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玩转四驱(1) 四驱基础知识讲解篇
玩转四驱（1）四驱基础知识讲解篇四驱，是一个很值得讨论的话题，我们在大街上经常能看到贴着4×4或AWD商标的汽车。
相信“四驱”这个概念在每个网友心里都有不同的解释，其实很简单，就是四个车轮都有动力的车就是四驱汽车。
但是要是再往进一步说，四驱车的结构都是一样的嘛？为什么有些恶劣地形有的四驱车能过去有的四驱车过不去？发烧级的四驱车仅仅是外观比较威猛？如果您对这些问题还有疑问，不用着急，在这里可以让您对四驱的一切变得明晰。
一、差速器/差速锁——不能混淆的基础概念！①差速器从世界上第一辆汽车的诞生之后不久，差速器这个东西也就随之诞生了，它存在的意义只有一个——为了汽车能正常转弯。
过去的马车两侧车轮是通过一根硬轴链接的，所以两侧的车轮的转速永远是相同的，因为无法差速，转弯的时候内侧的车轮除了滚动摩擦外还会有滑动摩擦，还好马车的车轮是木头做的，耐磨……同理汽车在转弯的时候也会有同样的问题，如果还是采用一根硬轴链接，那么转弯时汽车的轮胎等部件将会受到严重的损伤。
为了解决这个问题，当今汽车都是两个半轴的设计，将两个半轴链接起来的就是差速器，有了差速器也就允许两侧车轮有转速差。
『直行状态下差速器不工作』『转弯状态下差速器工作』能达到实现两侧车轮转速不一样，最重要的是差速器里面的一组行星齿轮。
为了通俗易懂，我们做一个比喻：差速器壳体里面的一组行星齿轮就可以抽象地看作为只有一个齿的“齿轮”，也就是一根棍子，这个棍子可以链接两侧的半轴，并带动两个半轴旋转。
注意，这个棍子除了随着传动轴公转，同时还可以自转。
如果两侧的车辆受到的摩擦力是相同的，那么这根棍子就不会有自转，即两侧车轮转速也相同；如果有一侧车轮受到的摩擦力大于另一侧，那么这根棍子本身就会发生自转，这样在不改变公转转速的情况加上自转，就可以达到两侧转速不一样的目的。
也就是说，如果一侧的轮子被卡死不能转动了，那也无妨，虽然动力依然存在，但这个会自转的棍子就会带动那个没有被卡死的轮子转动。
实时荧光定量PCR介绍
实时荧光定量PCR介绍
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反应性能确认
实时荧光定量PCR介绍
线性关系、扩增效率确认
相关系数（r2）：大于0.98 PCR扩增效率（E）：0.8-1.2
检测灵敏度确认
35Cycles内可得到好的定量结果。 如果采用SYBR检测方法， 30Cycles内无非特异性产物扩增。
105 104103102101100
105 104 103 102 101 100
• 标准品梯度的选择：5～6个梯度 • 标准品稀释倍数的选择：标准品稀释倍数通常为10
实时荧光定量PCR介绍
4/14/2021 • 21
标准品的种类
DNA样品定量标准品 RNA样品定量标准品
基因组DNA 质粒
Total RNA & cDNA 体外转录RNA
No Template Control确认
30Cycles内无引物二聚体产生。
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主要内容
1. 标准曲线分析
2. 融解曲线分析
3
Real Time PCR解析方法
3. 绝对定量和相对定量解析方法
实时荧光定量PCR介绍
4/14/2021 • 20
标准曲线制作
扩增曲线
标准曲线
（Perfect Real Time）（DRR064）
仪 器 Smart Cycler Ⅱ
实时荧光定量PCR介绍
4/14/2021 • 36
绝对定量应用例 对SARS培养液中所含SARS病毒RNA进行定量
SARS Control RNA构建
SYN247 F01
SYN247 F02
real-time PCR 数据分析
real-time PCR 数据分析无论所使用的real-time PCR是何种型号，正确的数据分析对于获得有效的实验结果都是至关重要的。
这里介绍有关real-time PCR数据分析的知识。
在讨论基本分析过程之前，先介绍如何设计一个好的实验。
如果你是自己设计的引物和探针，那有助于下一步的工作。
但是在有些情况下，人们使用出版文献上的序列会更方便。
记住，即便是出版物提供的序列也不能保证会得到优化的实验结果。
而且排版错误的可能性也需要考虑在内。
所以进入实验室之前使用BLAST对全部序列进行核实确保他们是正确的。
下订单前先检察引物和探针的序列和Tm值是实验设计的基本要求。
标准曲线是判断实验质量的重要手段。
使用一个已知的模板，PCR产物，合成的寡核苷酸或转录的RNA做个标准曲线能够确定PCR的效率，敏感性，动态范围和其他的参数。
建立标准曲线时使用OD260的模板样本。
模板的总量以DNA分子的数量来描述，把质量转化为DNA含量的公式如下：（质量（克）*阿伏伽德罗常数）每个碱基的平均质量*模板的长度。
例如，合成70-mer的单链DNA，样本质量为0.8*10ˆ-11gm。
代入公式得：（0.8*10ˆ-11*6.023*10ˆ23molecules/mole）330gm/mole/base*70 base。
如果使用双链的模板，则碱基的平均质量为660gm/mole/base。
标准曲线使用的模板含量从1*10ˆ7开始连续稀释7次每次稀释10倍，最终得到10个模板拷贝。
这样的浓度有助于得到最高的ΔRn和最低的Ct。
用Excel画曲线时以模板数量的对数值为X，Ct（cycle threshold）值为Y轴。
标准曲线的计算公式如下：y=mx+b。
y就是Ct，m是斜率，x=log10template amount，b=y-intercept。
用斜率计算出实验效率Efficiency【10ˆ（-1/斜率）】-1。
实验效率告诉我们PCR反应的执行情况。
实时荧光定量PCR介绍
•
实时荧光定量PCR介绍
33
相对定量解析方法
管家基因
维持细胞基本代谢活动所必须的基因,
如：GAPDH、β-actin等。
筛选方法
根据文献提供 通过具体实验筛选
实时荧光定量PCR介绍
July 25, 2013
•
34
主要内容
1
Real Time PCR基础知识
绝对定量
2
Real Time PCR实验方法 ◇ 对SARS病毒培养液中所含SARS病毒RNA进行定量分析
△ 引物内部或两条引物之间避免3 base以上的互补序列 △ 引物3’ 末端避免2 base以上的互补序列
使用BLAST检索，确认引物特异性 尽量在Exon junction上设计引物，限制基因组DNA扩增
July 25, 2013
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实时荧光定量PCR介绍
17
Real Time PCR探针设计原则
Real Time PCR用TaqMan探针设计原则
Probe长度 Tm值 序列 5’ 末端序列 互补性
特异性
★★ ★★★ ★ ★ ★★★ ★★★
20-24 bp 探针的Tm比引物高8-10℃
△ 目的序列GC含量相对较高的区域设计 △ 整体上碱基不能过偏 △ 个别部分避免GC rich或AT rich (特别是3’
Real Time PCR解析方法
3. 绝对定量和相对定量解析方法
实时荧光定量PCR介绍
July 25, 2013
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标准曲线制作
扩增曲线 标准曲线
105 104 3 10 2 10 1 10 0 10
105 104 103 102 101 100
视频通信基础知识
视频通信的基本概念 视频通信网络的组成 视频通信标准 H.320 视频通信系统组网 H.323 视频通信系统组网
视频通信基础知识
视频通信的基本概念
视频通信基础知识
Video Conference 视频会议 视讯会议 电视会议 会议电视
电视 会议
视频通信基础知识
Video Communication
• Quarter CIF (QCIF) – 176 x 144
– Refresh rates
• 30, 15, 10, 7.5 times per second
视频通信基础知识
Video Standard - H.261
• Is what traditional videoconferencing has used
29
30
视频通信基础知识
视频通信网络的组成
视频通信基础知识
视频通信
Video Server
视频通信基础知识
视频通信网络的组成
网络
终端 (Endpoint) 视频通信基础知识
终端
视频输入设备
视频输出设备
网络接口
编解码器 （CODEC)
Network
音频输入设备
音频输出设备
视频通信基础知识
视频通信终端分类
▪ 需要大量带宽 ▪ 功能定义 ▪ 服务质量保证 ▪ 目前已很成熟
视频通信基础知识
Video Standard - H.261
• H.261
– Video coding and decoding – Defined image format
• Common Intermediate Format (CIF) – 352 pixels x 288 lines
视频基础知识
一．视频基础知识1. 视频编码原理视频图像数据有极强的相关性，也就是说有大量的冗余信息。
其中冗余信息可分为空域冗余信息和时域冗余信息。
压缩技术就是将数据中的冗余信息去掉（去除数据之间的相关性），压缩技术包含帧内图像数据压缩技术、帧间图像数据压缩技术和熵编码压缩技术。
1.1去时域冗余信息使用帧间编码技术可去除时域冗余信息，它包括以下三部分：A．运动补偿:运动补偿是通过先前的局部图像来预测、补偿当前的局部图像，它是减少帧序列冗余信息的有效方法。
B．运动表示:不同区域的图像需要使用不同的运动矢量来描述运动信息。
运动矢量通过熵编码进行压缩。
C．运动估计:运动估计是从视频序列中抽取运动信息的一整套技术。
注：通用的压缩标准都使用基于块的运动估计和运动补偿。
1.2去空域冗余信息主要使用帧内编码技术和熵编码技术：A．变换编码:帧内图像和预测差分信号都有很高的空域冗余信息。
变换编码将空域信号变换到另一正交矢量空间，使其相关性下降，数据冗余度减小。
B．量化编码:经过变换编码后，产生一批变换系数，对这些系数进行量化，使编码器的输出达到一定的位率。
这一过程导致精度的降低。
C．熵编码:熵编码是无损编码。
它对变换、量化后得到的系数和运动信息，进行进一步的压缩。
2. 视频编码解码标准2.1 H.264H.264是国际标准化组织（ISO）和国际电信联盟（ITU）共同提出的继MPEG4之后的新一代数字视频压缩格式，它即保留了以往压缩技术的优点和精华又具有其他压缩技术无法比拟的许多优点。
H.264最大的优势是具有很高的数据压缩比率，在同等图像质量的条件下，H.264的压缩比是MPEG-2的2倍以上，是MPEG-4的1.5～2倍。
举个例子，原始文件的大小如果为88GB，采用MPEG-2压缩标准压缩后变成3.5GB，压缩比为25∶1，而采用H.264压缩标准压缩后变为879MB，从88GB到879MB，H.264的压缩比达到惊人的102∶1。
Unit 1 科技英语基础知识(一)
4
例1 This electron beam sweeps across each line at a uniform rate，then flies back to scan another line directly below the ， previous one and so on，until the horizontal lines into which it is ， desired to break or split the picture have been scanned in the desired sequence． ． 此句可先分解和简化为如下的简单句: 此句可先分解和简化为如下的简单句 beam sweeps each line， ， then flies back to scan another line， ， it is desired to break picture into lines in desired sequence． ． 全句译为: 电子束以均匀的速率扫描每一行，然后飞速返回 全句译为 电子束以均匀的速率扫描每一行， 去扫描下一行，直到把被扫描的图像按所希望的顺序分割成行。 去扫描下一行，直到把被扫描的图像按所希望的顺序分割成行。
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要成为一个名副其实的内行，需要学到老。 例6 要成为一个名副其实的内行，需要学到老。 这句中， 这句中，有“成为”、“需要”、“学”三个表示动作 成为” 需要” 的词，本句译成英语 的词，本句译成英语: To be a true professional requires lifelong learning. 可以看出， 作为谓语， 可以看出，选“需要(require)”作为谓语，其余两个动 需要 作为谓语 作中的“成为”用不定式形式to be，“学”用动名词形式 作中的“成为”用不定式形式 ， learning，这样才能符合英语语法的要求。 ，这样才能符合英语语法的要求。 把水加热并不会改变水的化学成分。 例7 把水加热并不会改变水的化学成分。 本句有两个动作， 本句有两个动作，即“加热”和“改变”，译成英语: 加热” 改变” 译成英语 Heating water does not change its chemical composition. 本句将“改变”用作谓语，而将“加热” 本句将“改变”用作谓语，而将“加热”(heating)处理 处理 为动名词，连同其宾语 作为本句主语。 为动名词，连同其宾语water作为本句主语。 作为本句主语
Real_Time_PCR
核糖核苷酸
Q
Cycling Probe法基本原理
热变性 退火 酶切 延伸
SYBR Green I法vs Probe法
SYBR Green I 法
◆优点：价栺便宜、使用方便、无需合成特异性探针。 ◆缺点：引物要求高（要求特异性扩增）、不能进行多重PCR。
Probe法
◆优点：特异性强，能进行多重PCR。 ◆缺点：需要设计特异性探针，成本高、有时设计困难。
实时荧光定量PCR
（Real Time PCR）
主要内容
Real Time PCR 基础知识 Real Time PCR 实验方法
Real Time PCR 解析方法
Real Time PCR 应用实例
Real Time PCR 基础知识
Real Time PCR 的用途及原理
Real Time PCR 检测方法
互补性
特异性
★★★
★★★
RT-PCR用引物 ★★
★号表示重要程度，★号越多，表示该参数越重要，设计时要优先考虑
Real Time PCR引物及探针设计
好的引物 需要寻找好的参照序列
目的基因 目的基因序列获得 引物设计 分析序列
RefSeq序列
特异性确认
基因组序列确认 Real Time RT-PCR 引物
Real Time PCR 检测系统
Real Time PCR 用途
定性分析
病毒和病原菌检测 生物品种鉴定
绝对定量
病毒和病原菌定量分析 导入基因拷贝数解析
相对定量
差异显示结果验证 基因芯片结果验证 siRNA效果确认 mRNA表达量分析
SNP解析
GMO定量检测
操作简单，无需电泳，检测快速，降低污染几率， 适用于大量样品检测，检测灵敏度高； 可以在宽广范围内进行准确定量。
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理论基础
聚合酶链式反应作为一种革命性的方法在生物学研究的历史中占据了重要的地位。
以此为基础发展出包括real-time PCR在内的多项应用技术。
自诞生后real-time PCR技术持续发展，从简单的增扩到整个PCR过程，real-time PCR表现出比PCR更敏感、更明确的定量分析特性和对识别等位基因的能力。
不少人以为real-time就是意味着可以在显示器上看到每个循环增扩曲线的增长。
事实并非如此，早期的软件不能在运行期间提供可视化的增扩曲线。
主要是因为SDS软件采用整个平台最终的数据执行数据分析工作，而不是分析每个单独的反应循环。
对某些设备来说，必须向分析软件提供实时的最终的数据，有些设备则不需要。
前一种设备允许软件实时跟踪每个加样口的增扩曲线，同时显示在电脑屏幕上。
Real-time PCR其实是一种real-time设备。
RNA定量分析依靠逆转录酶制作cDNA (complementary DNA)O常见的逆转录酶有2种，AMV 和MMLVo AMV是一种鸟类myeloblastosis病毒的二聚体蛋白质，MMLV来自于鼠科leukemia 病毒的monomeric蛋白。
2种酶都有RNase把RNA变性为RNA-DNA杂交体的活性，比较而言AMV 有更高的RNase H活性。
RNase H活性和依赖于RNA的DNA聚合酶活性能被mutagenesis区分开来。
更重要的是每个AMV能把较多的分子聚拢在一起，推动增扩反应的进行。
原生的AMV 有高于MMLV的适用温度，42°C对37°C。
修改后的变种可以有更高的温度极限，分别是AMV58 °C, MMLV55C
按照以上的描述，大家可能认为改造后的AMV是适宜从RNA制作cDNA的酶。
然而，在实际使用中经改造的MMLV工作的较好。
其中的原因目前仍不明，猜测高温破坏了2种酶的聚合酶活性，但残留的DNA绑定活性对Taq polymerase形成物理障碍。
二聚体构象和较高的温度极限也许使得AMV表现不佳。
出于这个原因应在实验中尽可能少的使用逆转录酶。
需要强调的是即使没有引物cDNA仍然能被逆转录反应制造出来，RNA模板的二级结构可能自我引发反应。
有3种方法可以准备逆转录反应：oligo-dT, random primers or assay-specific primerso 其中oligo-dT的使用较广泛，它使用mRNAs作为模板。
但是不是所有mRNA都有poly-A尾，最大的问题是oligo-dT把增扩区域限制在了mRNA poly-A尾的附近。
当转录较长的片段时(<500bp)反应开始于3' UTRo这样的结果有高的忠实性，也意味着增扩出的序列可能不会跨过一个外显子连接。
对于有些实验，3' UTR富含不利于PCR实验的A/T碱基。
因此使用自由引物制造转录序列放弃3' UTR,但自由引物也同时会制造核糖体和transfer RNAs的cDNA,出现大量且复杂的cDNA。
第三种方法是使用针对每个实验的引物(assay-specific primers),理论上讲这种引物满足转录目标序列的要求，得到相应的cDNA产物。
Real-time PCR反应增扩子的最大长度大约在250 bases,从前面的讨论可知assay-specific primers 是大多数实验较佳的选择。
但是assay-specific primers有2个明显的缺点，每次PCR反应使用较多的RNA样本，不能用于一台仪器上同时处理儿种样本的反应。
注意根据实验需要合理的选择引物，安排实验计划。
现代PCR反应的核心是耐热DNA聚合酶，最常用的是Thermus aquaticus也称Taq。
野生型Taq 是依赖DNA从5->3合成的，具有3->5校对功能的聚合酶，它也有5' -nuclease的活性。
Real-
time
PCR常用变异后移除校对功能的品种n市场上有2种版本的Taq,修改后的Taq和热启动(hot start) Taqo
现今市场上的real-time PCR设备均使用荧光剂作为信号源，荧光的强度随着增扩产物的增加而成比例的增长。
荧光剂分子吸收光线中狭小波长的光子，能被染料吸收的光线叫做激发波长。
激发后的分子处于较高的能量状态，持续时间很短，分子迅速衰退到原先的状态。
在这个过程中一个光子以较长的波长发散出来，对于每一个荧光染料都有一个优化的激发和发散波在狭窄的优化波长范围内，荧光分子能被激发或检测到。
荧光实验主要要求在最初和最后的10个PCR循环中信号强度有尽可能大的差异。
第一个荧光剂染料分子(donor或reporter)由外部的优化波长光线激活后，释放出较长波的光线去激活临近的另一个分子(acceptor),这样的过程称为三角洲。
接受光线的分子可能会也可能不会释放出光线。
每一次的转发过程都会使波长有所增加，直至real-time设备能接收到。
Real-time PCR的荧光剂按照功能区分有3个类型，1. Donor 发散出的荧光信号在实验过程中被检测到。
2. Acceptor倒责冷却Donor发出的信号。
3.是参照染料，参照染料不与其他成分产生反应，软件用它校正不同加样孔的信号。
理论上讲，荧光剂染料可以成为reporter。
常见的染料有6-FAM (6-carboxy fluorescein)和YBR⑶Green I,前一种能被由氧离子激光制造的488 nm的波长激发。
6-FAM容易和寡核昔酸结合释放出一个强信号。
VBR® Green I与6-FAM不同，是一种自由染料。
冷却分子可以是荧光染料也可以是其他能吸收恰当波长的光线能量的分子，原来和6-FAM 一起使用的是TAMRA (6-carboxy-tetramethylrhodamine)o FAM在靠近TAMAR的位置上有效地吸收光子能量。
除此之外，不发光的黑色染料也可用于reporter o常见的有DABSYL (4-(dimethylamino)azobenzene-4T-sulfonyl chloride)o参照组的荧光信号比较每个加样孔的不同，保证每个加样孔的信号在整体上较平稳。
设备上的不同会形成加样孔之间数值的偏差，叫做“边缘效应”，要求对每个加样孔的数值标准化C但是当边缘效应过大，内侧加样孔和外侧加样孔的差距过大就不再适合参照组作为标准化的依据。
常见的参照染料是ROX (6-carboxy-X-rhodamine)
Real-time PCR设备组成
介绍市场上全部real-time PCR的使用不是明智的事，但是知道基本常识，了解设备如何工作，设备结构和物理限制还是有必要的。
Real-time PCR有3大部分，光源：这决定了荧光染料的范围，探测系统：决定了光谱范围和敏感度。
热循环机制：决定了每次实验的速度，样本间统一的温度变化，最佳样本数量。
Real-time PCR的光源有4种，氯离子激光，LED激光，石英卤素鸨灯和依灯。
每一•种不同的光源决定了设备的工作能力，氯离子激光主要的工作光谱在488 nm,对reporter来讲是个高效的波长。
但在红光下488 nm给出一个较弱的染料激发，超过最大的500 nm时伴随弱化的信号。
较弱的信号限制reporter染料的效用。
LED激光发出30-40 nm的光线，输出的能量比氯离子激光微弱，但能源使用费用较低。
常用光源是石英卤素钙灯，这种灯泡能发射出稳定的360 nm 至lOOOnrn波长的光线，覆盖全部可见光，有时也叫“白光”。
与以上提到的激光不同，需使用2组激发和散射滤镜来选择使用的波长，有些设备使用光电倍增管和CCD摄像机捕获信号。
鼐灯的亮度远高于石英卤素鸨灯，波长与其相似。
使用5组激发滤镜和2组散发滤镜。
发展趋势
Real-time PCR呈现出3个发展方向
1.最初的real-time PCR只能处理单一的样本，现在越来越多的设备具有更广阔的运行能力,
许多设备可以提供5至6个独特的激发/发散滤镜。
理论上讲，每个反应可以允许5至6个不同的样本同时实验。
每个reporter#放出的光线按物理手段分开，
2.Real-time PCR设备执行热循环的能力加强了，可装入的样本数量增加，化学试剂的改进缩
短了了每次运行的时间，缩短时间对于高通量用户是最重要的性能指标。
3.提高样本产量。
目前产量最高的real-time PCR是ABI 7900能够一次装入384个样本，这种
容量己经超出一般实验室的需求。
但对某些用户来来讲，更高产的设备1536个样本处理能力成为标准配置。