液相色谱基础
液相色谱的原理以及操作要点
液相色谱的原理以及操作要点液相色谱（Liquid Chromatography，简称LC）是一种常用的分离和分析技术，它基于不同物质在流动相中的分配行为来实现分离。
本文将介绍液相色谱的原理，同时探讨液相色谱的操作要点。
一、液相色谱的原理液相色谱的原理主要基于两个关键概念：分配系数和吸附性质。
1. 分配系数分配系数（Distribution coefficient）是指样品在固定相和流动相之间的分配比例。
它是液相色谱中物质分离的基础。
分配系数的大小决定了物质在固定相上停留的时间，从而实现了不同成分的分离。
2. 吸附性质液相色谱还涉及到物质在固定相上的吸附行为。
当样品溶液通过固定相时，固定相表面上的吸附剂与样品物质发生相互作用，使得物质被吸附，从而发生分离。
二、液相色谱的操作要点为了有效地进行液相色谱实验，以下是一些操作要点需要注意：1. 样品制备样品制备是液相色谱分析的首要步骤。
样品应准备恰当，并考虑到溶解度、稳定性以及待分析物之间的相互干扰。
此外，样品需要经过适当的前处理（如过滤、稀释等）以达到分析要求。
2. 流动相选择流动相的选择对液相色谱分离效果起到至关重要的作用。
合适的流动相应能够与待分析物有良好的相容性，并且具有适当的溶解性和流动性。
常用的流动相包括水、有机溶剂和缓冲溶液。
3. 固定相选择固定相是液相色谱中的另一个关键部分。
不同的固定相具有不同的化学性质，因此会影响到分离的选择性和效果。
根据待分析物的特性，选择合适的固定相对于分离效果至关重要。
4. 色谱柱选择色谱柱是液相色谱系统中用于分离的核心组成部分。
不同的色谱柱具有不同的长度、直径和固定相材料，这些参数会影响到分离性能和分析时间。
根据待分析物的特性和分离要求，选择合适的色谱柱尤为重要。
5. 色谱条件优化为了获得最佳的分离效果，需要进行色谱条件的优化。
例如，可以调整流速、梯度程序和柱温等参数，以达到更好的分离和峰形。
6. 数据处理和解释液相色谱实验完成后，需要对得到的色谱图进行数据处理和解释。
液相色谱基础知识
原理： ☼ 原理：根据物质在某些介质中电离后所产生的电 导变化来测定电离物质含量。 导变化来测定电离物质含量。广泛应用于 离子色谱法。 离子色谱法。
☼ 优点：对流动相流速和压力的改变不敏感，可用 优点：对流动相流速和压力的改变不敏感，
梯度洗脱。 梯度洗脱。 缺点：对温度变化敏感，每升高1℃, ℃,电导率增加 ☼ 缺点：对温度变化敏感，每升高 ℃,电导率增加 2%-2.5%。
液相色谱基础知识
■ 溶剂等级
☼鬼峰的出现
洗脱曲线
☺水/MeOH梯度 ODS ODS柱 1ml/min在 0~10Mins内 MeOH 0~100% 线性变化后 保持15Min
鬼峰
液相色谱基础知识
■ 溶剂等级
在微量分析和梯度洗脱时建议使用HPLC级溶剂和纯化水 级溶剂和纯化水 在微量分析和梯度洗脱时建议使用
0.001~9.999
岛津VP系列液相色谱仪 岛津VP系列液相色谱仪 VP
柱塞和密封圈的关系
水 出口单 向阀 密封圈 吸液移动 柱塞杆 送液移动 入口单 向阀 泵头清洗流路 流动相
岛津VP系列液相色谱仪 岛津VP系列液相色谱仪 VP
手动进样阀7725i原理
岛津VP系列液相色谱仪 岛津VP系列液相色谱仪 VP
☺无在线脱气机应注意：
1 每天脱气 2 如使用氦脱气，对混合好的溶剂脱气时间不能过长。
液相色谱基础知识
梯度形式的选择
洗脱模式：高压梯度
低压梯度 用两台输液泵将两种流动相混合并进入系统 常压下用比例阀将流动相混合，单泵进入系统
☺线性梯度:洗脱时，流动相的浓度变化和时间成线性变化（增或减） ☺指数梯度:洗脱时，流动相的浓度变化和时间成指数关系（增或减） ☺折线梯度:洗脱时，流动相的浓度变化和时间无规则变化
液相色谱基础知识
液相色谱—视差折光检测器
检测器组成：光源——透镜——两 束平行光——样品池和参比池—— 光电二极管——比较两者信号差 值——输出信号 。
液相色谱—凝胶色谱
பைடு நூலகம்
凝胶渗透色谱仪（GPC仪）、体积 排阻色谱(Size Exclusion Chrom.) 。 分离原理：利用多孔物质做固定相， 按照待测组分分子尺寸大小进行分 离。测定相对分子量大小、分子量 分布。
环己烷
正丁醇 乙醇 水 异丙醇
乙酸正丙酯
丙酸甲酯 四氯化碳 N,N-二甲基 甲酰胺 苯
260
260 265 270 280
碘甲烷
二硫化碳 硝基甲烷 硝基乙烷 2-硝基丙烷
350
380 380 380 380
甲醇
甲苯
285
液相色谱—荧光检测器
荧光检测器：样品中物质分子能在 特定波长的光激发后跃迁到高能级 状态，在返回到基态的过程中，会 发出波长较长的光，称做荧光。 荧光强度F=I0Φabc I0——激发光强度 Φ——荧光量子产率
Refractive Index Detector
A valve is opened and pure solvent passes into one half of a cell. The eluate flows through the other half of the cell. The two halves are separated by a glass plate mounted at an angle such that bending of the incident beam occurs if the two solutions differ in refractive index.
液相色谱基础理论知识
一、液相色谱理论发展简况色谱法的分离原理是：溶于流动相(mobile phase)中的各组分经过固定相时，由于与固定相(stationary phase)发生作用（吸附、分配、离子吸引、排阻、亲和）的大小、强弱不同，在固定相中滞留时间不同，从而先后从固定相中流出。
又称为色层法、层析法。
色谱法最早是由俄国植物学家茨维特（T swett）在1906年研究用碳酸钙分离植物色素时发现的，色谱法(Chromatography)因之得名。
后来在此基础上发展出纸色谱法、薄层色谱法、气相色谱法、液相色谱法。
液相色谱法开始阶段是用大直径的玻璃管柱在室温和常压下用液位差输送流动相，称为经典液相色谱法，此方法柱效低、时间长（常有几个小时）。
高效液相色谱法(High performance Liquid Chromatography，HPLC)是在经典液相色谱法的基础上，于60年代后期引入了气相色谱理论而迅速发展起来的。
它与经典液相色谱法的区别是填料颗粒小而均匀，小颗粒具有高柱效，但会引起高阻力，需用高压输送流动相，故又称高压液相色谱法(High Pressure Liquid Chromatography，HPLC)。
又因分析速度快而称为高速液相色谱法(High Speed Liquid Chromatography，HSLP)。
也称现代液相色谱。
二、HPLC的特点和优点HPLC有以下特点：高压—压力可达150~300Kg/cm2。
色谱柱每米降压为75 Kg/cm2以上。
高速—流速为0.1~10.0 ml/min。
高效—可达5000塔板每米。
在一根柱中同时分离成份可达100种。
高灵敏度—紫外检测器灵敏度可达0.01ng。
同时消耗样品少。
HPLC与经典液相色谱相比有以下优点：速度快—通常分析一个样品在15~30 min，有些样品甚至在5 min内即可完成。
分辨率高—可选择固定相和流动相以达到最佳分离效果。
灵敏度高—紫外检测器可达0.01ng，荧光和电化学检测器可达0.1pg。
液相色谱教程-液相色谱基础知识2
YOU
拖尾峰(Tailing Peak):后沿较前沿平缓的不对称峰 前伸峰(Leading Peak):前沿较后沿平缓的不对称峰
鬼峰(Ghost Peak):并非由试样所产生的峰,亦称假峰
色谱图名词术语
基线(Baseline):在正常操作条件下,仅由流动相所产生的响应信号 – 基线飘移(Baseline Drift):基线随时间定向的缓慢变化 – 基线噪声(N)(Baseline Noise):由各种因素所引起的基线波动 – 谱带扩展(Band Broadening):由于纵向扩散,传质阻力等因素的影响,使组分在色谱柱内移动过程中谱带宽 度增加的现象
-25%
液相色谱的应用
目的:得到数据-定性及定量分析
– 灵敏度的要求 – 样品的复杂性 – 样品量的要求 – 精度及准确度的要求 – 容易使用
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液相色谱的应用
制备型液相色谱 目的:得到纯品-分离及纯化 • – 化合物的稳定性 • – 样品的复杂性 • – 制备量的要求 • – 纯度的要求，及纯度的鉴定 • – 方法的安全性
半(高)峰宽(Peak Width at Half Height):通 过峰高的中点作平行于峰底的直线,其与峰两 侧相交两点之间的距离
色谱图名词术语
– 峰面积(Peak Area):峰与峰底之间的面积,又称响应值
标准偏差(σ)(Standard Error):0.607倍峰高对应峰宽的一 半
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色谱图名词术语
死时间(t0)(Dead time):不被固定相滞留 的组分,从进样到出现峰最大值所需的时 间 – 保留时间(tR)(Retention time):组分从 进样到出现峰最大值所需的时间
液相色谱基础
高效液相色谱仪
高效液相色谱仪由 高压输液系统、进样系统、 分离系统、检测系统、记录系统 等五大部分组成。
• 分子筛：属于合成硅铝酸钠盐或钙盐，它具有均匀 孔隙结构和大的表面积，分离基于分子筛的极性。 一般用来分离永久性气体和无机气体。但要注意， 分子筛在常温下对CO2发生不可逆吸附，因而不能 用来分离CO2，分子筛在使用前在400~550℃活化2 小时，但很容易吸水失活，在使用过程中要注意防 止水气进入色谱柱内。
色谱条件的选择
分离条件(色谱柱)的选择 1. 固定相的选择；2. 柱长的选择
（1）气固色谱固定相： a. 种类：活性炭、活性氧化铝、硅胶、分子筛、高分子多孔
微球（GDX系列）等
b. 特点：
（1）性能与制备和活化条件有很大关系； （2）同一种固定相，不同厂家或不同活化条件，分离效果差 异较大； （3）种类有限，能分离的对象不多； （4）使用方便，常用于分离常温下的气体及气态烃类等。
高压输液泵
用于输送流动相，由于色谱柱很细、为了获得高柱效而使用 粒度很小的固定相（<10μm）、流动液的扩散系数远小于气体， 故液体的流动相高速通过时，液体流动时阻力很大，必须要有 很高的柱前压力。 3、高压输液泵 高压输液泵是高效液相色谱仪中关键部件之一， 其功能是 将溶剂贮存器中的流动相以高压形式连续不断地送 入液路系统，使样品在色谱柱中完成分离过程。 压力：150～350×105 Pa，高压、高速是高效液相色谱的特 点之一。 流量稳定（影响重现性及分析精度）、流速可调 应具有压力平稳、脉冲小、耐腐蚀等特性
液相色谱法的基本原理
液相色谱法的基本原理
液相色谱法（Liquid Chromatography，LC）是一种基于溶剂流动作为移动相，将样品溶解在溶剂中，并利用样品与固定相之间的相互作用分离的分析技术。
液相色谱法的基本原理是将被测物样品通过一个流动相（液体溶剂）推动，使其流过填充在色谱柱中的固定相（固定在柱中的吸附剂或离子交换剂）。
在固定相的作用下，样品中的成分会因为与固定相的相互作用不同而以不同的速度迁移。
通过在柱的出口处测量溶液中组分的浓度或检测样品组分的吸收或发射特性，便可分析出溶液中各个组分的浓度和性质。
液相色谱法的固定相多种多样，根据固定相的不同，可以将液相色谱法分为吸附色谱法和分配色谱法两大类。
吸附色谱法是利用吸附剂（如硅胶）吸附样品中的物质，根据物质与吸附剂之间的相互作用力的不同，实现成分分离；分配色谱法则是以液相中的化学平衡分配作用为基础，将样品中的组分分散分离到不同程度的吸着剂上。
液相色谱法常用的柱型包括常规柱、反相柱、离子交换柱、大小排列柱等。
其中，反相柱是最常用的柱型之一。
使用反相柱时，固定相表面通常被涂覆上一层无极性覆膜，使其具有亲水性，常用的覆膜材料有碳氢化合物。
这样可以使非极性物质在移动相中发生亲水化反应，从而实现其在固定相上的迁移。
总之，液相色谱法的基本原理是利用读取流经柱中的样品与固定相之间的相互作用的不同，通过测量在柱出口处的吸收或发
射特性，实现样品中各个组分的分离和定量分析。
通过选择不同的固定相和柱型，液相色谱法可以适用于不同种类的样品分析。
Shimadzu液相色谱基础
3
性能指标
检测限、线性范围、稳定性等，影响检测结果的 准确性。
数据处理系统
作用
01
数据处理系统用于采集、处理、分析色谱数据，提供实验结果
和图谱。
功能
02
包括基线校正、峰识别、定量分析等。
软件应用
03
常用的软件有ChemStation、Empowe
液相色谱操作流程
详细描述
当色谱峰的形状异常，出现拖尾或前延现象时，可能是由于固定相的流失或污染、流动相的配比不当、柱温波动、 样品溶剂选择不当等原因造成的。为了解决这个问题，可以更换固定相、调整流动相的配比、保持柱温恒定、选 择合适的样品溶剂等方法。
峰分离不完全
总结词
峰分离不完全会导致相邻峰的干扰，影响分析结果的准确性。
流动相
作用
流动相用于携带样品通过色谱柱，与固定相相互作用，实现组分 分离。
组成
通常由溶剂和水等组成，根据分离需求选择合适的流动相。
流速控制
流速直接影响分离时间和效果，需精确控制。
检测器
1 2
作用
检测器用于检测色谱柱流出的组分，并将其转化 为电信号。
类型
常见类型有紫外可见吸收检测器、荧光检测器、 电化学检测器等。
数据处理
对采集到的数据进行基线校 正、峰识别、定量计算等处 理。
结果分析
根据处理后的数据，对样品 中的组分进行分析和比较， 得出实验结论。
04
液相色谱条件优化
流动相的选择与优化
总结词
流动相的选择与优化是液相色谱分离 效果的关键因素之一。
详细描述
根据样品的性质和分离要求，选择合 适的流动相种类、溶剂和比例。优化 流动相的pH值、离子强度和粘度，以 提高分离效果和降低背景干扰。
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分分离的技术，称为色谱分离技术或色谱法。
色谱法的特点
（1）分离效率高
复杂混合物，有机同系物、异构体。手性异构体。
（2） 灵敏度高 可以检测出10-6～10-9g的物质。 （3） 分析速度快 一般在几分钟或几十分钟内可以完成一个试样的分析。 （4） 应用范围广 几乎所有的化学物质。
三、高效液相色谱仪
分离度的公式：
R
V2 V1 1 (W2 W1 ) 2
R：分离程度的量度
难分离物质对的分离度大小受色谱过程中两种因素的综合影
响：
保留值之差──色谱过程的热力学因素； 区域宽度 ──色谱过程的动力学因素。
R=0.8：两峰的分离程度可达89%； R=1：分离程度98%，两峰能明显分离； R=1.5：达 99.7% ，两峰已完全分离，相邻两峰完全分离的 标准。
四、高效液相色谱基本概念
色谱图即色谱柱流出物通过检测器时所产生的响应信号对时间的 曲线图，其纵坐标为信号强度，横坐标为保留时间。
← 色谱峰 峰高 峰宽 基线 ↓ 保留时间（分）
色谱图（色谱流出曲线）
试样中的各组分经色谱柱分离后，随流动相依次进入检测 器，检测器将各组分浓度的变化转换为电信号，在记录仪 上记录为检测器响应随时间的变化的微分曲线，称为色谱 流出曲线。
0 . 0 0 0 . 5 0 1 . 0 0 1 . 5 0 2 . 0 0 2 . 5 0 3 . 0 0 3 . 5 0 4 . 0 0 4 . 5 0 5 . 0 0 5 . 5 0 6 . 0 0 6 . 5 0 7 . 0 00 . 0 0 0 . 5 0 1 . 0 0 1 . 5 0 2 . 0 0 2 . 5 0 3 . 0 0 3 . 5 0 4 . 0 0 4 . 5 0 5 . 0 0 5 . 5 0 6 . 0 0 6 . 5 0 7 . 0 0 . 0 0 0 . 5 0 1 . 0 0 1 . 5 0 2 . 0 0 2 . 5 0 3 . 0 0 3 . 5 0 4 . 0 0 4 . 5 0 5 . 0 0 5 . 5 0 6 . 0 0 6 . 5 0 7 . 0 00
(1) 高压输液泵
主要部件之一，压力：150～350×105 Pa。
为了获得高柱效而使用粒度很小的固定相（ <10μm），液 体的流动相高速通过时，将产生很高的压力。 应具有压力平稳、脉冲小、流量稳定可调、耐腐蚀等特性
通过改变流动相组成改变分离因子，同 样强度的不同溶剂.
① THF / H 2O ＝ 28 : 72 ② MeOH / H 2O ＝ 58 : 42 ③ CH 3CN / H 2O ＝ 38 : 62
谱图
改变容量因子 K’ 的例子
① ① ① 5 0 / 5 0 ② ③ 6 0 / 4 0 4 0 / 6 0
② ②
③③
(2) 梯度淋洗装置
外梯度:
利用两台高压输液泵， 将两种不同极性的溶剂按一 定的比例送入梯度混合室， 混合后进入色谱柱。
内梯度: 一台高压泵, 通过比例 调节阀,将两种或多种不同 极性的溶剂按一定的比例抽 入高压泵中混合。
B A C D A B C D Identification
C
B
Separation
Sample
气相色谱/质谱仪
Data System MS Interface
GC
总离子流图的构成
总丰度 = 638,444
(3.892, 638444)
气相色谱-质谱数据是三维的
50 100 150 200 250 300 6 Time [minutes] 7 8 9 10 11 12
NovaPak C18
未封口 C18
(5) 高效液相色谱检测器
紫外光度检测器（UV）：最小检测量10-9g· mL-1，对流 量和温度的波动不敏感，可用于梯度洗脱。 最常用的检测器。
Beer's Law - BEER定律
光能量∶
P0 = 透过溶剂的光能量 P = 透过样品的光能量
可变体积进样器的精度取决于操作者的技
术，准确度通常更高，因为进样用的注射器结 构的准确度高，操作者的技术水平也有影响， 但不大
内标法定量
配制一系列浓度的标样，其中加有内标样
实际色谱图
1.80
MethylParaben
1.60
1.40
EthylParaben ButylParaben
1.20
E F 0.607h
（ii）半高峰宽W1/2：峰高一半处对应的色谱峰宽(GH) W1/2＝2.354σ
G h/2
H
（iii）色谱峰底宽Wb：色谱峰两侧拐点作切线与基线交 点间的距离(IJ)。
I
J
Wb
（5）保留时间
试样各组分在色谱柱中保留行为的量度。
它反映了组分与固定相之间相互作用的大小
（6）色谱的分离度
色谱柱表面性质
键合相化学
影响化合物的分离度： 不同键合相对不同种类的化合物分离不同 可能导致色谱的分离机理不同 如：C18、C8、CN
如：
填料的端基封口
封口残余硅羟基 减少不可逆吸附或拖尾 增加碳含量（0.1% - 1%）
残基处理的效果
① 抗坏血酸 ② 烟酰胺 ③ 对氨基苯甲酸 ④ 哌咯西叮 ⑤ 核黄素 ⑥ 苯酚 ⑦ 盐酸硫胺
实际色谱图
0 . 3 0
0 . 3 0
0 . 3 0
0 . 2 5
0 . 2 5
0 . 2 5
0 . 2 0
0 . 2 0
0 . 2 0
0 . 1 5
0 . 1 5
0 . 1 5
0 . 1 0
0 . 1 0
0 . 1 0
0 . 0 5
0 . 0 5
0 . 0 5
0 . 0 0
0 . 0 0
0 . 0 0
五、色谱定性定量方法
1、定性分析－保留值
色谱定性分析就是确定试样中的各组分 （1）用已知物对照进行定性 （i）单柱比较法 待定性物质
已知物质
（ii）双柱比较法：两支极性完全不同的柱子 待定性物质
已知物质
待定性物质
已知物质
（iii）峰高增量法：
待定性物质
待定性物质＋已知物质
（2）.与其他分析仪器联用的定性方法
校正因子∶RF( X i ) 标样浓度C ( X i ) 标样响应值R ( X i )
未知组分的浓度∶ Ci RF( X i ) 样品响应值Ai
特点
无需各组份都被检出、洗脱 需要标样 标样及样品测定的条件要一致 进样体积要准确
进样技术对定量结果的影响
固定体积定量管（ loop ）的进样器精度最 好，其准确度取决于进样器的结构
M i n u t e s
M i n u t e sLeabharlann M i n u t e s
5 , 0 0 0 4 , 0 0 0
标准曲线
3 , 0 0 0 响 应 值 () 峰 面 积 2 , 0 0 0 1 , 0 0 0 0 0 5 0 1 0 0 1 5 0 2 0 0 2 5 0 样 品 浓 度
计算公式
机 械 因 素 ∶
N
寿 命 ， 柱 效 ， 速 度 ， 溶 剂 消 耗
平均颗粒度，颗粒度分布
颗粒度(dp)
颗粒度越小：柱效越高(传质好，涡流扩散小) 柱压越高(渗透性差)
颗粒分布
颗粒分布越宽∶柱效低(渗透性差)
颗粒形状
球型∶柱效高、重现性好、柱床结构均匀 无定型：柱床结构不均匀 流动相线性速度不均匀 谱带扩展
小型化的台式色质谱联用仪（GC-MS；LC-MS） 色谱-红外光谱仪联用仪；
组分的结构鉴定
HEWLET PACKAR T D 5972A Mass Selectiv Detect e or
1.0 DEG/MI N
HEWLETT PACKARD
5890
Sample
D
A
Gas Chromatograph (GC) Mass Spectrometer (MS)
液相色谱基础知识
一、色谱起源
石油醚 色素 碳酸钙颗粒 玻璃柱
俄国科学家：M. S. Tswett
两相: 固定相、流动相
色谱系统组成：
待分离组分 ， 和
固定相：填入玻璃管或不
载气 A
锈钢管内静止不动的固体 或液体；
B
色谱柱：装有固定相的管 子（玻璃管或不锈钢管）
C
流动相：携带样品流过色
谱柱的气体或液体。
D
色谱分类：一般按流动相的物理状态分类
流动相 液体 气体 超临界流体
固 定 固体 液-固色谱 气-固色谱 超临界色谱 相 液体 液-液色谱 气-液色谱
二、色谱分离理论
组分赛跑
同时起跑 先后到达终点 什么原因？ 色谱柱是各组分的跑 道
分离是一个物理的过程
流动相（Mobile Phase） 固定相（Stationary Phase） 样品（溶解于流动相中的溶质）
紫外检测器的溶剂影响
不同种类溶剂有其截 止波长 溶剂的质量好坏对其 截止波长有影响 为何溶剂质量不好?
乙 腈
含紫外吸收的杂质 溶解在其中的氧气 缓冲液溶质的紫外吸收
甲 醇
2 0 0 2 2 0 2 4 02 6 0
光电二极管阵列检测器
光电二极管阵列检测器：1024个二极管阵列，各检测特 定波长，计算机快速处理，三维立体谱图，如图所示。