Prep-LCMS培训教材

排气（Purge）：排除管路中的 气泡和更换旧流动相的过程
自动进样器工作原理
色谱柱 输液泵
输液泵
色谱柱
进样针
样品瓶 计量泵
装填状态
进样状态
色谱柱
类型
分析型 半制备型 制备型
规格
4.6 mmID×250 mmL 20 mmID×250 mmL 50 mmID×250 mmL 5 μm
粒径
流速
1 mL/min 15-20 mL/min 80-90 mL/min
一. 制备色谱基本概念 二. 制备型高效液相色谱基本概念
三. 质谱引导型制备高效液相色谱 四. 制备纯化方法建立
五. 制备液质系统使用注意事项
HPLC分类
微量液相(0.3 - 1 mmID) 半微量液相(1 - 3 mmID)
常规液相(4 - 8 mmID)
半制备液相(10 - 20 mmID) 制备液相(20 - 50 mmID)
水的等级
HPLC用水可以通过以下几个方法得到：
专门的纯水机或超纯水机:理想的HPLC用水应为18.2 MΩ 的超纯水，并通过0.22 μm的滤膜，除去热源、有机物、 无机离子及空气等。 去离子水重蒸； 二次或三次重蒸水；

不管采用何种途径，配制流动相应用新鲜水
有机溶剂的等级
有机溶剂的等级
送液压力
柱塞往复泵结构示意图
单向阀工作原理
单向阀结构 单向阀工作原理
吸液冲程
宝石球
出口单向阀
排液冲程
抛光面
泵头 球座
进口单向阀
洗脱系统组成
等度洗脱系统
梯度洗脱系统
等度
B%
B%
梯度
时间
时间
使用梯度洗脱的原因
当采用等度洗脱时：
MeOH / H2O = 6 / 4 分析时间长
分离度差
MeOH / H2O = 8 / 2
工业制备(> 50 mmID)
0.001 0.1
0.4
2
20
150 (mL/min)
制备液相的规模和目的
规 模
半微量级(Column i.d- 2.0 mm) 常规级(Column i.d- 4-6 mm) 半制备级 (Column i.d- 10-20 mm) 实验室级(Column i.d- 30-50 mm)
流动相选择
先根据固定相的类型匹配选择，再筛选溶剂种类
柱效
非线性色谱条件下，当色谱柱严重过载时，色谱柱的柱效 将会类似指数下降，使其分离能力急剧降低甚至基本没有什么 分离能力。
样品的影响
固定相的影响
流动相的影响
塔板数
分析范围
制备范围
色谱柱的影响
上样量（组分/固定相）
容量因子
容量因子的增加可以改善分离的效果，当达到一定数 值后，容量因子对分离度的影响不是很大。
进样器
手动进样器 自动进样器 要求： 无残留 扩散小 进样体积可变 可承受高压
手动进样器的原理图
装填状态
输液泵
进样状态
输液泵
6
1
2 6
1
2 5 4
色谱柱 色谱柱
5 4
3
3
1
6
1
6
4
5
4
5
自动进样器
由计算机自动控制定量阀，按预先编制注射样品的操 作程序工作
清洗（Rinse）：进样针移动到 清洗口，针的外壁被清洗液清洗 的过程
5,10,15 μm 10,15 μm
保护柱：有效阻止溶解 性差和易产生死吸附等 物质对色谱柱的伤害。
制备柱架和梯度混合器
制备柱架
可安装2根内径20～50 mm制备柱，1 根内径 4.6 mm分析柱 可安装各种手动切换阀4个 可安装制备用混合器、分析用混合器
梯度混合器
混合体积 14mL 有效流速范围 10～150 mL/min
样品性质 产品纯度 制备量 时间 成本
组成，理化性质，相态，浓度，价值 <100%，达标 样品性质 方法，设备 效率，规模 时间 硬件，耗材
成本
产品纯度
制备分离的五要素
制备量
制备分离策略
色谱法研究的基本点是要使混合物得到分离。
非线性色谱中，分离因子，柱效和容量因子 没有上述的等式关系 作为指导色谱条件优化的重要关系式，改善 分离应该努力的方向
Anti-Langmuirian型
Cm
非线性吸附（分配）等温线
非线性色谱
特点1
mAu
色谱流出峰形不对称
mAu
t Langmuirian型 Anti-Langmuirian型
t
色谱峰“拖尾”或“伸舌”，使得色谱峰谱带变宽，色谱柱效降低。
非线性色谱
特点2.色谱峰的保留时间随样品量的大小而发生变化
mAu mAu
生物化学样品 结构分析和生化制备
目 的
结构分析，前处理，纯化 纯化和前处理
工业制备级(Column i.d- 100 mm)
纯化
（半）制备液相系统
馏分收集器
色谱柱 进样器 检测器
输液泵 流动相
馏分
废液
（半）制备液相系统
规模放大系统
进样器 分析色谱柱
分析混合器
馏分收集器
输液泵
制备混合器 流路切换阀
延迟时间 调整管路
HPLC常用检测器
检测器 UV-VIS RF RID ELSD PDA MS 化合物需具备的 紫外-可见光 荧光吸收化 所有有机 特征性 吸收化合物 合物 化合物 主要应用范围 定量 定量 ~0.1 ppb 高 定量 所有有机化 紫外-可见光 所有有机化 合物 吸收化合物 合物 定量 定性和定量 定性和定量 ~100 ppb 中 ~0.1 ppb (SIM) 高
流动相的选择
采用 “HPLC” 级溶剂 避免使用会引起柱效损失或保留特性变化的溶 剂 对试样有适宜的溶解度 溶剂粘度要小 与检测器相匹配
水的等级
水的等级
纯化水 蒸馏水 去离子水
吸 光 率 去离子水 纯化水 波长 (nm) 因为不纯物的存在，去离子的吸光率较高 纯化水中去除了无机和有机的污染物
真空室
脱气管
到泵
真空室内的脱气管由特 殊的透析材料制成，当溶 剂流经脱气管时，溶解在 溶剂中的气体穿过管壁被 脱出。
储液瓶
输液泵
LC-20AP
项目 外观 内容 同LC-20A系列一致
尺寸
260(W)×210(H)×500(D)mm
流速范围
0.01-150 mL/min 42 MPa（0.01～100 ml/min） 30 MPa（100～150 ml/min)
0.2ml/min
质谱仪
0.02ml/min
20ml/min
延迟时间 调整管路 分流
19.98ml/min
紫外 检测器
T2
来自色谱柱
对于质谱触发来说, 样品到达组分收集器的时间应该 在样品到达质谱时间之后。检测MS和SPD-20A的保留 时间。 (T2＞T1) 使用延迟时间调整管路套件(Tubing kit for the Delay time)，以确保T2大于T1。 (比如, 1.6mm(O.D.)x1.0mm(I.D.), 10MT)
( column : ODS )
使用梯度洗脱的原因
当采用梯度洗脱时：
95%
甲 醇 浓 度 30%
在最短时间内获得最佳的分离
梯度洗脱要点
梯度洗脱：
优点：可提高分离度、缩短分离时间、降低最小检测量和提高 分离精度
注意事项：
溶剂的纯度要高，否则梯度洗脱的重现性差 梯度混合的溶剂互溶性要好 梯度洗脱应使用对流动相组成变化不敏感的选择性检测器（如紫 外吸收检测器或荧光检测器），而不能使用对流动相组成变化敏 感的通用型检测器（如示差折光检测器） 查看空白实验的数据 遵守分析周期。（最初的分析数据不采用）
岛津制备液质操作培训
岛津企业管理（中国）有限公司
分析仪器事业部 分析中心
一. 制备色谱基本概念 二. 制备型高效液相色谱基本概念
三. 质谱引导型制备高效液相色谱 四. 制备纯化方法建立
五. 制备液质系统注意事项
色谱起源
石油醚
色谱
色素混合物
分离组分
碳酸钙颗粒
色谱发展史
20世纪初，俄国植物学家M.S. Tswett提出经典液相色谱法； 20-40年代，柱分配色谱和纸色谱； 50年代，气相色谱，薄层色谱，Van Deemter 速率理论 60年代，超临界流体色谱，逆流色谱，凝胶渗透色谱，亲和 色谱，模拟移动床色谱，高效液相色谱； 70年代，高效毛细管气相色谱法； 80年代，电色谱；
容量因子的增加以时 间和大量的溶剂消耗为 代价，除非是价值很高 的物质的制备，否则不 采用增加容量因子的办 法。
容量因子控制在1-5
分离度 R
容量因子 k
条件优化
选择最佳的高效液相色谱分离条件 在分析型设备条件下进行分离测试 放大到制备型规模进行制备分离 采集馏分
分析型设备 纯度检测 合并组分 收集目标物
流路特点
脱气机
补偿泵 补偿液 输液泵 色谱柱 进样器 分流阀 紫外检测器 PDA检测器 质谱检测器 馏分收集器
延迟管路
储液瓶
馏分
废液
储液瓶
由机械性能和化学稳定性好的不锈钢、玻璃或聚四
氟乙烯材料制成
使用过程中储液瓶应适当密闭
所有溶剂应先过滤，再装入储液瓶
脱气机-在线真空脱气
脱气机主要由脱气管、 真空室和真空泵组成。
HPLC级 优级纯 分析纯
微量分析、梯度洗脱
都经过蒸馏和0.45 μm的过滤(除纤维毛,未溶解的机械颗粒） 优级纯的纯度比分析纯大,但里面含有防腐剂和抗氧化剂 HPLC级经过0.2 μm的过滤,且除去有紫外吸收的杂质