太湖水体中藻蓝蛋白的紫外可见 吸收光谱特征分析

太湖藻蓝蛋白的主吸收峰出现在260nm附近，紫 外波段至蓝波段的吸光度值呈现衰减（图3），与 标准品（图1）和Bennett、abelson研究中的纯化 光谱不同。究其原因是受待测溶液中其他含苯丙 氨酸、色氨酸、酪氨酸的可溶性蛋白影响。蓝藻 细胞由众多可溶性蛋白构成，藻蓝蛋白、别藻蓝 蛋白等藻胆蛋白约占蓝藻可溶性蛋白的40％~60％ 。研究中使用的反复冻融法是水环境监测中常用 的藻蓝蛋白提取方法，能有效地破碎藻体细胞， 使藻胆体内的藻蓝蛋白溶出。但其分离、纯化能 力有限，不足以将藻蓝蛋白与其他可溶性蛋白分 离完全。
研究表明，在以反复冻融、超声波破碎、氯化钙自溶 等细胞破碎方法提取出极大螺旋藻、蓝隐藻、钝顶节旋 藻中的藻蓝蛋白时，位于类囊体膜上的叶绿素复合蛋白 也会随之脱落共存于待测液中，并对其300~450和 500~700nm谱带的吸收产生不同程度的干扰。图3（d） 中，双峰型光谱在670nm附近具有吸收峰，同时在 300~450nm出现吸收肩，谱型与上述研究类似，表明具 备双峰型光谱形态的藻蓝蛋白待测溶液中存在叶绿素复 合蛋白组分。
第二类为单峰型，620nm附近出现藻蓝蛋白的特征 吸收峰，光谱形态与标准品、铜绿微囊藻、鱼腥藻 接近。但是由于藻种差异和提取纯度的影响，吸收 峰的位置和峰值比与标准品、单一藻种不同。单峰 型光谱的主吸收峰出现在260nm附近，次吸收峰位 于330nm左右，260，330，620nm的平均峰值比约 为11:4:1。单峰型光谱300~450nm的吸收谱型与铜绿 微囊藻接近：300~350nm 出现吸收峰，300~450nm 的吸光度值递减。
藻蓝蛋白的分光光度法定量主要依据藻蓝蛋白在500~700nm 的吸收光谱特性。Bennett公式中藻蓝蛋白的特征波长为 615nm，别藻蓝蛋白为652nm；abelson公式中分别为620和 650nm。图3（a）和（b）中，无峰Ⅰ和无峰Ⅱ光谱在 500~700nm的吸收平缓，615与620nm和652与650nm的吸收 无可分性。显然，在此情况下使用上述公式对无峰型样品 进行定量具有局限性。图3（d）中，双峰型光谱620nm附近 的藻蓝蛋白吸收特征明显，但由于待测溶液中叶绿素复合 蛋白的影响，670nm附近还具有吸收峰，且该吸收峰与藻蓝 蛋白、别藻蓝蛋白的吸收峰重叠。因此，今后还需要开展 更多的对比实验工作来分析叶绿素复合蛋白对太湖藻蓝蛋 白浓度测定的影响，以进一步提高水体藻蓝蛋白浓度测定 的准确性。
根据水样的 CDOM 吸收数据(图4)，太湖藻蓝蛋白紫外波段至 蓝波段的吸收还可能受到CDOM 的影响.CDOM 是由富里酸、 腐殖酸、芳烃聚合物等一系列物质组成的水溶性物质，由藻类、 细菌、水生植物等有机体的降解产生，在紫外和蓝光区具有强吸 收。本研究采用滤膜过滤方式分离藻体，而CDOM 存在于过滤 除去的水样中。但是，反复冻融法属于机械破碎，在藻蓝蛋白提 取的同时会形成大量有机碎屑。这些有机碎屑在多次的反复冻融 提取中会慢慢腐烂分解，释放出CDOM 。图3(a)中,太湖无峰Ⅰ型 光谱在300~450nm未观测到蛋白中二硫键的吸收峰，250~800nm 的 吸 收 谱 型 与 标 准 品 不 同 而 接 近 于CDOM ,进一步说明反 复冻融法提取的藻蓝蛋白溶液中存在CDOM组分；并且对于无峰 Ⅰ而言，CDOM 的吸收可能掩盖了二硫键300~450nm的吸收信 息。
图2中，铜绿微囊藻、鱼腥藻藻蓝蛋白吸收光谱在与 标准品对应的三个谱带上有类似的吸收峰。由于藻种 差异和提取纯度的影响，单一藻种的吸收峰出现位置 和峰值比与标准品存在差异。铜绿微囊藻藻蓝蛋白的 三个吸收峰位于255，336，619nm，峰值比约为7:3:4 ；鱼腥藻则出现在259，340，614nm，峰值比约为5 ：1:3。此外，铜绿微囊藻和鱼腥藻300~450nm 的吸 收谱型不同。铜绿微囊藻300~350nm出现吸收峰， 350~450nm的吸光度值递减；鱼腥藻340nm峰两端的 吸光度值递减，但峰型不对称。
光谱特征
01
藻蓝蛋白标准品的吸收光谱特征
02Βιβλιοθήκη 单一藻种的藻蓝蛋白吸收光谱特征
03
太湖水体的藻蓝蛋白吸收光谱特征
由图１可知，藻蓝蛋白标准品250~800nm紫外-可 见光范围共有三个吸收谱带：250~300,300~450和 500~700。主吸收峰位于620nm，由藻蓝胆素中的 四吡咯环引起，为藻蓝蛋白的特有吸收特征。 250~300nm的吸收峰出现在278nm处，源于蛋白中 芳香族氨基酸苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸的吸收。 300~450nm的吸收峰位于345nm，主要由蛋白中二 硫键的吸收引起。标准品的278，345和620nm的峰 值比约为2:1:5。
由于藻蓝蛋白为胞内蛋白，提纯工艺复杂，当前 环境监测研究中藻蓝蛋白的提取多以反复冻融、超声 破碎、化学溶胀等细胞破碎方法为主，藻蓝蛋白浓度 的计算主要沿用Bennett、abelson等学者基于单一 藻种纯化光谱建立的经验公式。然而，反复冻融等提 取结果的纯化程度不高，获取的藻蓝蛋白吸收光谱常 常受到其他物质组分的影响而与经过硫酸铵盐析、柱 色谱层析分离的纯化光谱存在差异。吸收光谱是藻蓝 蛋白结构分析、浓度定量计算的基础，对内陆湖泊水 色遥感反演研究也具有重要意义。
由图2和图3可知，太湖水体藻蓝蛋白吸收光谱的次吸收 峰位于330nm左右，单一藻种则出现在620nm附近。产生 该差异的原因可能有以下两种：一是太湖水体中藻体多以 群体态形式聚集并形成包裹体，包裹体表面附有由果胶酸 、粘多糖等构成的群体胶鞘。群体胶鞘类似于藻体细胞外 壳，其存在会增加藻蓝蛋白提取的难度，使得太湖藻蓝蛋 白待测溶液的提取纯度低于单一藻种。第二种可能是受到 其他非蓝藻门藻种的影响。太湖是多藻种共存的湖泊水体 ，水体中除了蓝藻外，还会存在诸如斜生栅藻、梅尼小环 藻等的其他非蓝藻门藻种。这些非蓝藻门藻种虽不含藻蓝 蛋白，但其细胞体本身也由众多可溶性蛋白质构成；在反 复冻融提取过程中，它们也会发生降解并产生CDOM，致 使太湖藻蓝蛋白紫外波段至蓝波段的吸收增强。
根据待测溶液500~700的吸收峰个数，可将太湖水 体中藻蓝蛋白的吸收光谱划分为无峰型、单峰型 、双峰型三类（图３）。各吸收谱类型包括的样 点数量和日期见表１。
第一类是无峰型，即500~700nm间变化平缓， 620nm附近未检测到藻蓝蛋白的吸收特征。推测 其原因是该光谱形态的水样多采集于春、秋季（ 表1），水样中浮游藻类生物量小、蓝藻所占比 例低，致使待测溶液的藻蓝蛋白含量微少难以检 出。根据300~450nm的吸收差异，无峰型又可划 分为无峰Ⅰ和无峰Ⅱ两个亚类。无峰Ⅰ仅260nm 附近出现吸收峰，250~800nm的谱型更接近于水 样的CDOM吸收谱（图4）。无峰Ⅱ在260和 330nm处均具吸收峰，说明待测溶液中其他可溶 性蛋白的含量较高。
太湖水体中藻蓝蛋白的紫外-可见 吸收光谱特征分析
01
简述 实验部分 光谱特征
02
03
04
结论与讨论
简述
紫外- 可见分光光度法（UV-vis）是目前世界上 历史最悠、使用最多、覆盖面最广的分析方法之一。它 已在生命科学、材料科学、环境科学、农业科学、计量 科学、食品科学、医疗卫生、化学化工等各个领域的科 研、生产、教学等工作中得到了非常广泛的应用。它可 作定性定量分析、纯度分析、结构分析；特别在定量分 析和纯度检查方面，在许多领域更是必备的分析方法。
对于标准品的配置和测量，sigma公司生产的 藻蓝蛋白标准品0.5mg，加人25mL磷酸盐缓冲 液使其成为20mg· L-1的标准溶液贮备液，装入 棕色瓶中，于4℃保存。实验分析时将标准液取 出并配制为10mg· L-1的标准应用液。以磷酸盐 缓冲液作为空白对照测量吸光度。参照张运林 方法，通过 GF/F玻璃纤维滤膜过滤水样、测量 滤液吸光度，获取有色可溶性有机物（CDOM ）的吸收数据，对藻蓝蛋白吸收光谱特征进行 辅助分析。
第三类为双峰型，即在620nm 藻蓝蛋白特征吸收 峰的右侧约670nm处出现了另一个吸收峰，同时 在300~450nm出现吸收肩。按照吸光度的高低顺 序，双峰型光谱的主吸收峰出现在260nm附近， 次吸收峰位于330nm左右，三个吸收峰260，330 ，620nm的平均峰值比约为10:5:1。从图1来看， 双峰型光谱670nm附近的吸收谱带与藻蓝蛋白、 别藻蓝蛋白的吸收具有重叠。
方法 太湖水样和铜绿微囊藻、鱼腥藻的藻蓝蛋白提 取使用反复冻融法。首先用GF/C玻璃纤维滤膜 过滤样品，将附着藻体的滤膜放入冻存管中， 同时加入0.05mol· L-1磷酸盐缓冲液于低温冰箱 冷冻，然后室温避光解冻，如此反复冻融７次 。解冻的样品以12000r· min-1速度离心10min ，取离心后的上清液作为待测液。以磷酸盐缓 冲液作为空白对照，使用岛津 UV 2450/UV 2550分光光度计测量吸光度。
实验部分
样品采集
1
实验方法
2
样品采集 于2011年5月19日、7月30日、8月20日、9月3日 、11月12日在太湖布设采样点位开展野外调查，共采 集75个水样用于实验分析。 铜绿微囊藻、鱼腥藻藻种来源于中国科学院水生生 物研究所，在江苏省环境演变与生态建设重点实验室 的无菌实验室进行培养。取对数生长期的铜绿微囊藻 、鱼腥藻样品进行实验。 藻蓝蛋白标准品（p6161）购自美国sigma公司， 提纯于螺旋藻。
结
论
根据500~700nm的吸收峰个数，太湖水体中 藻蓝蛋白的吸收光谱形态可划分为无峰型、 单峰型、双峰型三类。 （1）无峰型光谱620nm附近无藻蓝蛋白的特 征吸收峰出现。根据300~450nm的吸收差异 ，又可分为无峰Ⅰ和无峰Ⅱ两个亚类。 （2）单峰型光谱具有明显的藻蓝蛋白吸收特 征。受藻种差异和提取纯度的影响，各吸收 峰的出现位置和峰值比与标准品、单一藻种 不同。 （3）双峰型光谱兼具藻蓝蛋白和叶绿素复合 蛋白的吸收特征。
藻蓝蛋白（phycocyanin，PC）是藻类进行光 合作用的重要辅光色素蛋白之一，由藻蓝胆素（ PCB）和脱辅基蛋白中保守性半胱氨酸残基的巯 基构成，主要存在于蓝藻、隐藻，以及部分红藻的 藻胆体中。在环境监测中，特别是蓝藻水华频发的 水域，藻蓝蛋白浓度能较好地表征蓝藻生物量，是 水体富营养化及蓝藻水华监测重点关注的指标。紫 外-可见分光光度法是藻蓝蛋白浓度定量分析的常 用方法，其主要依据是藻蓝蛋白500~700nm的吸 收光谱特性。