影响PCR的因素
pcr基因表达趋势不符合的原因
pcr基因表达趋势不符合的原因
PCR基因表达趋势不符合的原因可能有多种，包括：
1. 实验误差：PCR实验中可能存在技术上的误差，如反应条
件的不准确、试剂的质量差异等，这些误差可能导致基因表达趋势不符合预期。
2. 样本异质性：PCR实验通常需要使用组织或细胞样本，可
能存在样本异质性的问题。
不同细胞或组织中可能存在基因表达异质性，导致PCR的结果不符合预期。
例如，细胞中存在
亚群细胞，其中部分细胞表达某个基因，而其他细胞则不表达，这可能导致PCR结果不一致。
3. 技术局限性：PCR作为一种定性或定量分析技术，存在一
定的局限性。
例如，在低拷贝数的基因表达水平下，PCR的
灵敏度可能不足，无法检测到基因的表达。
此外，PCR对于
高度变异的基因序列可能出现特异性问题，导致结果不准确。
4. 不完全反应：PCR反应所需的温度梯度和反应时间可能无
法覆盖到所有需要扩增的片段，导致某些基因片段未被扩增，从而影响结果。
综上所述，PCR基因表达趋势不符合预期可能是由于实验误差、样本异质性、技术局限性或不完全反应等因素造成的。
为了获得可靠的结果，建议在进行PCR实验时严格控制实验条件，使用多个样本重复实验，并结合其他实验方法进行验证。
引物设计退火温度,gc含量,长度
引物设计退火温度,gc含量,长度
本文将讨论如何设计引物的退火温度、GC含量以及长度。
引物
是PCR反应中的重要组成部分，其设计质量直接影响PCR反应的成功率和特异性。
因此，合理的引物设计对于PCR实验的成功至关重要。
首先，引物的退火温度是影响PCR反应特异性的重要因素。
退火温度过高会导致引物与非特异性的DNA结合，从而降低PCR反应特异性。
退火温度过低则会导致引物无法与目标DNA结合，影响PCR反应的灵敏度。
因此，引物的退火温度应该在50℃-65℃之间，一般情况下，引物的退火温度应该以引物的长度、序列及GC含量等因素为基础，根据实验者的经验和调整，最终确定。
其次，引物的GC含量也是影响PCR反应特异性的重要因素。
GC
含量过高或过低都会影响引物与目标DNA的互补性，从而影响PCR反应的特异性和灵敏度。
一般情况下，引物的GC含量应该在40%-60%
之间，如果引物长度较短，可降低GC含量，反之，则可增加GC含量。
需要注意的是，引物序列中不应该出现连续的GC或AT碱基，这会影响引物的互补性。
最后，引物的长度也是影响PCR反应特异性和灵敏度的重要因素。
引物长度过短会导致引物与非特异性DNA结合，影响PCR反应的特异性。
引物长度过长则会影响PCR反应的灵敏度。
一般情况下，引物长度应该在18-24个核苷酸之间。
综上所述，引物的退火温度、GC含量和长度是影响PCR反应特
异性和灵敏度的关键因素，实验者需要根据引物设计的目的和实验需
求，合理设计引物的这三个参数。
PCR反应体系模板浓度
PCR反应体系模板浓度引言PCR（聚合酶链式反应）是一种重要的分子生物学技术，广泛应用于生物医学研究、基因工程和临床诊断中。
PCR反应体系中的模板浓度是影响PCR反应效果的重要因素之一。
本文将介绍PCR反应体系模板浓度的相关知识，并探讨其在PCR实验中的影响和优化方法。
PCR反应体系模板浓度的意义PCR反应的目的是通过反复复制DNA模板，快速扩增特定DNA序列。
模板浓度直接影响PCR反应的效率和特异性。
若模板浓度过低，PCR反应可能无法得到充分扩增；而模板浓度过高，则可能导致非特异扩增和产物过多。
因此，合理调控PCR反应体系中的模板浓度非常重要。
模板浓度的确定方法常用的确定模板浓度的方法包括比色法、浓度计测定法和凝胶电泳法等。
其中，比色法是一种快速估测模板浓度的方法，通过观察DNA溶液的颜色深浅来判断浓度。
浓度计测定法可以精确测定DNA的浓度，但需要专业仪器。
凝胶电泳法是一种常用的手段，可以根据DNA在凝胶中的行迹快慢来判断模板浓度。
模板浓度对PCR反应的影响扩增效率模板浓度直接影响PCR反应的效率。
一般而言，适中的模板浓度能够提高PCR反应的扩增效率。
若模板浓度过低，反应产物过少，无法被有效检测；若模板浓度过高，反应产物过多，可能导致假阳性和非特异扩增。
特异性合适的模板浓度可以提高PCR反应的特异性。
当模板浓度适宜时，扩增产物主要来自于目标序列，特异性较高。
然而，模板浓度过高可能导致非特异性扩增，产生非特异性产物，影响稳定性和解析性。
模板浓度的优化为了获得更好的PCR反应结果，需要对PCR反应体系中的模板浓度进行优化。
以下是一些建议：适当稀释若已确定的模板浓度较高，可以通过适当稀释来降低模板浓度。
稀释后的模板浓度应能够保证PCR反应产物的特异性，同时减少非特异性扩增的可能性。
优化试剂浓度优化PCR反应体系中其他试剂的浓度，如聚合酶、引物、缓冲液等。
适当调整这些试剂的浓度，可以进一步提高PCR反应的特异性和扩增效率。
PCR注意事项
影响PCR的主要因素PCR技术必须有人工合成的合理引物和提取的样品DNA，然后才进行自动热循环，最后进行产物鉴定与分析。
引物设计与合成目前只能在少数技术力量较强的研究院、所进行，临床应用只需购买PCR 检测试剂盒就可开展工作，PCR自动热循环中影响因素很多，对不同的DNA样品，PCR反应中各种成份加入量和温度循环参数均不一致。
现将几种主要影响因素介绍如下。
一、温度循环参数在PCR自动热循环中，最关键的因素是变性与退火的温度。
如操作范例所示，其变性、退火、延伸的条件是：94℃60s, 37℃60s, 72℃120s，共25～30个循环，扩增片段500bp。
在这里，每一步的时间应从反应混合液达到所要求的温度后开始计算。
在自动热循环仪内由混合液原温度变至所要求温度的时间需要30～60s，这一迟滞时间的长短取决于几个因素，包括反应管类型、壁厚、反应混合液体积、热源（水浴或加热块）以及两步骤间的温度差，在设置热循环时应充分给以重视和考虑，对每一仪器均应进行实测。
关于热循环时间的另一个重要考虑是两条引物之间的距离；距离越远，合成靶序列全长所需的时间也越长，前文给出的反应时间是按最适于合成长度500bp的靶序列拟定的。
下面就各种温度的选择作一介绍。
1．模板变性温度变性温度是决定PCR反应中双链DNA解链的温度，达不到变性温度就不会产生单链DNA模板，PCR也就不会启动。
变性温度低则变性不完全，DNA双链会很快复性，因而减少产量。
一般取90～95℃。
样品一旦到达此温度宜迅速冷却到退火温度。
DNA变性只需要几秒种，时间过久没有必要；反之，在高温时间应尽量缩短，以保持Taq DNA聚合酶的活力，加入Taq DNA聚合酶后最高变性温度不宜超过95℃。
2．引物退火温度退火温度决定PCR特异性与产量；温度高特异性强，但过高则引物不能与模板牢固结合，DNA扩增效率下降；温度低产量高，但过低可造成引物与模板错配，非特异性产物增加。
pcr反应荧光信号通道串扰的原因
pcr反应荧光信号通道串扰的原因下载提示：该文档是本店铺精心编制而成的，希望大家下载后，能够帮助大家解决实际问题。
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影响PCR成功的因素
25μl 25μl
DNA Typer 15
20μl
不含Taq酶，需用AB公 司金牌Taq酶
不含内标（Liz），需 单独购买
Taq酶？？
Goldeneye16A所选位点的特点
❖ 全部13个CODIS规定位点
❖ PentaD和PentaE是5核苷酸重复的位点，相比4核 苷酸重复的其它位点，stutter比例明显更低，有利 于区分混合模板
16A和16BT对软、硬件的要求
❖ 软件要求：Genemapper软件 ❖ 硬件要求：ABI 3100Avant，3100，3130，3130xl，3730，
3730xl
❖ ABI 310测序仪因使用苹果电脑，必须用软件将原始数据转化成windows 文件，再导入Genemapper才能分析
❖ Genemapper3.2的安装要求：PC机，256M以上的内存。 256M内存但使用集成显卡的电脑安装不上。
毛细管数量 无（淘汰）
1根 4根 16根 4根 16根 48根 96根
搭配苹果电 脑，不能直 接使用我们 的试剂盒
自动灌胶，费胶
名称
Powerplex 16 （简称PP16)
生产商
Promega
AmpFlSTR Identifiler Applied
（简称ID)
Biosystems
AmpFlSTR Profiler Applied Plus ID（简称Plus） Biosystems
Goldeneye16BT的一个使用特例
❖ 需要指出的是，O的另外一个等位基因O2，在261位没有缺 失G，所以当本试剂盒检测到O/O2血型样本时，会误判为 A/O型。
❖ 但是，迄今为止没有在中国人群和日本、韩国等亚洲人群中 发现这一等位基因，并且在其他种族人群中频率极低，所以 用本试剂盒检测中国人群ABO血型能够得到准确的分型。
高中生物学pcr技术中引物相关问题归类分
高中生物学pcr技术中引物相关问题归类分一、引物特异性问题引物特异性是PCR技术中的关键问题之一，它直接影响到PCR 产物的数量和纯度。
引物特异性主要取决于其与模板序列的匹配程度。
以下是一些引物特异性相关问题：1. 引物长度和碱基组成：引物长度和碱基组成对引物特异性有一定影响。
一般来说，引物长度适中，不宜过长或过短。
碱基组成上，避免使用GC含量过高或AT含量过低的引物，以免影响引物的稳定性。
2. 模板序列变化：模板序列中任何微小的变化都可能导致引物与模板的错配，从而影响PCR产物的数量和纯度。
因此，在设计和选择引物时，应仔细考虑模板序列的变化，确保引物与模板序列的匹配度。
3. 酶切位点的干扰：如果模板序列中含有酶切位点，则需要注意酶切位点对引物特异性的影响。
在设计引物时，应避免将酶切位点设计在引物自身或与其互补的序列中，以减少错配的可能性。
二、引物自身互补问题PCR过程中，引物自身互补也是常见的问题之一。
引物在退火过程中可能会发生自身互补，从而导致非特异性产物的产生。
以下是一些关于引物自身互补的相关问题：1. 引物浓度和退火温度：引物浓度和退火温度是影响引物自身互补的重要因素。
降低引物浓度或提高退火温度可以减少引物自身互补的可能性。
2. 引物长度和碱基组成：引物长度和碱基组成也会影响引物自身互补的可能性。
选择适当的引物长度和碱基组成，可以提高引物的稳定性，减少自身互补的发生。
三、其他相关问题1. Mg2+浓度的影响：Mg2+浓度是PCR过程中的关键因素之一。
过高或过低的Mg2+浓度都可能导致PCR产物的数量和纯度受到影响。
在设计和优化PCR反应体系时，应注意Mg2+浓度的选择。
2. 延伸温度的选择：PCR产物延伸温度也是影响PCR产物的数量和纯度的因素之一。
选择适当的延伸温度可以减少非特异性产物的产生，提高PCR产物的纯度。
总之，在高中生物学PCR技术中，引物特异性、引物自身互补和其他相关问题是需要关注和解决的。
pcr标准反应体系
pcr标准反应体系PCR标准反应体系。
PCR（Polymerase Chain Reaction）是一种分子生物学技术，用于扩增DNA片段。
PCR标准反应体系是PCR技术中非常重要的一环，它的稳定性和准确性直接影响到PCR扩增的结果。
本文将介绍PCR标准反应体系的组成和影响因素。
PCR标准反应体系由DNA模板、引物、酶、缓冲液、dNTPs和水组成。
其中，DNA模板是待扩增的DNA片段，引物是用于识别目标DNA序列的寡核苷酸片段，酶是用于DNA合成的酶，缓冲液用于维持反应体系的pH值，dNTPs是四种脱氧核苷酸，用于DNA合成，水则是PCR反应的溶剂。
这些组分的比例和质量都会对PCR反应的效果产生影响。
首先，DNA模板的质量和浓度会直接影响到PCR扩增的效果。
如果DNA模板的质量不好或者浓度过低，会导致PCR扩增产物稀少或者根本无法扩增。
因此，在进行PCR反应前，需要对DNA模板进行质量和浓度的检测，以确保PCR反应的准确性和稳定性。
其次，引物的设计和浓度也是影响PCR反应的重要因素。
引物的设计需要考虑到目标DNA序列的特点，如GC含量、碱基序列等，以确保引物能够特异性地识别目标DNA序列。
引物的浓度过高或者过低都会影响到PCR反应的效果，因此需要进行引物的优化实验，确定最佳的引物浓度。
酶是PCR反应中的关键因素之一，不同的酶具有不同的特性，如热稳定性、扩增速率等。
选择合适的酶对PCR反应的效果至关重要。
同时，酶的浓度也需要进行优化实验，以确定最佳的酶浓度。
缓冲液的选择和pH值的调节可以影响PCR反应的特异性和效率。
不同的缓冲液具有不同的缓冲能力和离子强度，因此需要根据实验需求选择合适的缓冲液。
同时，缓冲液的pH值也需要进行调节，以确保PCR反应在最适宜的pH条件下进行。
dNTPs是PCR反应中必不可少的组分，它们是DNA合成的基本原料。
因此，dNTPs的质量和浓度也会对PCR反应产生影响。
需要注意的是，dNTPs的浓度过高或者过低都会影响到PCR反应的效果，因此需要进行优化实验，确定最佳的dNTPs浓度。
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影响PCR反应得条件 (1) 引物: 引物就是PCＲ特异性反应得关键,ＰCＲ 产物得特异性取决于引物与模板ＤＮA互补得程度。ﻫ设计引物应遵循以下原则: ①引物长度: 15—3０bｐ,常用为20bp左右、 ②引物扩增跨度: 以200－５０0bp为宜,特定条件下可扩增长至10kb得片段。ﻫ③引物碱基:G+C 含量以40—６0％为宜,G+Ｃ太少扩增效果不佳,G+Ｃ 过多易出现非特异条带。ATGC最好随机分布,避免５ 个以上得嘌呤或嘧啶 核苷酸得成串排列。ﻫ④避免引物内部出现二级结构,避免两条引物间互补,特别就是3’端得互补,否则会形成引物二聚体,产生非特异得扩增条带、ﻫ⑤引物3'端得碱基,特别就是最末及倒数第二个碱基,应严格要求配对,以避免因末端碱基不配对而导致ＰＣＲ失败。 ⑥引物中有或能加上合适得酶切位点, 被扩增得靶序列最好有适宜得酶切位点, 这对酶切分析或分子克隆很有好处。 ⑦引物得特异性:引物应与核酸序列数据库得其它序列无明显同源性。引物量: 每条引物得浓度０、1～１ｕmol或１0～1００pｍol,以最低引物 量产生所需要得结果为好,引物浓度偏高会引起错配与非特异性扩增,且可增加引物之间形成二聚体得机会。
(２)酶及其浓度 目前有两种Taq DNA聚合酶供应, 一种就是从栖热水生杆菌中提纯得天然酶,另一种为大肠菌合成得基因工程酶。催化一典型得PCR反应约需酶量2.5U(指总反应体积为10０ul时),浓度过高可引起非特异性扩增,浓度过低则合成产物量减少、
(3)ｄNTP得质量与浓度 ｄNＴP得质量与浓度与PCR扩增效率有密切关系,dＮＴＰ粉呈颗粒状,如保存不当易变性失去生物学活性、dＮTP溶液呈酸性,使用时应配成高浓度后,以１M ＮａＯH或１M Tｒis.ＨCL得缓冲液将其 PＨ调节到7、0~7。５,小量分装, -20℃冰冻保存。多次冻融会使dNTＰ降解。在PＣＲ反应中,dNTP应为50～２０0umol/L,尤其就是注意4种ｄNTＰ得浓度要相等( 等摩尔配制),如其中任何一种浓度不同于其它几种时(偏高或偏低),就会引起错配、浓度过低又会降低PＣR产物得产量。dNＴＰ能与Mg2＋结合,使游离得Mg2+浓度降低。ﻫ (4)模板(靶基因)核酸 模板核酸得量与纯化程度,就是ＰCR成败与否得关键环节之一,传统得DＮA纯化方法通常采用SDS与蛋白酶K 来消化处理标本。SDS得主要功能就是: 溶解细胞膜上得脂类与蛋白质,因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜,并解离细胞中得核蛋白,SDS还能与蛋白质结合而沉淀; 蛋白酶Ｋ 能水解消化蛋白质,特别就是与DNA结合得组蛋白,再用有机溶剂酚与氯仿抽提掉蛋白质与其它细胞组份,用乙醇或异丙醇沉淀核酸。提取得核酸即可作为模板用于PCＲ反应、一般临床检测标本,可采用快速简便得方法溶解细胞,裂解病原体,消化除去染色体得蛋白质使靶基因游离,直接用于PCR扩增。RNA模板提取一般采用异硫氰酸胍或蛋白酶K 法,要防止RNａsｅ降解RNA、
(５)Mｇ２＋浓度 Mｇ２+对PCR扩增得特异性与产量有显著得影响,在一般得ＰCＲ反应中,各种dNTP浓度为20０uｍol/Ｌ时,Mg2+浓度为1。5~２。０mmol/Ｌ为宜。Mg２+浓度过高,反应特异性降低,出现非特异扩增,浓度过低会降低Tａq DNA聚合酶得活性,使反应产物减少。ﻫ (6)温度与时间得设置: 基于PＣR原理三步骤而设置变性—退火－延伸三个温度点。在标准反应中采用三温度点法,双链DNＡ在90～９5℃变性,再迅速冷却至40 ~6０℃,引物退火并结合到靶序列上,然后快速升温至７０~75℃,在Tａq DＮA 聚合酶得作用下,使引物链沿模板延伸、对于较短靶基因(长度为100～3０0bp时)可采用二温度点法, 除变性温度外、退火与延伸温度可合二为一,一般采用９4℃变性,65℃左右退火与延伸(此温度Tａｑ DNA酶仍有较高得催化活性)。ﻫ①变性温度与时间:变性温度低,解链不完全就是导致PCR失败得最主要原因。一般情况下,93℃~９4℃lmin足以使模板ＤNA变性,若低于９3℃则需延长时间,但温度不能过高,因为高温环境对酶得活性有影响、此步若不能使靶基因模板或PＣR产物完全变性,就会导致ＰCR失败。
②退火(复性)温度与时间:退火温度就是影响PCR特异性得较重要因素。变性后温度快速冷却至４0℃~６０℃,可使引物与模板发生结合。由于模板DNA 比引物复杂得多,引物与模板之间得碰撞结合机会远远高于模板互补链之间得碰撞。退火温度与时间,取决于引物得长度、碱基组成及其浓度,还有靶基序列得长度。对于20 个核苷酸,G+C含量约50％得引物,55℃为选择最适退火温度得起点较为理想。引物得复性温度可通过以下公式帮助选择合适得温度: Ｔｍ值(解链温度)=4(G+C)＋2(A+T)ﻫ复性温度=Tｍ值-(5～１0℃)ﻫ在Ｔm值允许范围内, 选择较高得复性温度可大大减少引物与模板间得非特异性结合,提高PCR反应得特异性、复性时间一般为3０～6０ｓec,足以使引物与模板之间完全结合。
③延伸温度与时间:Ｔａq DNA聚合酶得生物学活性:70ﻫ～80℃ 150 核苷酸/S／酶分子ﻫ70℃ 6０ 核苷酸/S/酶分子 55℃ 24 核苷酸／S/酶分子ﻫ高于９０℃时, DＮA 合成几乎不能进行。 ＰCＲ反应得延伸温度一般选择在70~75℃之间,常用温度为7２℃,过高得延伸温度不利于引物与模板得结合。PCR延伸反应得时间,可根据待扩增片段得长度而定,一般1Kｂ以内得DNA片段,延伸时间１miｎ就是足够 得。3~4kb得靶序列需3～4min;扩增10Kb 需延伸至15mｉｎ。延伸进间过长会导致非特异性扩增带得出现、对低浓度模板得扩增,延伸时间要稍长些。ﻫ (7)循环次数 循环次数决定PCR扩增程度、ＰCR循环次数主要取决于模板DNA得浓度。一般得循环次数选在30~40次之间,循环次数越多,非特异性产物得量亦随之增多。 影响ｐcｒ特异性得因素ﻫ通过上述内容,可以瞧出有许多因素可以影响pcr得特异性,在此我们作一归纳,供大家参考:①退火步骤得严格性:提高退火温度可以减少不匹配得杂交,从而提高特异性。②减短退火时间及延伸时间可以减少错误引发及错误延伸。③引物二聚体就是最常见得副产品,降低引物及酶得浓度也可以减少错误引发,尤其就是引物得二聚化。④改变mgｃl２(有时ｋcｌ)浓度可以改进特异性,这可能就是提高反应严格性或者对tａq酶得直接作用。 一般认为PCR产物应在48ｈ以内完成电泳检测,有些最好于当日电泳检测,大于48h后带型就会出现不规则,甚至消失。 Ｔrｏuble ｓhoｏtiｎg guide1ﻫ、假阴性,不出现扩增条带 PCＲ反应得关键环节有①模板核酸得制备,②引物得质量与特异性,③酶得质量, ④PCR循环条件、寻找原因亦应针对上述环节进行分析研究。 模板:①模板中含有杂蛋白质,②模板中含有Tａq酶抑制剂,③模板中蛋白质没有消化除净,特别就是染色体中得组蛋白,④在提取制备模板时丢失过多,或吸入酚、⑤模板核酸变性不彻底。在酶与引物质量好时,不出现扩增带,极有可能就是标本得消化处理,模板核酸提取过程出了毛病,因而要配制有效而稳定得消化处理液,其程序亦应固定不宜随意更改、 酶失活:需更换新酶,或新旧两种酶同时使用,以分析就是否因为酶得活性丧失或不够而导致假阴性。需注意得就是有时PＣR时忘了加Taｑ酶或电泳时忘了加溴化乙锭。ﻫ引物:引物质量、引物得浓度、两条引物得浓度就是否对称,就是PＣR失败或扩增条带不理想、容易弥散得常见原因。有些批号得引物合成质量有问题,两条引物一条浓度高,一条浓度低,造成低效率得不对称扩增,对策为:①选定一个好得引物合成单位。②引物得浓度不仅要瞧ＯD值,更要注重引物原液做琼脂糖凝胶电泳,一定要有引物条带出现,而且两引物带得亮度应大体一致,如一条引物有条带,一条引物无条带,此时做PCR有可能失败,应与引物合成单位协商解决、如一条引物亮度高,一条亮度低,在稀释引物时要平衡其浓度。③引物使用过程中应高浓度小量分装保存,防止多次冻融或长期放冰箱冷藏部分,导致引物变质降解失效。④引物设计不合理,如引物长度不够,引物之间形成二聚体等。ﻫMg2+浓度:Mｇ2+离子浓度对PCR扩增效率影响很大,浓度过高可降低PCR扩增得特异性,浓度过低则影响PCＲ扩增产量甚至使PCR扩增失败而不出扩增条带、ﻫ反应体积得改变:通常进行PＣR扩增采用得体积为20μｌ、30μl、50μｌ或1０0μｌ,应用多大体积进行ＰCR扩增,就是根据科研与临床检测不同目得而设定,在做小体积如20μl后,再做大体积时,一定要重新摸索条件,否则容易失败。 物理原因:温度对PＣR扩增来说相当重要。如果变性温度低,变性时间短,极有可能出现假阴性;退火温度过低,可导致非特异性扩增而降低特异性扩增效率;退火温度过高,影响引物与模板得结合而降低PCR扩增效率。有时还有必要用标准得温度计,检测一下PCＲ仪或水浴锅内得变性、退火与延伸温度,这也就是PCR失败得原因之一。 靶序列变异:如靶序列发生突变或缺失,影响引物与模板特异性结合,或因靶序列某段缺失使引物与模板失去互补序列,其PＣR扩增就是不会成功得、 2.假阳性ﻫ引物设计不合适:选择得扩增序列与非目得扩增序列有同源性,因而在进行PCＲ扩增时,扩增出得PCＲ产物为非目得性得序列、靶序列太短或引物太短,容易出现假阳性。需重新设计引物、ﻫ靶序列或扩增产物得交叉污染:这种污染有两种原因:一就是整个基因组或大片段得交叉污染,导致假阳性。这种假阳性可用以下方法解决:①操作时应小心轻柔,防止将靶序列吸入加样器内或溅出离心管外。②除了酶及其她不耐高温得物质外,所有试剂或器材均应高压消毒、所用离心管及进样枪头均应一次性使用。③必要时,在加标本前,反应管与试剂用紫外线照射,以破坏存在得核酸。二就是空气中得小片段核酸污染,这些小片段比靶序列短,但有一定得同源性。可互相拼接,与引物互补后,可扩增出PCＲ产物,而导致假阳性得产生,可用巢式PCR方法来减轻或消除。ﻫ ３.出现非特异性扩增带 PCR扩增后出现得条带与预计得大小不一致,或大或小,或者同时出现特异性扩增带 与非特异性扩增带。非特异性条带得出现,其原因:一就是引物与靶序列不完全互补、或引物聚合形成二聚体。二就是Mｇ2+离子浓度过高、退火温度过低,及PCR循环次数过多有关。其次,就是酶得质与量,往往一些来源得酶易出现非特异条带而另一来源得酶则不出现,酶得量过多有时也会出现非特异性扩增。其对策有:①必要时,重新设计引物。②减低酶得量或调换另一来源得酶。③降低引物量,适当增加模板量,减少循环次数、④适当提高退火温度或采用二温度点法(93℃变性,65℃左右退火与延伸,也叫两步法)。