20DNA的复制和修复

以5’ →3’方向的亲代链为 模
板合成的子代链。
为了解决这个矛盾，冈崎提出了DNA半不连续复 制的模型，认为滞后链是由许多5’ →3’方向合 成的DNA片段（冈崎片段）连接起来的。 前导链是连续合成的 滞后链则是不连续合成
问题：什么叫冈崎片段(Okaxaki fragments)
呢？ 答案：在DNA复制过程中出现一些不连续片段， 它们只存在于DNA复制叉上其中的一股，逆复 制叉移动方向合成（大小：原核生物1000~2000， 真核生物为100~200个核苷酸）的不连续的片段， 称为冈崎片段。
C C A C T G G
G G T G A C C
+
母链DNA
复制过程中形成 的复制叉
子代DNA
• 半保留复制
定义:以DNA分子中的每一条链为模 板,通过碱基配对，合成两个 新的DNA分子(子代DNA)。每个 新DNA分子的两条链中，一条 链来自亲代DNA,另一条链是 新合成的。
•
1953年，Watson和Crick在提出DNA双 螺旋结构模型时就推测DNA可能按照半保 留机制进行自我复制。 • 1958年，Meselson和Stahl用 15 N标记 E.coli. DNA，证明了DNA的复制是半保 留复制。
中的rep蛋白（dna B蛋白）就是解螺旋酶，
还有解螺旋酶I、II、III。每解开一对碱基
需要水解2个ATP分子。
3、单链结合蛋白（SSB）： 稳定DNA解开的单链，防止复性和保护 单链部分不被核酸酶水解。
3、引物合成酶与引发前体
DNA引物酶：依赖DNA的RNA聚合酶，催化引物 RNA的生成。 引发前体:由多种蛋白质dnaA、dnaB、dnaC、n、 n`、n``和i组成。 引发体：由引发前体与引发酶结合组装而成。 含有解螺旋酶、DnaC蛋白、引物酶和DNA复 制起始区域复合结构。
pol-I 5´→3´聚合酶活性 3´→5´外切酶活性 5´→3´外切酶活性 功 能 + + + pol-II + + – 修复 pol-III + + – 复制的 主要酶
切除引物 填补空隙 修复合成
DNA-pol III:
• 由10种亚基（αβγθτδδ’χΨε）组成的不对 称聚合体 • 是原核生物复制延长中真正起催化作用的酶。 夹子装配器： • 催化效率最高。 γ δδ’χΨ
半 保 留 复 制 的 验 证
• DNA
环状DNA的复制特点 1.2 DNA复制的起点和方式
B

A 问题：什么叫复制叉？



单向复制模式（只有一个复制叉） 复制叉----复制开始后由于DNA双 链解开，在两股单链上进行复制， 形成在显微镜下可看到的叉状结 构，称为复制叉 C
意义：DNA连接酶在DNA复制、损伤修复、重组
等过程中起重要作用。
问题：DNA二条链方向相反。已知的DNA聚合酶的合成方向 1.4 DNA的半不连续复制 都是5´→3´，DNA聚合酶如何催化滞后链延伸呢？ 前导链（领头链）：
前导链 以3’ → 5’ 方向的亲代链为 模板合成的子代链。
滞后链
滞后链（随从链）：



双向复制模式（有二个复制叉）
环状DNA的复制眼呈θ结构
线状DNA的双向和单向复制 真核细胞往往有多个复制起始点
思考：什么叫复制子？ 未复制DNA
复制子----把两个相邻起始点之 起始点 间的距离定为一个复制子 单向复制 (replicon) 。
复制叉 复制子是独立完成复制的功能单 起始点 位。 双向复制
γβα
N3
N1 N2 N3 ′ 3 OH ＋ 2Pi
OH
5′
p
p
PPP
′ 5
p
p
p
引物
底物
2.需要模板： 以DNA为模板，是依赖DNA的DNA聚
DNA聚合酶催化的链延长反应 合酶，模板可以是单链，也可以
是双链。 3.引物: 一小段RNA(或DNA）为引物。 在大肠杆菌中，DNA的合成需要一段RNA 链作为引物，引物含3’ -OH. 4.合成方向：5 3 （观看下图：子链的生成） 模板链
DnaB蛋白（解螺旋酶）三个13bp的序列为解链位点。在 DnaC蛋白帮助下将双螺旋解开成单链状态，分别作为模板， 合成其互补链(另外，双链的解开还需DNA拓扑异构酶Π、 SSB) 。
1、拓扑异构酶解开超螺旋。
2、DnaA蛋白识别复制原点 oriC 。
3 、DnaB解螺旋酶借助于水 解ATP产生的能量在Dna C的 帮助下沿5’ →3’ 方向移 动，解开DNA双链，形成前引 发复合物。 4、SSB（单链结合蛋白）结 合于DNA单链。
超螺旋，有利于DNA解链。
研究表明：几乎所有天然状态的双链DNA均以负
超螺旋（即右手拓扑结构）的方式存在，特别是 进行半保留复制的DNA均以拓扑异构体的形式存在。
拓扑异构酶：可松弛（即解开）DNA超螺旋，有 利于DNA解链。
思考：参与蛋白质复制叉移动的蛋白质主要 有哪些？
2、解螺旋酶（解链酶）： 通过水解ATP将DNA两条链打开。E.coli
3´
5´
RNA引物
5´
子链
3´
Arthur Kornberg 1918
Stanford University Stanford, CA, USA
The Nobel Prize in Physiology or Medicine 1959
"for their discovery of the mechanisms in the biological synthesis of ribonucleic acid and deoxyribonucleic acid"
旋结构模型有什么特点？表示DNA的几级结
构?
问题： 什么是碱基配对原则？ 问题： DNA有没有三级结构?情况如何?
环状DNA的三级结构通常为负超螺旋（右手拓扑结构）
右旋 环状 DNA
负超螺旋
固定
（右手拓扑结构）
观察染色体的整个形成过程的动态变化
线状为念珠状三级结构
本章要点：
1 2 3 4 5 半保留复制 参与复制的物质 复制的过程 修复 逆转录
聚合反应机理：
5'
P
5'
O G
3'
引物 P
3'
5'
C 模 3'
O A
3'
T
板 链 5'
OH
P
P
P
5'
O T T A
3' 3'
OH
5′→ 3′聚合反应的特点：
(1) 以单链DNA为模板 (2) 以dNTP为原料 (3) 引物提供3´-OH (4) 聚合方向为5´→3´
核酸外切酶活性
5´→3´外切酶活性： 切除引物 填补缺口 （修复）
5、Dna G蛋白（引物合成酶） 开始合成RNA引物（10个bp左 右），方向为5′→ 3′
二、复制的延长
DNA聚合酶Ⅲ 由其β亚单位辨认引物，新 链的第一个脱氧核苷酸与引物的3`-OH形成磷酸 二酯键，开始复制。
前导链 滞后链 冈崎片段
RNA引物
DNA聚合酶III
DNA聚合酶I
3´
5´
RNA引物
3´
5´
1.3 DNA聚合反应有关的酶
(一) DNA聚合酶（DNA-pol） ：1956年Kornberg等 在大肠杆菌中首先发现DNA聚合酶。该酶的催化性质 如下：
• 1.底物 ： dNTP(dATP,dGTP,dCTP,dTTP）
N1 N2 ′ 3 OH 5′ ＋
• 原核生物：以大肠杆菌为例
DNA-polⅠ：与校读，修复有关
5′→ 3′聚合酶功能：但持续合成DNA的能力差。
5′→ 3′外切酶活性：双链有效。推测该酶主要是 对DNA损伤的修复，以及在DNA复制时RNA引 修复 物切除及其缺口的填补。
3′→ 5′外切活性：此活性只作用于生长中不配对 校对 的（错配）的单链，校对功能。
核酸一章内容复习提问？
• 问题：DNA双螺旋模型是谁在哪年提出来的？
问题： Watson和F. Crick 提出的DNA双螺
旋结构模型有什么特点？表示DNA的几级结
构?
DNA的二级结构—B型双螺旋结构
5` 1.反向、平行、右手螺旋 2.链间碱基配对相连 3.每10个碱基对螺旋上升一 周
3`
小沟
Байду номын сангаас
大沟 3` 5`
引发体的功能：
Dna B、 Dna C、DnaG Dna A 5 3 DNA拓扑异构酶
解 螺 旋 酶
3
SSB
5
引发体的移动与复制叉移动的方向相同,具 有识别合成起始位点的功能。当移动到一定位 置上即可引发RNA引物的合成。
注 意 各 酶 的 作 用 次 序
1.6 DNA 复制的过程
复制叉的 移动方向
起始点
复制叉
复制子
复制叉
大肠杆菌只有一个复制起始点
大肠杆菌双链环状DNA的复制（一个复制起点， 双向复制） 真核细胞线状染色体DNA的复制方式（多个复制起 点，双向复制） 单向滚环式复制（噬菌体X174DNA—单链环状）
D-环式复制方式（线粒体双链环状DNA）
5´
3´
解旋酶 解链酶 引物酶和引发体 SSB
大肠杆菌复制起点为成串排列的重复序列
复制原点oriC和原点的识别：
大肠杆菌的复制原点称为oriC，由245个bp构成。含 两组保守的重复序列：三个13bp的序列（富含A、T的序 列）和四个9bp的序列；许多生物的复制原点也富含A、 T的区段。