物浓度比为5∶1时产生的单链扩增产物条带比较微弱，随着下游引物的浓度（10∶1、25∶1和50∶1）进一步减小，有较多的单链DNA条带产生。
以上述PCR扩增产物1～7为模板，进行新一轮的PCR扩增，以获得更多的单链DNA扩增产物。
从图2中可以看出：泳道1～3无任何的双链DNA条带产生，泳道4有微弱的单链DNA扩增产物条带产生，泳道5～6有大量的单链DNA条带产生，泳道7扩增产物条带则开始减弱直至消失。
主要原因是不对称PCR线性扩增阶段是在前半程扩增所产生的双链产物的基础上进行的，双链产物的量过少易导致最终生成的单链产物也较少[3]，且指数扩增阶段太短。
3 结语
土壤中具有代表性的肠道病原菌用不对称PCR扩增技术检测的最佳反应条件经验证为：总体系25 μL，其中10×PCR 缓冲液2.5 μL，25 mmol/L Mg2+1.5 μL，2.5 mmol/L dNTP 2.5
μL，引物UP1∶UP2r为50∶1或75∶1，5 U/μL Taq DNA聚合酶0.5μL，ddH2O补足体系。
最佳PCR反应参数为95 ℃，5 min（95 ℃，1 min；68.4℃，1 min；72℃，2 min）35轮循环，72 ℃，10 min。
参考文献
[1]Gyllensten U B，Erlich H A.Nationl Instistutes of Health[J].Proc Natl Acad Sci USA，1988，85（20）：7652-7656.
[2]Tankouo-Sandjong B，A Sessitsh，E Liebana，et al.MLST-v，multilocus sequence typing based on virulence genes，for molecular typing of Salmonella enterica subsp.enterica
serovars[J].Journal of Microbiological Methods，2007（69）：23-36.
[3]孔德明，蒋海燕，沈含煦，等.分子信标用于不对称PCR检测乙型肝炎病毒[J].分析测试学报，2005，24（2）：7-10.。