Caco-2细胞体外吸收模型的建立及验证[001]
Caco_2细胞体外吸收模型的建立及评估
Caco 2细胞体外吸收模型的建立及评估帕丽达 阿不力孜,丛媛媛,米仁沙 牙库甫,王 勇(新疆医科大学药学院,新疆乌鲁木齐830011)摘 要:目的:建立Caco 2细胞体外吸收模型并对其进行评估。
方法:将细胞接种在T ranswel 转运培养槽的微孔滤膜上,进行体外培养。
采用细胞形态学、跨膜电阻值(T EER)和表观渗透系数(P app )及碱性磷酸酶活性等指标对细胞模型进行检测。
结果:培养21d 后,细胞间形成紧密连接,跨膜电阻值达到恒定值,为500 /cm 2,表观渗透系数低于0.5 10-6cm/s;肠腔侧碱性磷酸酶活性显著高于基底侧酶活性。
结论:在本实验室条件下构建的Caco 2细胞模型在形态上与小肠上皮细胞相似,细胞已产生极性,可作为小肠吸收的体外模型。
关键词:Caco 2细胞;吸收;跨膜电阻;表观渗透系数;碱性磷酸酶中图分类号:R927.2 文献标识码:A 文章编号:1673 2197(2011)04 0006 02收稿日期:2011 01 15基金项目:国家自然科学基金资助项目(30860390)作者简介:帕丽达 阿不力孜(1962-),女,新疆医科大学博士研究生,研究方向为维药活性成分和生药学。
Establishment and Assessment of Caco 2Cell in Vitro Absorption ModelPalida A bulizi,Cong Yuanyuan,M irensha Yakufu,Wang Yong(Colleg e of Pharm acy,Xinjiang M edical U niv ersity ,U rumqi 830011,China)Abstract:Objective:To establish and assess the Caco 2cell in vitro absorption model.Methods:Caco 2cells were cultured on t hemillipore filt ers fixed inTranswell transport chamber.T he cell morphology,transepithelial electrical resistance,the apparent peme ability coefficients and alkaline phosphatase activities were monitored during culture.Results:After 21days of in vit ro culture,for mation of tight junction w as observed betw een the cells.T he transepithelial elect rical resistance reach a relatively stable value of 500/cm 2,apparent pemeability coefficient s w as low er than 0.5 10-6cm/s;and the alkaline phosphatase activity in the apical side w as significantly higher t han t hat in t he basolateral side.C onclusion:T he established Caco 2cell model shows similar morphology to in testinal epithelial cells wit h formation of polarity,and can be used as an in vitro model for absorption studies.Key Words:Caco 2Cell;Absorpt ion;T ransepithelial Electrical Resist ance;the Apparent Pemeability Coefficients ;Alkaline Phos phataseCaco 2细胞系来源于人结肠腺癌细胞,在培养条件下形成极性单细胞层,接种到碳酸聚酯膜基质上,可分化出绒毛面(Apical Side,AP 端、肠腔侧、顶端)和基底面(Baso Lat eral Side,BL 端、肠壁侧、底端),能够表达刷状缘(纹绿)酶、某些细胞色素药物代谢酶和异构酶等。
Caco-2 细胞模型的研究与应用
的波动性对结果有不同程度的影响。
Caco－2 细胞形成的细胞间紧密联结比在小肠上皮细胞中更具 特征性,其TEER 值比正常小肠上皮细胞高，限制了水溶性小分 子药物穿细胞间转运的应用研究。 Caco－2 细胞的吸收转运体表达较小肠上皮的低,因而在主动转 运药物的研究方面相对不如被动扩散药物研究的成功。
该模型有较广泛的适用性(可用于原料药、制剂、大、小分子
的跨肠膜研究)。 Caco-2 细胞内有药物代谢酶,可在有代谢状况下测定药物的跨 膜转运。 可用于区分肠腔内不同吸收途径的差别。
Caco－2 细胞单层模型的缺点
Caco－2细胞由于缺乏分泌粘液的杯状细胞,因而缺乏小肠上皮中 的粘液层。
缺少细胞异质性(单一细胞构成) ;
0.1×10 – 6~1.0×10 – 6
< 1 ×10 - 7
研究药物剂型对吸收的影响[4] 确定药物在肠腔吸收的最适pH 值[5] 评价前体药物的口服吸收[6]
Caco－2 细胞单层模型在药物吸收机制研究中的应用
Caco-2 细胞模型用于被动转运的研究[7] Caco-2 细胞模型用于载体介导主动转运的研究[8、9]
SeminarⅠ
Caco-2细胞模型的研究与应用
主要内容
Caco-2细胞的介绍 Caco-2细胞模型的建立与评价
Caco-2细胞模型的应用 Caco-2细胞模型的发展
Caco－2 细胞单层模型简介
Ｃaco-2细胞： 人结肠癌细胞（the human colon carcinoma cell line)
Tab 1 Relationship between apparent permeability coefficients( Papp) and Bioavailability
想研究药物口服吸收？Caco-2细胞模型来帮你
想研究药物口服吸收？Caco-2细胞模型来帮你作者：叶军（转载请注：解螺旋·医生科研助手）Caco-2细胞转运模型是首个被国外制药企业以及实验室应用的模拟肠道吸收的药物筛选模型，已广泛应用于药物在小肠吸收的评价和转运机制研究中。
Caco-2细胞的结构和功能类似于人小肠上皮细胞，含有与小肠刷状边缘上皮相关的酶系。
与正常的成熟小肠上皮细胞在体外培育过程中出现的逆向分化不同，Caco-2细胞在多孔可渗透的聚碳酸酯膜上培养3周后可以自发分化为肠上皮细胞，形成致密的细胞单层，进而可用作肠道转运模型（图1）。
Caco-2细胞模型培养和验证方法简单，与体内动物实验相比更为方便、经济。
1. Caco-2细胞培养1) 采用MEM完全培养液（含10%胎牛血清、1%非必须氨基酸、1%丙酮酸钠、1%谷氨酰胺和1%青-链霉素）在37℃和5% CO2条件下培养Caco-2细胞；2)每隔一天更换一次培养液。
当细胞汇合程度达80%时，进行细胞传代。
将细胞培养液吸出，用不含Ca2+和Mg2+离子的HBSS小心清洗2次，加入0.25%胰蛋白酶-0.02% EDTA 混合消化液进行消化；3)取细胞适量接种到75 cm2培养瓶继续培养或进行铺板操作。
2. Caco-2细胞模型的构建及验证1)收集对数期的Caco-2细胞，用MEM完全培养液将细胞浓度调整为2.0×105 cells/mL；2)在Transwell板（聚碳酸酯膜，0.4 µm，1.12 cm2）（图2）的基底侧（Basolateral side）加入1.5 mLMEM完全培养液，在顶侧（Apical side）加入细胞悬液0.5 mL；3)放入细胞培养箱内培养，每两天换一次培养液，培养一周后每日换液；4)继续培养至21天；5)采用Millicell ERS电阻仪（Millipore公司）测定跨上皮细胞电阻（大于500 Ω·cm2），确定细胞单层的致密性和完整性。
Caco-2 细胞模型的研究与应用(课堂PPT)
微绒毛 紧密连接
细胞核
3
Caco－2 细胞单层模型简介
Caco-2细胞生化性质特征： 主动转运系统:糖类、氨基酸、二肽、胆酸及维生素B12内源性 因子的主动转运载体。 酶: 小肠细胞刷状缘的酶； Ⅰ相代谢酶:CYP1A1 Ⅱ相代谢酶:谷胱甘肽S-转移酶,β-葡萄糖醛酸糖苷酶及 磺基转移酶。
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Caco-2 细胞模型在药物代谢方面的应用
I相代谢酶:细胞色素P450等。
Ⅱ相代谢酶:磺基转移酶、谷胱甘肽S-转移酶、β-葡糖
醛酸糖苷酶。
存在P-gp 、MRP 外排系统及细胞色素P450 同工酶(与
人
类小肠口服生物利用度方面的关系[12]
SeminarⅠ
Caco-2细胞模型的研究与应用
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主要内容
Caco-2细胞的介绍 Caco-2细胞模型的建立与评价 Caco-2细胞模型的应用 Caco-2细胞模型的发展
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Caco－2 细胞单层模型简介
➢Ｃaco-2细胞： 人结肠癌细胞（the human colon carcinoma cell line)
活性与人体小肠上皮细胞的差别及P-gp 在Caco-2 细胞中表达
的波动性对结果有不同程度的影响。
❖Caco－2 细胞形成的细胞间紧密联结比在小肠上皮细胞中更具
特征性,其TEER 值比正常小肠上皮细胞高，限制了水溶性小分
子药物穿细胞间转运的应用研究。
❖Caco－2 细胞的吸收转运体表达较小肠上皮的低,因而在主动转
。
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Caco－2 细胞单层模型的优点
❖细胞培养条件相对容易控制, 能够简便、快速的获得大量新 的、有价值的信息, 这些信息易于转化为药物转运、代谢的 基本原理。
CACO-2细胞模型及其在食品营养物质吸收研究中的新进展
内容摘要：【摘要】概述了caco-2细胞系的特点、模型的建立与验证，及其在营养物质吸收及机制研究中的新进展，并评价了其用于营养物质吸收转运中的优点与局限性。
【摘要】概述了caco-2细胞系的特点、模型的建立与验证，及其在营养物质吸收及机制研究中的新进展，并评价了其用于营养物质吸收转运中的优点与局限性。
【关键词】 caco-2细胞营养物质吸收对于营养物质在人体内的吸收转运及其生物利用度，不同的动物之间、动物与人之间都存在或大或小的质的差异。
这种种属间的差异使得动物实验数据不能完全地外推至人体，并且直接利用人体组织进行研究是非常有限的。
人类细胞培养系统作为肠屏障的体外模型的应用是模拟营养物质透过小肠黏膜的机制与影响因素的一个有效的方法。
它可采用人体或与人体最接近的生物材料，从而消除了动物模型和人体的巨大差异；有利于探讨营养物质动力学-结构的定量构效关系的特点；有高通量、节省时间、节省资金、有利于对组合代谢产物进行分析的特点。
近十几年来，国外已普遍采用组织细胞模型作为营养物质吸收研究的工具，包括有caco-2细胞(the human colon adenocarcinoma cell lines)单层模型、mdck细胞模型、mdr1-mdck 细胞模型及ecv304细胞模型。
其中尤其是caco-2细胞模型以其与体内营养物质，特别是那些被动吸收的营养物质研究的良好相关性，被普遍用于营养物质开发的早期快速筛选过程中［1，2］。
1 caco-2细胞模型概述1.1 caco-2细胞系及其特征ap面含有典型的小肠微绒毛水解酶和各种营养物质的转运载体，可发挥主动转运物质的作用，如糖类、氨基酸、二肽、胆酸及维生素b内源性因子的主动转运载体在caco-2细胞都有表达；存在于小肠细胞刷状缘的酶，如氨肽酶、碱性磷酸酶、蔗糖酶及γ-谷氨酰转肽酶也同样存在于caco-2细胞；i相代谢酶cyp1a1及ⅱ相代谢酶谷胱甘肽s-转移酶，β-葡糖醛酸糖苷酶及磺基转移酶在该细胞系统的表达也都有报道［4］。
Caco-2细胞单层模型的建立及其评估
Caco-2细胞单层模型的建立及其评估孙旭;罗余萍【摘要】Objective: Building a complete Caco-2 cell monolayermodel.Methods: Estimated the success of Caco -2 cell monolayer model by measured the TEER value and activity of alkaline phosphatase.Results: Day 7 after Caco-2 cell planted on transwell plate, the TEER value was209.75Ω·cm2. It increased almost linearly after day 10, and attained a stable value of 627Ω·cm2 in day 22. The activity of alkaline phosphatase was very low in day 3, but it becames much higher in day 15. AP/BL in day 22 was 2 times of day 15.Conclusion: The Caco-2 cell monolayer model was dense and complete,and can be used to transport experiment.%目的:建立完整的Caco-2细胞单层模型,以利于药物转运的研究.方法:通过测量细胞生长过程中跨膜电阻(TEER)值和碱性磷酸酶活性,评估Caco-2细胞单层模型是否建立成功.结果:细胞接种到Transwell板后的第7天,TEER值就已达到209.75Ω·cm2,第10天后,几乎成线性上升,直到第22天到达一个稳定值627Ω·cm2;细胞生长的第3天,磷酸酶活性非常低,第15天时磷酸酶活性比较高.到了第22天时,磷酸酶活性进一步增加,AP/BL为第15天时的2倍.结论:建立的Caco-2细胞单层模型致密且完整,检测细胞生长过程中TEER值和碱性磷酸酶活性,可用于评估Caco-2细胞单层模型建立成功.【期刊名称】《药品评价》【年(卷),期】2015(012)014【总页数】4页(P33-35,39)【关键词】Caco-2细胞单层模型;跨膜电阻(TEER)值;碱性磷酸酶【作者】孙旭;罗余萍【作者单位】中国食品药品检定研究院国家药物安全评价监测中心、药物非临床安全评价研究北京市重点实验室,北京 100176;南昌大学医学院临床药理研究所,江西南昌 330006;南昌大学医学院临床药理研究所,江西南昌 330006【正文语种】中文【中图分类】R965Caco-2细胞来源于人结肠癌细胞，是一种研究口服药物吸收特性的细胞模型，结构与生化特点类似于人类小肠上皮细胞[1]。
caco-2细胞膜模型实验概述
Caco-2细胞单层膜模型实验概述口服给药是最重要的给药方式之一，药物在肠道内的吸收速度及程度是影响药物生物利用度的重要因素。
药物的肠道吸收研究可以提供吸收机制、吸收部位及影响吸收的因素等重要信息，为药物的研发提供参考。
一、口服药常用的研究方法目前研究药物在肠道吸收的方法主要分为体内法（in vivo ）、在体法（in situ ）、体外法（in vitro ）。
3种研究方法适用不同的研究对象，应根据不同的研究需要进行选择。
1. 体内法 体内法是以整体动物机体为研究对象，进行药动学研究。
口服给药后，在不同时间点采集生物样本如血液、尿液，再通过一定方法测定其药物浓度，计算达峰时间（Tmax ）、达峰浓度（Cmax ）、药时曲线下面积（AUC ）等药动学参数，进而评价药物吸收的程度和速度。
此法采用整体动物进行实验，能真实地反映药物口服后的体内吸收情况，但是它综合了物化、生理、剂型等众多因素的结果，不能特异性地反映肠道对药物的吸收作用。
又由于实验周期长、操作相对繁琐、影响因素较多、动物个体差异较大等原因，故体内法很少应用于药物吸收机制的研究，一般用于研究药物体内药动学特征。
2. 在体法常用的在体法包括在体肠灌流法、肠襻法、肠道血管插管法等。
在体法是建立在整体动物水平上的实验，与体内法不同的是其将干扰因素大大减少，同时保证了肠道神经与内分泌调节的完整性，也保证了血液与淋巴液供应，使得待考察组织的生物活性大大提升，能够较为准确地反映药物在肠道的真实吸收情况，常用于研究药物的渗透和吸收动力学。
在体法由于是建立在整体水平之上，因此个体差异较大，对实验动物的数量有一定要求，以保证最小的数据变异。
3. 体外法常用的体外法主要有外翻肠囊法、组织流动室法、刷状缘膜囊泡法、细胞培养模型法等。
这些实验方法是基于分离部分肠黏膜或肠段，或是采用人肠细胞模拟肠环境评价药物吸收情况。
总的来说体外法优点在于操作简单、试验周期短，可以用于药物早期高通量筛选。
Caco-2 细胞模型的研究与应用解析
CYPcDNAs, 提高CYP3A4 和CYP2A6 的表达。通过
培养CYP3A4 表达的Caco－2 细胞, 开拓Caco－2 模型在研究药物首过代谢方面的应用。
参考文献
[1] Gan LS ,Thankker DR. Applications of the Caco-2 model in the design and development of biochemical and physical barriers posed by the intestinal epithelium. A dv Drug Delivery Rev ,1997 ;23 (1～3) :77～98
由于形态学及生化性质都与小肠上皮很相似,Caco-2 细
胞模型已广泛的用于体外药物分子肠吸收的研究。
Caco－2 细胞单层模型建立
Ｃaco-2细胞模型的建立
Caco-2细胞模型的平面图
Caco-2细胞模型的切面图
Caco－2 细胞单层模型的评价
①细胞形态学(小肠微绒毛结构及细胞间紧密连接) ; ②小肠刷状缘细胞标志酶———碱性磷酸酶的活性; ③Caco－2 细胞单层的跨膜电阻( transepithelial elect rical resistance ,TEER) ;
Caco－2 细胞单层模型的新发展
优化细胞培养条件：缩短细胞培养的时间。
细胞共培养：如与杯状细胞HT29 共同培养, 为Caco-2 细胞
单层膜提供其缺乏的粘层膜。 生化诱导：用经典的细胞生物学方法诱导Caco－2 细胞上缺乏 或低表达的药物代谢相关酶和转运体的表达。 重组技术：Charles[13]等用重组技术在Caco－2 细胞中引入
Tab 1 Relationship between apparent permeability coefficients( Papp) and Bioavailability