液相色谱基础知识分解
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色谱法的分类
按固定相的形态分:
平面色谱 o 纸色谱
o 薄层色谱
柱色谱
▪篮球比赛是根据运动队在规定的比赛 时间里 得分多 少来决 定胜负 的，因 此，篮 球比赛 的计时 计分系 统是一 种得分 类型的 系统
色谱法的分类示意图
▪篮球比赛是根据运动队在规定的比赛 时间里 得分多 少来决 定胜负 的，因 此，篮 球比赛 的计时 计分系 统是一 种得分 类型的 系统
▪ 高压梯度洗脱（高压混合，高压进柱，2个 泵。）
▪篮球比赛是根据运动队在规定的比赛 时间里 得分多 少来决 定胜负 的，因 此，篮 球比赛 的计时 计分系 统是一 种得分 类型的 系统
▪安捷伦泵：小视频 ▪色谱学堂：泵
▪篮球比赛是根据运动队在规定的比赛 时间里 得分多 少来决 定胜负 的，因 此，篮 球比赛 的计时 计分系 统是一 种得分 类型的 系统
色谱法原理及分类
什么是色谱法 色谱法溯源 Tswett（茨维特)的实验 色谱法原理 色谱法的分类
▪篮球比赛是根据运动队在规定的比赛 时间里 得分多 少来决 定胜负 的，因 此，篮 球比赛 的计时 计分系 统是一 种得分 类型的 系统
什么是色谱法
色谱法是一种现代的分离分析方法 1906年正式命名(见诸文献) 20世纪30年代开始广泛研究和应用 高效液相色谱法的广泛应用始于20世纪70年代
1. 紫外—可见光度检测器：
①固定波长：254nm ， 低压汞 灯。
② 可 调 波 长 ： 190 ～ 800mm ， 钨灯，氘灯。
UV
③光电二极管矩阵检测器： 190～700nm。
接色谱柱 石英窗 光电倍增管
废液
▪篮球比赛是根据运动队在规定的比赛 时间里 得分多 少来决 定胜负 的，因 此，篮 球比赛 的计时 计分系 统是一 种得分 类型的 系统
液相色谱基础知识
电导检测器
原理： ☼ 原理：根据物质在某些介质中电离后所产生的电 导变化来测定电离物质含量。 导变化来测定电离物质含量。广泛应用于 离子色谱法。 离子色谱法。
☼ 优点：对流动相流速和压力的改变不敏感，可用 优点：对流动相流速和压力的改变不敏感，
梯度洗脱。 梯度洗脱。 缺点：对温度变化敏感，每升高1℃, ℃,电导率增加 ☼ 缺点：对温度变化敏感，每升高 ℃,电导率增加 2%-2.5%。
液相色谱基础知识
■ 溶剂等级
☼鬼峰的出现
洗脱曲线
☺水/MeOH梯度 ODS ODS柱 1ml/min在 0~10Mins内 MeOH 0~100% 线性变化后 保持15Min
鬼峰
液相色谱基础知识
■ 溶剂等级
在微量分析和梯度洗脱时建议使用HPLC级溶剂和纯化水 级溶剂和纯化水 在微量分析和梯度洗脱时建议使用
0.001~9.999
岛津VP系列液相色谱仪 岛津VP系列液相色谱仪 VP
柱塞和密封圈的关系
水 出口单 向阀 密封圈 吸液移动 柱塞杆 送液移动 入口单 向阀 泵头清洗流路 流动相
岛津VP系列液相色谱仪 岛津VP系列液相色谱仪 VP
手动进样阀7725i原理
岛津VP系列液相色谱仪 岛津VP系列液相色谱仪 VP
☺无在线脱气机应注意：
1 每天脱气 2 如使用氦脱气，对混合好的溶剂脱气时间不能过长。
液相色谱基础知识
梯度形式的选择
洗脱模式：高压梯度
低压梯度 用两台输液泵将两种流动相混合并进入系统 常压下用比例阀将流动相混合，单泵进入系统
☺线性梯度:洗脱时，流动相的浓度变化和时间成线性变化（增或减） ☺指数梯度:洗脱时，流动相的浓度变化和时间成指数关系（增或减） ☺折线梯度:洗脱时，流动相的浓度变化和时间无规则变化
原理： ☼ 原理：根据物质在某些介质中电离后所产生的电 导变化来测定电离物质含量。 导变化来测定电离物质含量。广泛应用于 离子色谱法。 离子色谱法。
☼ 优点：对流动相流速和压力的改变不敏感，可用 优点：对流动相流速和压力的改变不敏感，
梯度洗脱。 梯度洗脱。 缺点：对温度变化敏感，每升高1℃, ℃,电导率增加 ☼ 缺点：对温度变化敏感，每升高 ℃,电导率增加 2%-2.5%。
液相色谱基础知识
■ 溶剂等级
☼鬼峰的出现
洗脱曲线
☺水/MeOH梯度 ODS ODS柱 1ml/min在 0~10Mins内 MeOH 0~100% 线性变化后 保持15Min
鬼峰
液相色谱基础知识
■ 溶剂等级
在微量分析和梯度洗脱时建议使用HPLC级溶剂和纯化水 级溶剂和纯化水 在微量分析和梯度洗脱时建议使用
0.001~9.999
岛津VP系列液相色谱仪 岛津VP系列液相色谱仪 VP
柱塞和密封圈的关系
水 出口单 向阀 密封圈 吸液移动 柱塞杆 送液移动 入口单 向阀 泵头清洗流路 流动相
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手动进样阀7725i原理
岛津VP系列液相色谱仪 岛津VP系列液相色谱仪 VP
☺无在线脱气机应注意：
1 每天脱气 2 如使用氦脱气，对混合好的溶剂脱气时间不能过长。
液相色谱基础知识
梯度形式的选择
洗脱模式：高压梯度
低压梯度 用两台输液泵将两种流动相混合并进入系统 常压下用比例阀将流动相混合，单泵进入系统
☺线性梯度:洗脱时，流动相的浓度变化和时间成线性变化（增或减） ☺指数梯度:洗脱时，流动相的浓度变化和时间成指数关系（增或减） ☺折线梯度:洗脱时，流动相的浓度变化和时间无规则变化
液相色谱定量基础知识
A4 AIS
C1/CIS C2 /CIS C3 /CIS C4 /CIS
浓度比: 目标 / 内标
11
Shimadzu International Trading (Shanghai) Co. Limited
内标法
试样配制：准确称取一定量的试样Wi，加入一定量内
标物WS 计算式：
wi fi Ai
ws f s As
定量分析的基本要求
❖ 需要有纯物质作标准 ❖ 被定量组分峰要与其它峰达到基线分离 ❖ 符合定性参数要求 ❖ 选择合适的定量方法
4
4
Shimadzu International Trading (Shanghai) Co. Limited
定量分析基本公式
在某些条件限定下，被测组分的浓度与检测器的 响应值成正比的关系。（蒸发光散射检测器浓度 与峰面积不成线性，分别取对数后成线性 ）
wi fi Ai wi wi fi ' Ai '
fi fi '
wi wi Ai '
wi
Ai
wi
wi Ai ' 1
Ai
115
15
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标准加入法特点
1. 不需另外选择内标物 2. 进样量不必十分准确，操作简单 3. 两次色谱条件完全相同以保证校
第三部分 定量基础知识
1
1
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定性方法
❖色谱峰的定性鉴别 通过保留值(通常是保留时间)进行定性 需要指定保留时间误差范围（时间窗、时间带）
液相色谱法
分离度方程
选择因子
柱效
容量因子
k’ 是容量因子，表达了被分离组分与柱填料之间作用的强弱 α 是选择因子，描述两个被分离组份分离的好坏程度，是化学因素 N 是理论塔板数，描述色谱峰谱带展宽的程度
塔板理论
塔板模型假设色谱柱是由大量分离 层构成的，这些分离层称之为理论 塔板 这些塔板实际是不存在的，他们只 是一种假设用来帮助描述色谱柱里 所发生的一切 在这些塔板里面，固定相和流动 相之间存在着一种平衡。分析物在 这种平衡里面存在着一种平衡系数K， 定义为： K = C固定相/ C流动相 随着K的增加，分析物从色谱柱中 的流出时间就越长，即分析物的在 色谱柱内的保留时间越长
易受到细菌和霉菌的影响
不能直接用有机溶剂冲洗
（二）管路中不断有气泡生成
故障：吸滤头堵塞 措施：用5％～20％的稀硝酸，超声波清洗（玻
璃材质的浸泡）， 再用蒸馏水清洗。
注意点：吸滤头拆下时不必将塑料管剪断
（三）泵无法吸液或排液，流路不通
故障：单向阀中宝石球粘附于垫片 措施：1）用针筒抽出口单向阀以产生负压， 使宝石球与垫片分开 2）拆下单向阀，放入异丙醇或水中， 用超声波清洗
6. 使用缓冲盐后，要先用含10%甲醇的水溶液冲洗， 再用有机溶剂冲洗
7. 流动相正相反相转换时用异丙醇过渡
色谱柱的存放 存放前充分冲洗 合适的存放溶剂 接好堵头，避免固定相干涸 存放环境
柱温箱
分析结果重现性好
提高柱效 降低柱压
保证检测稳定性
常用检测器
紫外可见光检测器 (UV)
二极管阵列检测器（PDA） 荧光检测器（RF） 示差折光检测器 (RID） 蒸发光散射检测器（ELSD） 电导检测器（CDD） 质谱检测器（MS）
高效液相色谱(HPLC)基础知识
高效液相色谱（HPLC）基础知识我国药典收载高效液相色谱法项目和数量比较表：方法项目数量1985年版1990年版1995年版2000年版HPLC法鉴别9 34 150 检查12 40 160 含量测定7 60 117 387鉴于HPLC应用在药品分析中越来越多，因此每一个药品分析人员应该掌握并应用HPLC。
I．概论一、液相色谱理论发展简况色谱法的分离原理是：溶于流动相(mobile phase)中的各组分经过固定相时，由于与固定相(stationary phase)发生作用（吸附、分配、离子吸引、排阻、亲和）的大小、强弱不同，在固定相中滞留时间不同，从而先后从固定相中流出。
又称为色层法、层析法。
色谱法最早是由俄国植物学家茨维特（Tswett）在1906年研究用碳酸钙分离植物色素时发现的，色谱法(Chromatography)因之得名。
后来在此基础上发展出纸色谱法、薄层色谱法、气相色谱法、液相色谱法。
液相色谱法开始阶段是用大直径的玻璃管柱在室温和常压下用液位差输送流动相，称为经典液相色谱法，此方法柱效低、时间长（常有几个小时）。
高效液相色谱法(High performance Liquid Chromatography，HPLC)是在经典液相色谱法的基础上，于60年代后期引入了气相色谱理论而迅速发展起来的。
它与经典液相色谱法的区别是填料颗粒小而均匀，小颗粒具有高柱效，但会引起高阻力，需用高压输送流动相，故又称高压液相色谱法(High Pressure Liquid Chromatography，HPLC)。
又因分析速度快而称为高速液相色谱法(High Speed Liquid Chromatography，HSLP)。
也称现代液相色谱。
二、HPLC的特点和优点HPLC有以下特点：高压——压力可达150~300 Kg/cm2。
色谱柱每米降压为75 Kg/cm2以上。
高速——流速为0.1~10.0 ml/min。
液相色谱基础知识
液相色谱—视差折光检测器
检测器组成：光源——透镜——两 束平行光——样品池和参比池—— 光电二极管——比较两者信号差 值——输出信号 。
液相色谱—凝胶色谱
பைடு நூலகம்
凝胶渗透色谱仪（GPC仪）、体积 排阻色谱(Size Exclusion Chrom.) 。 分离原理：利用多孔物质做固定相， 按照待测组分分子尺寸大小进行分 离。测定相对分子量大小、分子量 分布。
环己烷
正丁醇 乙醇 水 异丙醇
乙酸正丙酯
丙酸甲酯 四氯化碳 N,N-二甲基 甲酰胺 苯
260
260 265 270 280
碘甲烷
二硫化碳 硝基甲烷 硝基乙烷 2-硝基丙烷
350
380 380 380 380
甲醇
甲苯
285
液相色谱—荧光检测器
荧光检测器：样品中物质分子能在 特定波长的光激发后跃迁到高能级 状态，在返回到基态的过程中，会 发出波长较长的光，称做荧光。 荧光强度F=I0Φabc I0——激发光强度 Φ——荧光量子产率
Refractive Index Detector
A valve is opened and pure solvent passes into one half of a cell. The eluate flows through the other half of the cell. The two halves are separated by a glass plate mounted at an angle such that bending of the incident beam occurs if the two solutions differ in refractive index.
(干货)液相色谱基础知识大全
一、基本原理高效液相色谱（HPLC）法是以高压下的液体为流动相，并采用颗粒极细的高效固定相的柱色谱分离技术。
高效液相色谱对样品的适用性广，不受分析对象挥发性和热稳定性的限制，因而弥补了气相色谱法的不足。
在目前已知的有机化合物中，可用气相色谱分析的约占20%，而80%则需用高效液相色谱来分析。
高效液相色谱和气相色谱在基本理论方面没有显著不同，它们之间的重大差别在于作为流动相的液体与气体之间的性质的差别。
二、高效液相色谱分析原理（1）、高效液相色谱分析的流程：由泵将储液瓶中的溶剂吸入色谱系统，然后输出，经流量与压力测量之后，导入进样器。
被测物由进样器注入，并随流动相通过色谱柱，在柱上进行分离后进入检测器，检测信号由数据处理设备采集与处理，并记录色谱图。
废液流入废液瓶。
遇到复杂的混合物分离（极性范围比较宽）还可用梯度控制器作梯度洗脱。
这和气相色谱的程序升温类似，不同的是气相色谱改变温度，而HPLC改变的是流动相极性，使样品各组分在最佳条件下得以分离。
（2）、高效液相色谱的分离过程：同其他色谱过程一样，HPLC也是溶质在固定相和流动相之间进行的一种连续多次交换过程。
它借溶质在两相间分配系数、亲和力、吸附力或分子大小不同而引起的排阻作用的差别使不同溶质得以分离。
开始样品加在柱头上，假设样品中含有3个组分，A、B和C，随流动相一起进入色谱柱，开始在固定相和流动相之间进行分配。
分配系数小的组分A不易被固定相阻留，较早地流出色谱柱。
分配系数大的组分C在固定相上滞留时间长，较晚流出色谱柱。
组分B的分配系数介于A，C之间，第二个流出色谱柱。
若一个含有多个组分的混合物进入系统，则混合物中各组分按其在两相间分配系数的不同先后流出色谱柱，达到分离之目的。
不同组分在色谱过程中的分离情况，首先取决于各组分在两相间的分配系数、吸附能力、亲和力等是否有差异，这是热力学平衡问题，也是分离的首要条件。
其次，当不同组分在色谱柱中运动时，谱带随柱长展宽，分离情况与两相之间的扩散系数、固定相粒度的大小、柱的填充情况以及流动相的流速等有关。
液相色谱教程-液相色谱基础知识2
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YOU
拖尾峰(Tailing Peak):后沿较前沿平缓的不对称峰 前伸峰(Leading Peak):前沿较后沿平缓的不对称峰
鬼峰(Ghost Peak):并非由试样所产生的峰,亦称假峰
色谱图名词术语
基线(Baseline):在正常操作条件下,仅由流动相所产生的响应信号 – 基线飘移(Baseline Drift):基线随时间定向的缓慢变化 – 基线噪声(N)(Baseline Noise):由各种因素所引起的基线波动 – 谱带扩展(Band Broadening):由于纵向扩散,传质阻力等因素的影响,使组分在色谱柱内移动过程中谱带宽 度增加的现象
-25%
液相色谱的应用
目的:得到数据-定性及定量分析
– 灵敏度的要求 – 样品的复杂性 – 样品量的要求 – 精度及准确度的要求 – 容易使用
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液相色谱的应用
制备型液相色谱 目的:得到纯品-分离及纯化 • – 化合物的稳定性 • – 样品的复杂性 • – 制备量的要求 • – 纯度的要求，及纯度的鉴定 • – 方法的安全性
半(高)峰宽(Peak Width at Half Height):通 过峰高的中点作平行于峰底的直线,其与峰两 侧相交两点之间的距离
色谱图名词术语
– 峰面积(Peak Area):峰与峰底之间的面积,又称响应值
标准偏差(σ)(Standard Error):0.607倍峰高对应峰宽的一 半
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色谱图名词术语
死时间(t0)(Dead time):不被固定相滞留 的组分,从进样到出现峰最大值所需的时 间 – 保留时间(tR)(Retention time):组分从 进样到出现峰最大值所需的时间
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拖尾峰(Tailing Peak):后沿较前沿平缓的不对称峰 前伸峰(Leading Peak):前沿较后沿平缓的不对称峰
鬼峰(Ghost Peak):并非由试样所产生的峰,亦称假峰
色谱图名词术语
基线(Baseline):在正常操作条件下,仅由流动相所产生的响应信号 – 基线飘移(Baseline Drift):基线随时间定向的缓慢变化 – 基线噪声(N)(Baseline Noise):由各种因素所引起的基线波动 – 谱带扩展(Band Broadening):由于纵向扩散,传质阻力等因素的影响,使组分在色谱柱内移动过程中谱带宽 度增加的现象
-25%
液相色谱的应用
目的:得到数据-定性及定量分析
– 灵敏度的要求 – 样品的复杂性 – 样品量的要求 – 精度及准确度的要求 – 容易使用
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液相色谱的应用
制备型液相色谱 目的:得到纯品-分离及纯化 • – 化合物的稳定性 • – 样品的复杂性 • – 制备量的要求 • – 纯度的要求，及纯度的鉴定 • – 方法的安全性
半(高)峰宽(Peak Width at Half Height):通 过峰高的中点作平行于峰底的直线,其与峰两 侧相交两点之间的距离
色谱图名词术语
– 峰面积(Peak Area):峰与峰底之间的面积,又称响应值
标准偏差(σ)(Standard Error):0.607倍峰高对应峰宽的一 半
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色谱图名词术语
死时间(t0)(Dead time):不被固定相滞留 的组分,从进样到出现峰最大值所需的时 间 – 保留时间(tR)(Retention time):组分从 进样到出现峰最大值所需的时间
液相基础知识
液相基础知识
• 色谱法也叫层析法，它是一种高效能的物理分离 技术，将它用于分析化学并配合适当的检测手段， 就成为色谱分析法。 • 色谱法（Chromatography）溯源
– 色谱法 色谱法又称色谱分析 色谱分析法 层析法 色谱分析、色谱分析法 层析法，是一种 色谱分析 色谱分析法、层析法 分离和分析方法，在分析化学、有机化学、生物化学 等领域有着非常广泛的应用。色谱法利用不同物质在 不同相态的选择性分配，以流动相对固定相中的混合 物进行洗脱，混合物中不同的物质会以不同的速度沿 固定相移动，最终达到分离的效果。
－－经典的液相色谱 液相色谱法，流动相在常压下输送，所 液相色谱 用的固定相柱效低，分析周期长。 －－而现代液相色谱 液相色谱法引用了气相色谱的理论，流 液相色谱 动相改为高压输送（最高输送压力可达 4.9107Pa）;色谱柱是以特殊的方法用小粒径的 填料填充而成，从而使柱效大大高于经典液相色 液相色 谱（每米塔板数可达几万或几十万）；同时柱后 连有高灵敏度的检测器，可对流出物进行连续检 测。因此，高效液相色谱 液相色谱具有分析速度快、分离 液相色谱 效能高、自动化等特点。所以人们称它为高压、 高速、高效或现代液相色谱 液相色谱法。 液相色谱
缺乏灵敏度 － 和其他检测器相比，RI检测器一般灵敏度较低 和其他检测器相比， 检测器一般灵敏度较低
0.14 0.12 0.10 AU 0.08 0.06 0.04 0.02 0.00 15.00 10.00 5.00 0.00 -5.00 -10.00 -15.00 -20.00 -25.00 -30.00
返回
液相色谱的检测器
• 常规检测器
– 示差折光检测器（Refractive Index） – 紫外/可见光吸收检测器（UV-Vis） – 荧光检测器（Fluorescence） – 蒸发光散射检测器（Evaporative Light Scattering） – 其他检测器（Other Detectors）
• 色谱法也叫层析法，它是一种高效能的物理分离 技术，将它用于分析化学并配合适当的检测手段， 就成为色谱分析法。 • 色谱法（Chromatography）溯源
– 色谱法 色谱法又称色谱分析 色谱分析法 层析法 色谱分析、色谱分析法 层析法，是一种 色谱分析 色谱分析法、层析法 分离和分析方法，在分析化学、有机化学、生物化学 等领域有着非常广泛的应用。色谱法利用不同物质在 不同相态的选择性分配，以流动相对固定相中的混合 物进行洗脱，混合物中不同的物质会以不同的速度沿 固定相移动，最终达到分离的效果。
－－经典的液相色谱 液相色谱法，流动相在常压下输送，所 液相色谱 用的固定相柱效低，分析周期长。 －－而现代液相色谱 液相色谱法引用了气相色谱的理论，流 液相色谱 动相改为高压输送（最高输送压力可达 4.9107Pa）;色谱柱是以特殊的方法用小粒径的 填料填充而成，从而使柱效大大高于经典液相色 液相色 谱（每米塔板数可达几万或几十万）；同时柱后 连有高灵敏度的检测器，可对流出物进行连续检 测。因此，高效液相色谱 液相色谱具有分析速度快、分离 液相色谱 效能高、自动化等特点。所以人们称它为高压、 高速、高效或现代液相色谱 液相色谱法。 液相色谱
缺乏灵敏度 － 和其他检测器相比，RI检测器一般灵敏度较低 和其他检测器相比， 检测器一般灵敏度较低
0.14 0.12 0.10 AU 0.08 0.06 0.04 0.02 0.00 15.00 10.00 5.00 0.00 -5.00 -10.00 -15.00 -20.00 -25.00 -30.00
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液相色谱的检测器
• 常规检测器
– 示差折光检测器（Refractive Index） – 紫外/可见光吸收检测器（UV-Vis） – 荧光检测器（Fluorescence） – 蒸发光散射检测器（Evaporative Light Scattering） – 其他检测器（Other Detectors）
液相色谱基础理论.ppt
鬼峰 － Ghost Peak
并非由试样所产生的峰；亦称假峰
17
基础理论：术语介绍
基线－Baseline
在正常操作条件下，仅由流动相所产生的响应信号的曲线
基线飘移 － Baseline Drift
基线随时间定向的缓慢变化
基线噪声；N － Baseline Noise
由各种因素所引起的基线波动
16
基础理论：术语介绍
峰面积 － Peak Area
峰与峰底之间的面积,又称响应值
标准偏差；σ － Standard Error
0.607倍峰高处所对应峰宽的一半
拖尾峰 － Tailing Peak
后沿较前沿平缓的不对称峰
前伸峰 － Leading Peak
前沿较后沿平缓的不对称峰
调整保留体积，V’R － Adjust retention volume
戴安中国HPLC用户培训 2011年
戴安中国有限公司
液相色谱基础知识部分
液相色谱简介 液相色谱理论基础
2
高效液相色谱简介
3
色谱的发明人
俄国科学家：M. S. Tswett 正式命名“色谱”的文献
4
经典液相色谱
石油醚 淋洗剂
叶绿素
碳酸钙 颗粒
Review Stop
叶绿素 中的有 色物质
峰底 － Peak Base
峰的起点与终点之间连接的直线
峰高 － Peak Height
峰最大值到峰底的距离
峰宽 － Peak Width
在峰两侧拐点处所作切线与峰底相交两点之间的距离
半（高）峰宽 － Peak Width at Half Height
并非由试样所产生的峰；亦称假峰
17
基础理论：术语介绍
基线－Baseline
在正常操作条件下，仅由流动相所产生的响应信号的曲线
基线飘移 － Baseline Drift
基线随时间定向的缓慢变化
基线噪声；N － Baseline Noise
由各种因素所引起的基线波动
16
基础理论：术语介绍
峰面积 － Peak Area
峰与峰底之间的面积,又称响应值
标准偏差；σ － Standard Error
0.607倍峰高处所对应峰宽的一半
拖尾峰 － Tailing Peak
后沿较前沿平缓的不对称峰
前伸峰 － Leading Peak
前沿较后沿平缓的不对称峰
调整保留体积，V’R － Adjust retention volume
戴安中国HPLC用户培训 2011年
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液相色谱基础知识部分
液相色谱简介 液相色谱理论基础
2
高效液相色谱简介
3
色谱的发明人
俄国科学家：M. S. Tswett 正式命名“色谱”的文献
4
经典液相色谱
石油醚 淋洗剂
叶绿素
碳酸钙 颗粒
Review Stop
叶绿素 中的有 色物质
峰底 － Peak Base
峰的起点与终点之间连接的直线
峰高 － Peak Height
峰最大值到峰底的距离
峰宽 － Peak Width
在峰两侧拐点处所作切线与峰底相交两点之间的距离
半（高）峰宽 － Peak Width at Half Height
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分离是一个物理的过程
流动相（Mobile Phase） 固定相（Stationary Phase） 样品（溶解于流动相中的溶质）
什么是液相色谱
色谱
液相色谱
气相色谱
柱色谱 纸色谱 薄层色谱
气相色谱：流动相是气相 液相色谱：流动相是液相
高效液相色谱 HPLC
什么是高效液相色谱
High Performance Liquid Chromatography 高效液相色谱法，简称：HPLC
液相色谱图相关术语
死时间，t0 － Dead time 不被固定相滞留的组分，从进样到出现峰最大值所需 的时间
保留时间，tR － Retention time 组分从进样到出现峰最大值所需的时间
死体积，V0 － Dead volume 不被固定相滞留的组分，从进样到出现峰最大值所需 的流动相体积
保留体积，VR － Retention volume 组分从进样到出现峰最大值所需的流动相体积
峰底 － Peak Base 峰的起点与终点之间连接的直线
峰高 － Peak Height 峰最大值到峰底的距离
峰宽 － Peak Width 在峰两侧拐点处所作切线与峰底相交两点之间的距离
半（高）峰宽 － Peak Width at Half Height 通过峰高的中点作平行于峰底的直线，其与峰两侧相 交两点之间的距离
G
F
泵输液 进样
分离
检测
记录
HPLC的仪器配置
数据处理系统
溶剂 色谱泵 自动进样器 色谱柱及柱温箱 检测器
HPLC的应用
在食品研究中的分析应用 食品中的天然成分
✓ 碳水化合物 ✓ 类脂化合物、甘油三酸酯、胆固醇 ✓ 脂肪酸和有机酸 ✓ 蛋白、肽、氨基酸
食品添加剂
✓ 酸味剂、甜味剂、香精、乳化剂 ✓ 抗氧化剂、防腐剂 ✓ 颜料和染料（色素〕 ✓ 维生素
污染物
✓ 霉菌（黄曲霉毒素〕 ✓ 农药和兽药残留 研究中分析应用
在医药研究中分析应用
药物分析有USP、BP、CP等标准
常用药物研究中的应用：解热镇痛药、镇静药、安定药、心 血管药、磺胺类消炎药等。 甾体药物研究中的应用：肾上腺皮质激素、雄性激素、雌性 激素和孕激素等。 抗菌素类药物研究中的应用：青霉素、头孢菌素、庆大毒素 、四环素、氯霉素、诺氟沙星等。 中草药研究中的应用：生物碱、甙类(皂甙、强心甙、黄酮甙 等)、萜类 手性药物研究中的应用：光学异构体的拆分(如解毒剂D-青霉 胺毒性小，L-异构体毒性很强) 医疗药物的检测、新药研究、药物代谢、药代动力学研究。
1906年正式命名（见诸文献） 色谱法；Chromatography
50年代开始广泛研究和应用 主要是气相色谱及薄层色谱
高效液相色谱法的广泛应用始于70年代
色谱的发明人
俄国科学家：M. S. Tswett 正式命名“色谱”的文献
经典液相色谱
一、色谱起源
色素 玻璃柱
石油醚 碳酸钙颗粒
色谱分离的机理
HPLC 的应用
在生物化学和生物工程中的应用
氨基酸、多肽和蛋白质的分析研究 核碱、核苷、核苷酸和核酸的分析研究 生物胺的分析研究（儿茶酚胺类)
在精细化工分析中的应用
醇、醛和酮、醚的分离分析 酸和酯的分离分析 表面活性剂的分析 聚合物的分析研究 药物、农药、染料、炸药等工业产品
在无机离子分析中应用
饮用水、酸雨、土壤中阴离子和阳离子分析
HPLC的应用
在公安、刑警破案工作需要
毒品分析等
在环境污染分析中的应用
废气、废水、废渣中多环芳烃、多氯联苯、农药残留、 酚类和胺类的检测
*************************************
2004年获悉，世界上化合物总数达到4700万，其中绝大
部分是有机化合物，而大约有70％以上是不挥发的。对 HPLC来说，只要被分析物质在流动相溶剂（各种各样〕中 有一定的溶解度便可分析。所以，HPLC在各行各业有着广 泛的应用潜力。
液相色谱应用：制备型液相色谱
分离及纯化样品是液相色谱原理的直接利用 对分离及纯化的要求
化合物的稳定性 样品的复杂性 制备量的要求 纯度的要求，及纯度的鉴定 方法的安全性
液相色谱应用：分析型液相色谱
是一种区别于经典液相色谱；基于仪器方法的高 效能分离手段：
高性能的色谱柱，高精度、耐高压的输液泵以 及高灵敏度的检测器…… 广泛应用于各个领域： 医药 / 环保 / 石化 / 生命科学 / 食品及农业…… 在技术，理论及应用上仍处于发展阶段
液相色谱的基本流程图
流动相
进样阀 泵
色谱柱
检测器
AB C
DE
液相色谱图相关术语
峰面积 － Peak Area 峰与峰底之间的面积,又称响应值
标准偏差；σ － Standard Error 0.607倍峰高处所对应峰宽的一半
拖尾峰 － Tailing Peak 后沿较前沿平缓的不对称峰
前伸峰 － Leading Peak 前沿较后沿平缓的不对称峰
鬼峰 － Ghost Peak 并非由试样所产生的峰；亦称假峰
高效液相色谱基本概念
色谱图：HPLC图形结果（Chromatogram）
色谱图即色谱柱流出物通过检测器时所产生的响应信号对时间的 曲线图，其纵坐标为信号强度，横坐标为保留时间。
基线 ↓
← 色谱峰 峰宽
保留时间（分）
峰高
液相色谱图相关术语
色谱峰 － Peak 色谱柱流出组分通过检测器时产生的响应信号的微分 曲线
液相色谱基础知识
关于色谱
色谱是一种分离工具，而不是传统意义上的分析 仪器 常见的分离方式：
蒸馏、离心、电泳、过滤、超滤 等等
色谱
是其中一种分离工具
色谱法简介
色谱法（Chromatography）溯源 俄国科学加1903年发现色谱的吸附原理，开创 了应用吸附原理分离植物色素的新方法并见诸 于俄文的文献
液相色谱图相关术语
基线 － Baseline 在正常操作条件下，仅由流动相所产生的响应信号的 曲线
基线飘移 － Baseline Drift 基线随时间定向的缓慢变化
基线噪声；N － Baseline Noise 由各种因素所引起的基线波动
谱带扩展 － Band Broadening 由于纵向扩散,传质阻力等因素的影响,使组分在色谱柱 内移动过程中谱带宽度增加的现象
流动相（Mobile Phase） 固定相（Stationary Phase） 样品（溶解于流动相中的溶质）
什么是液相色谱
色谱
液相色谱
气相色谱
柱色谱 纸色谱 薄层色谱
气相色谱：流动相是气相 液相色谱：流动相是液相
高效液相色谱 HPLC
什么是高效液相色谱
High Performance Liquid Chromatography 高效液相色谱法，简称：HPLC
液相色谱图相关术语
死时间，t0 － Dead time 不被固定相滞留的组分，从进样到出现峰最大值所需 的时间
保留时间，tR － Retention time 组分从进样到出现峰最大值所需的时间
死体积，V0 － Dead volume 不被固定相滞留的组分，从进样到出现峰最大值所需 的流动相体积
保留体积，VR － Retention volume 组分从进样到出现峰最大值所需的流动相体积
峰底 － Peak Base 峰的起点与终点之间连接的直线
峰高 － Peak Height 峰最大值到峰底的距离
峰宽 － Peak Width 在峰两侧拐点处所作切线与峰底相交两点之间的距离
半（高）峰宽 － Peak Width at Half Height 通过峰高的中点作平行于峰底的直线，其与峰两侧相 交两点之间的距离
G
F
泵输液 进样
分离
检测
记录
HPLC的仪器配置
数据处理系统
溶剂 色谱泵 自动进样器 色谱柱及柱温箱 检测器
HPLC的应用
在食品研究中的分析应用 食品中的天然成分
✓ 碳水化合物 ✓ 类脂化合物、甘油三酸酯、胆固醇 ✓ 脂肪酸和有机酸 ✓ 蛋白、肽、氨基酸
食品添加剂
✓ 酸味剂、甜味剂、香精、乳化剂 ✓ 抗氧化剂、防腐剂 ✓ 颜料和染料（色素〕 ✓ 维生素
污染物
✓ 霉菌（黄曲霉毒素〕 ✓ 农药和兽药残留 研究中分析应用
在医药研究中分析应用
药物分析有USP、BP、CP等标准
常用药物研究中的应用：解热镇痛药、镇静药、安定药、心 血管药、磺胺类消炎药等。 甾体药物研究中的应用：肾上腺皮质激素、雄性激素、雌性 激素和孕激素等。 抗菌素类药物研究中的应用：青霉素、头孢菌素、庆大毒素 、四环素、氯霉素、诺氟沙星等。 中草药研究中的应用：生物碱、甙类(皂甙、强心甙、黄酮甙 等)、萜类 手性药物研究中的应用：光学异构体的拆分(如解毒剂D-青霉 胺毒性小，L-异构体毒性很强) 医疗药物的检测、新药研究、药物代谢、药代动力学研究。
1906年正式命名（见诸文献） 色谱法；Chromatography
50年代开始广泛研究和应用 主要是气相色谱及薄层色谱
高效液相色谱法的广泛应用始于70年代
色谱的发明人
俄国科学家：M. S. Tswett 正式命名“色谱”的文献
经典液相色谱
一、色谱起源
色素 玻璃柱
石油醚 碳酸钙颗粒
色谱分离的机理
HPLC 的应用
在生物化学和生物工程中的应用
氨基酸、多肽和蛋白质的分析研究 核碱、核苷、核苷酸和核酸的分析研究 生物胺的分析研究（儿茶酚胺类)
在精细化工分析中的应用
醇、醛和酮、醚的分离分析 酸和酯的分离分析 表面活性剂的分析 聚合物的分析研究 药物、农药、染料、炸药等工业产品
在无机离子分析中应用
饮用水、酸雨、土壤中阴离子和阳离子分析
HPLC的应用
在公安、刑警破案工作需要
毒品分析等
在环境污染分析中的应用
废气、废水、废渣中多环芳烃、多氯联苯、农药残留、 酚类和胺类的检测
*************************************
2004年获悉，世界上化合物总数达到4700万，其中绝大
部分是有机化合物，而大约有70％以上是不挥发的。对 HPLC来说，只要被分析物质在流动相溶剂（各种各样〕中 有一定的溶解度便可分析。所以，HPLC在各行各业有着广 泛的应用潜力。
液相色谱应用：制备型液相色谱
分离及纯化样品是液相色谱原理的直接利用 对分离及纯化的要求
化合物的稳定性 样品的复杂性 制备量的要求 纯度的要求，及纯度的鉴定 方法的安全性
液相色谱应用：分析型液相色谱
是一种区别于经典液相色谱；基于仪器方法的高 效能分离手段：
高性能的色谱柱，高精度、耐高压的输液泵以 及高灵敏度的检测器…… 广泛应用于各个领域： 医药 / 环保 / 石化 / 生命科学 / 食品及农业…… 在技术，理论及应用上仍处于发展阶段
液相色谱的基本流程图
流动相
进样阀 泵
色谱柱
检测器
AB C
DE
液相色谱图相关术语
峰面积 － Peak Area 峰与峰底之间的面积,又称响应值
标准偏差；σ － Standard Error 0.607倍峰高处所对应峰宽的一半
拖尾峰 － Tailing Peak 后沿较前沿平缓的不对称峰
前伸峰 － Leading Peak 前沿较后沿平缓的不对称峰
鬼峰 － Ghost Peak 并非由试样所产生的峰；亦称假峰
高效液相色谱基本概念
色谱图：HPLC图形结果（Chromatogram）
色谱图即色谱柱流出物通过检测器时所产生的响应信号对时间的 曲线图，其纵坐标为信号强度，横坐标为保留时间。
基线 ↓
← 色谱峰 峰宽
保留时间（分）
峰高
液相色谱图相关术语
色谱峰 － Peak 色谱柱流出组分通过检测器时产生的响应信号的微分 曲线
液相色谱基础知识
关于色谱
色谱是一种分离工具，而不是传统意义上的分析 仪器 常见的分离方式：
蒸馏、离心、电泳、过滤、超滤 等等
色谱
是其中一种分离工具
色谱法简介
色谱法（Chromatography）溯源 俄国科学加1903年发现色谱的吸附原理，开创 了应用吸附原理分离植物色素的新方法并见诸 于俄文的文献
液相色谱图相关术语
基线 － Baseline 在正常操作条件下，仅由流动相所产生的响应信号的 曲线
基线飘移 － Baseline Drift 基线随时间定向的缓慢变化
基线噪声；N － Baseline Noise 由各种因素所引起的基线波动
谱带扩展 － Band Broadening 由于纵向扩散,传质阻力等因素的影响,使组分在色谱柱 内移动过程中谱带宽度增加的现象