液相色谱定量基础知识
液相色谱基础知识
原理： ☼ 原理：根据物质在某些介质中电离后所产生的电 导变化来测定电离物质含量。 导变化来测定电离物质含量。广泛应用于 离子色谱法。 离子色谱法。
☼ 优点：对流动相流速和压力的改变不敏感，可用 优点：对流动相流速和压力的改变不敏感，
梯度洗脱。 梯度洗脱。 缺点：对温度变化敏感，每升高1℃, ℃,电导率增加 ☼ 缺点：对温度变化敏感，每升高 ℃,电导率增加 2%-2.5%。
液相色谱基础知识
■ 溶剂等级
☼鬼峰的出现
洗脱曲线
☺水/MeOH梯度 ODS ODS柱 1ml/min在 0~10Mins内 MeOH 0~100% 线性变化后 保持15Min
鬼峰
液相色谱基础知识
■ 溶剂等级
在微量分析和梯度洗脱时建议使用HPLC级溶剂和纯化水 级溶剂和纯化水 在微量分析和梯度洗脱时建议使用
0.001~9.999
岛津VP系列液相色谱仪 岛津VP系列液相色谱仪 VP
柱塞和密封圈的关系
水 出口单 向阀 密封圈 吸液移动 柱塞杆 送液移动 入口单 向阀 泵头清洗流路 流动相
岛津VP系列液相色谱仪 岛津VP系列液相色谱仪 VP
手动进样阀7725i原理
岛津VP系列液相色谱仪 岛津VP系列液相色谱仪 VP
☺无在线脱气机应注意：
1 每天脱气 2 如使用氦脱气，对混合好的溶剂脱气时间不能过长。
液相色谱基础知识
梯度形式的选择
洗脱模式：高压梯度
低压梯度 用两台输液泵将两种流动相混合并进入系统 常压下用比例阀将流动相混合，单泵进入系统
☺线性梯度:洗脱时，流动相的浓度变化和时间成线性变化（增或减） ☺指数梯度:洗脱时，流动相的浓度变化和时间成指数关系（增或减） ☺折线梯度:洗脱时，流动相的浓度变化和时间无规则变化
岛津液相色谱培训-定量基础知识
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面积 A1 AIS
面积比: 目标/ 内标
Calibration curve
A4 /AIS A3 /AIS A2 /AIS A1/AIS
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内标法特点
多用在国际标准和规定比较严格的方法中
特点： • 1）进样量不严格要求 • 2）只对所测组分作校正 • 3）必须在样品中加一内标组分 • 4）操作较为繁琐 • 5）选择内标物比较困难
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选择内标物应注意
• 理化性质与待测物相近 • 色谱响应与待测物相近 • 与待测物有良好的分离，但不能相距太远 • 与待测物的峰面积比为0.7-1.3最好，因此要 根据待测物的浓度确定内标物的添加量
Nam e
150
150
mAU
100
100
50
50
0
0
0
2
4
6 M in u t e s
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mAU
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峰面积处理参数
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岛津液相色谱培训 ---定量基础知识
岛津国际贸易（上海）有限公司
分析中心
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气相及液相色谱法基础知识
气相色谱法基础知识一、气相色谱的简要介绍气相色谱法是二十世纪五十年代出现的一项重大科学技术成就。
这是一种新的分离、分析技术，它在工业、农业、国防、建设、科学研究中都得到了广泛应用。
气相色谱可分为气固色谱和气液色谱。
气固色谱的“气”字指流动相是气体，“固”字指固定相是固体物质。
例如活性炭、硅胶等。
气液色谱的“气”字指流动相是气体，“液”字指固定相是液体。
例如在惰性材料硅藻土涂上一层角鲨烷，可以分离、测定纯乙烯中的微量甲烷、乙炔、丙烯、丙烷等杂质。
二、气相色谱法的特点气相色谱法是指用气体作为流动相的色谱法。
由于样品在气相中传递速度快，因此样品组分在流动相和固定相之间可以瞬间地达到平衡。
另外加上可选作固定相的物质很多，因此气相色谱法是一个分析速度快和分离效率高的分离分析方法。
近年来采用高灵敏选择性检测器，使得它又具有分析灵敏度高、应用范围广等优点。
三、气相色谱法的应用在石油化学工业中大部分的原料和产品都可采用气相色谱法来分析；在电力部门中可用来检查变压器的潜伏性故障；在环境保护工作中可用来监测城市大气和水的质量；在农业上可用来监测农作物中残留的农药；在商业部门可和来检验及鉴定食品质量的好坏；在医学上可用来研究人体新陈代谢、生理机能；在临床上用于鉴别药物中毒或疾病类型；在宇宙舴中可用来自动监测飞船密封仓内的气体等等。
气相色谱专业知识1 气相色谱气相色谱是一种以气体为流动相的柱色谱法，根据所用固定相状态的不同可分为气-固色谱(GSC)和气-液色谱(GLC)。
2 气相色谱原理气相色谱的流动相为惰性气体，气-固色谱法中以表面积大且具有一定活性的吸附剂作为固定相。
当多组分的混合样品进入色谱柱后，由于吸附剂对每个组分的吸附力不同，经过一定时间后，各组分在色谱柱中的运行速度也就不同。
吸附力弱的组分容易被解吸下来，最先离开色谱柱进入检测器，而吸附力最强的组分最不容易被解吸下来，因此最后离开色谱柱。
如此，各组分得以在色谱柱中彼此分离，顺序进入检测器中被检测、记录下来。
高效液相色谱(HPLC)基础知识
高效液相色谱（HPLC）基础知识我国药典收载高效液相色谱法项目和数量比较表：方法项目数量1985年版1990年版1995年版2000年版HPLC法鉴别9 34 150 检查12 40 160 含量测定7 60 117 387鉴于HPLC应用在药品分析中越来越多，因此每一个药品分析人员应该掌握并应用HPLC。
I．概论一、液相色谱理论发展简况色谱法的分离原理是：溶于流动相(mobile phase)中的各组分经过固定相时，由于与固定相(stationary phase)发生作用（吸附、分配、离子吸引、排阻、亲和）的大小、强弱不同，在固定相中滞留时间不同，从而先后从固定相中流出。
又称为色层法、层析法。
色谱法最早是由俄国植物学家茨维特（Tswett）在1906年研究用碳酸钙分离植物色素时发现的，色谱法(Chromatography)因之得名。
后来在此基础上发展出纸色谱法、薄层色谱法、气相色谱法、液相色谱法。
液相色谱法开始阶段是用大直径的玻璃管柱在室温和常压下用液位差输送流动相，称为经典液相色谱法，此方法柱效低、时间长（常有几个小时）。
高效液相色谱法(High performance Liquid Chromatography，HPLC)是在经典液相色谱法的基础上，于60年代后期引入了气相色谱理论而迅速发展起来的。
它与经典液相色谱法的区别是填料颗粒小而均匀，小颗粒具有高柱效，但会引起高阻力，需用高压输送流动相，故又称高压液相色谱法(High Pressure Liquid Chromatography，HPLC)。
又因分析速度快而称为高速液相色谱法(High Speed Liquid Chromatography，HSLP)。
也称现代液相色谱。
二、HPLC的特点和优点HPLC有以下特点：高压——压力可达150~300 Kg/cm2。
色谱柱每米降压为75 Kg/cm2以上。
高速——流速为0.1~10.0 ml/min。
液相色谱基础知识
液相色谱—视差折光检测器
检测器组成：光源——透镜——两 束平行光——样品池和参比池—— 光电二极管——比较两者信号差 值——输出信号 。
液相色谱—凝胶色谱
பைடு நூலகம்
凝胶渗透色谱仪（GPC仪）、体积 排阻色谱(Size Exclusion Chrom.) 。 分离原理：利用多孔物质做固定相， 按照待测组分分子尺寸大小进行分 离。测定相对分子量大小、分子量 分布。
环己烷
正丁醇 乙醇 水 异丙醇
乙酸正丙酯
丙酸甲酯 四氯化碳 N,N-二甲基 甲酰胺 苯
260
260 265 270 280
碘甲烷
二硫化碳 硝基甲烷 硝基乙烷 2-硝基丙烷
350
380 380 380 380
甲醇
甲苯
285
液相色谱—荧光检测器
荧光检测器：样品中物质分子能在 特定波长的光激发后跃迁到高能级 状态，在返回到基态的过程中，会 发出波长较长的光，称做荧光。 荧光强度F=I0Φabc I0——激发光强度 Φ——荧光量子产率
Refractive Index Detector
A valve is opened and pure solvent passes into one half of a cell. The eluate flows through the other half of the cell. The two halves are separated by a glass plate mounted at an angle such that bending of the incident beam occurs if the two solutions differ in refractive index.
液相色谱仪的检定和校准
使用中检验 – + + – – – + + + – – – – +
最小检测浓度 * 波长示值误差 波长重复性 线性范围 换挡误差 整机 定性定量重复性*
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2. 液相色谱仪检定规程
5）计量器具控制
c) 检定方法 d) 检定结果的处理 一个检测器 一个以上检测器 e) 检定周期 一般不超过2年。 修理、更换重要部件或对仪器性能 有怀疑时，应随时检定。
式中:
ND为检测器基线噪声， K 为衰减倍数， B 为测得的基线峰-峰高对应的记录仪标度（AU）。
基线漂移用一小时内基线偏离原点的值（AU/h）表示。 30
3. 液相色谱仪检定方法
色谱基线噪声图
31
3. 液相色谱仪检定方法
色谱基线漂移图
32
3. 液相色谱仪检定方法
3.4.3 最小检测浓度的检定
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3. 液相色谱仪检定方法
3.4 紫外-可见光和二极管阵列检测器的检定
3.4.1 波长示值误差和重复性的检定 将检测器和记录仪连接好，仪器预热后，将紫外波 长标准溶液（标准波长为235nm，257nm, 313nm 和 350nm）注入样品池中冲洗，并将池充满。将检测器波 长调到低于标准波长5nm处（如检定257nm时，检测器波 长先调到252nm），记录纸速调到（2～4）cm/min，记 录笔调到记录纸的中间，启动记录仪，记录笔画出一条 直线。调检测器波长，每（5～10）s改变1nm，记录仪 上将画出如下图所示的折线，折线的最高点（或最低点） 对应的波长与标准溶液波长之差为波长示值误差。每个 波长重复测量3次，其中最大值与最小值之差为波长重 复性误差。 28
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梯度误差Gc:不超过±3％
高效液相色谱提纲
高效液相色谱提纲色谱的基础知识第一章色谱分析法概述一、色谱分析法发展简介二、色谱法分类1、按两相状态分类2、按操作形式分类3、按分离原理分类三、HPLC与其他方法的比较1. 色谱法与精馏、萃取分离比较2. 色谱法与光谱、质谱分析方法比较3. 高效液相色谱与经典色谱的比较4. 液相色谱与气相色谱的比较四、色谱法特点五、现代色谱法应用领域六、有关色谱主要期刊与书籍第二章色谱分析法的理论基础一、色谱流出曲线二、色谱图中的基本术语三、分配平衡四、色谱法的基本理论五、色谱法基本分离方程第三章色谱定性分析和定量分析一、定性分析二、定量分析高效液相色谱的知识第四章高效液相色谱仪第五章色谱分离系统一、液相色谱分离原理及分类（一）分离原理（二）高效液相色谱法的主要类型二、高效液相色谱的固定相1. 高效液相色谱固定相以承受高压能力来分类2.高效液相色谱固定相按孔隙深度分类3. 高效液相色谱固定相以化学组成来分类三、流动相1.对流动相溶剂的要求：2. 流动相及流动相的极性3. 流动相的组成四、色谱柱1. 色谱柱的构型2. 色谱柱寿命第六章液固色谱法和液液色谱法一、液一固吸附色谱法(LSAC)1．分离原理 2.固定相 3.流动相二、液一液分配色谱法（LLPC）1．分离原理 2.固定相 3.流动相第七章化学键合相色谱法一、化学键合固定相二、反相键合相色谱法三、正相键合相色谱法四、离子性键合相色谱法第八章离子交换和离子色谱法一、离子交换色谱法1．离子交换色谱原理2．固定相3．流动相二、离子色谱法1.离子色谱法原理2.离子色谱具有以下优点3.离子色谱装置类型4.离子色谱的应用第九章体积排阻色谱法高效液相色谱同时测定食品中的苯甲酸、山梨酸、糖精钠、维生素C高效液相色谱同时测定药品中的苯甲酸与水杨酸样品处理、条件优化及应用第十章色谱分析样品处理一、样品的采集二、常用样品制备技术（一）溶剂萃取***1. 液-液萃取液-液萃取新技术——液相微萃取2. 液-固萃取3. 液-气萃取（溶液吸收）4. 萃取溶剂的选择（二）蒸馏1. 简单蒸馏2. 分馏3. 减压蒸馏4. 水蒸气蒸馏（三）固相萃取***1. 固相萃取的模式及原理2. 固相萃取的常用吸附剂3. 固相萃取的装置及操作程序4. 固相萃取技术的应用（四）膜分离（五）衍生化技术*（六）其它样品制备技术*1. 超临界流体萃取2. 微波萃取技术第十一章衍生化技术及浓缩柱一、衍生化技术（一）按衍生化反应分类1.衍生化反应满足条件2. 按衍生化反应类别分类（二）按衍生化的方式分类1. 柱前衍生2. 柱后衍生二、浓缩柱第十二章高效液相色谱分离条件的优化及建立分析方法的一般步骤一、高效液相色谱分离条件的优化（一）高效液相色谱中色谱参数的相关性1. 色谱参数的分类2. 色谱参数的相关性（二）色谱分离条件优化标准的选择1. 难分离物质对的峰对分离优化标准2. 整体色谱图的优化标准二、建立HPLC分析方法的一般步骤（一）样品的性质及柱分离模式的选择1. 样品的溶解度2. 样品的分子量范围3. 样品的分子结构和分析特性（二）分离操作条件的选择1. 容量因子和死时间的测量2. 色谱柱操作参数的选择3. 样品组分保留值和容量因子的选择4. 相邻组分的选择性系数和分离度的选择第十三章高效液相色谱法的实验技术和分析应用一、高效液相色谱法的实验技术1. 溶剂的纯化技术2. 色谱柱的装填技术3. 色谱柱的平衡、保护与清洗、再生技术二、HPLC法的分析应用第十四章液相制备色谱。
高效液相色谱基础知识总结
（LC-MS），有效的弥补了色谱法定性分析特征性差的弱 点，成为最重要的分离分析方法之一， LC-MS在选择性、 灵敏度、分子量测定和提供结构信息方面具有明显的优 势，能够同时获得可靠的定性定量结果，因而被广泛应 用于药物的质量控制（杂质、副产物、降解产物等的鉴 定和测定）、药物在生物体内的吸收、分布和代谢研究 （包括代谢物的结构确定及定量）和临床医学研究（如 蛋白异常的研究）。 LC-MS已成为新药研究必不可少的 手段。20世纪70年代，高效液相色谱法崛起克服了
高效液相色谱基础知识总结
二、基本概念和术语
一、色谱图和峰参数 1、色谱图(chromatogram)--样品流经色谱柱和检测器， 所得到的信号-时间曲线，又称色谱流出曲线(elution profile)。 2、基线(base line)--经流动相冲洗，柱与流动相达到 平衡后，检测器测出一段时间的流出曲线。一般应平行 于时间轴。基线反映仪器及操作条件的恒定程度，主要 由流动相中的杂质等因素决定。
键合相色谱法是将类似于气相色谱中的固定液的液 体，通过化学反应键合到硅胶表面，从而形成固定相。
高效液相色谱基础知识总结
采用化学键合固定相的色谱法称为键合相色谱。若采用 极性键合相、非极性流动相，则称为正相色谱；采用非 极性键合相、极性流动相，则称为反相色谱。这种分离 的保留值大小，主要决定于组分分子与键合固定液分子 间作用力的大小。
高效液相色谱基础知识总结
气相色谱法不能直接用于分析难挥发、热不稳定及高分 子化合物等的弱点，大大扩大了色谱法的应用范围，把 色谱法推进到一个新水平。
高效液相色谱（high performance liquid chromatography, HPLC）是一种高效、快速的分离分析 技术，具有灵敏度高、选择性好的特点。HPLC具有的同 时分离和分析的功能对于体内药物分析和体内内源性物 质的分析及成分复杂的中药分析尤其重要。 HPLC的分离 功能还广泛用于药物的纯化和制备，如用制备色谱分离
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A4 AIS
C1/CIS C2 /CIS C3 /CIS C4 /CIS
浓度比: 目标 / 内标
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内标法
试样配制：准确称取一定量的试样Wi，加入一定量内
标物WS 计算式：
wi fi Ai
ws f s As
定量分析的基本要求
❖ 需要有纯物质作标准 ❖ 被定量组分峰要与其它峰达到基线分离 ❖ 符合定性参数要求 ❖ 选择合适的定量方法
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4
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定量分析基本公式
在某些条件限定下，被测组分的浓度与检测器的 响应值成正比的关系。（蒸发光散射检测器浓度 与峰面积不成线性，分别取对数后成线性 ）
wi fi Ai wi wi fi ' Ai '
fi fi '
wi wi Ai '
wi
Ai
wi
wi Ai ' 1
Ai
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标准加入法特点
1. 不需另外选择内标物 2. 进样量不必十分准确，操作简单 3. 两次色谱条件完全相同以保证校
第三部分 定量基础知识
1
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定性方法
❖色谱峰的定性鉴别 通过保留值(通常是保留时间)进行定性 需要指定保留时间误差范围（时间窗、时间带）
❖在相同的分析条件下 保留时间相同并不肯定是同样的组份 保留时间不同肯定不是同样的组份
测物的浓度确定内标物的添加量
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标准加入法
当难以选择合适的内标物或无空白样品时， 以欲测组分的纯物质为内标物加入到待测样品中 ，然后在相同的色谱条件下，测定加入欲测组分 前后的峰面积，从而计算待测组分的含量。
Ci= fi Ai Ci= fi Hi
Ci： 组分浓度, fi : 响应因子，与组分的物理化学性质和检测器的性质有关 Ai： 组分响应面积 Hi： 组分响应高度
实际修饰公式： Y=aX+b
5
5
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常用定量方法
2
2
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定性确证
仅仅通过保留时间并不能完全确证该物质
❖通过加入标准物确认 ❖通过改变色谱条件确认 ❖光谱和质谱信息也可以作为进一步确证手段 ❖其他仪器方法确证
3
3
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正因子完全相等
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定量计算常用术语
❖ Integration parameters ：积分参数，规定计算出峰面积的方法。
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选择内标物应注意
1. 理化性质与待测物相近 2. 在样品中不存在且不与样品中组分发生化学反应 3. 内标物与待测物响应相近 4. 与待测物有良好的分离，但又不能相距太远 5. 与待测物的峰面积比为0.7-1.3最好，因此要根据待
wi
fi Ai f s As
ws
fi '
Ai As
ws
fi’为待测组分 (i) 对内标物 (s) 的质量相对校正因子
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内标法特点
多用在国际标准和规定比较严格的方法中
特点： 1.进样量不严格要求 2.只对所测组分作校正 3.必须在样品中加一内标组分 4.操作较为繁琐 5.选择内标物比较困难
3. 要求所有组分都流出并且被检测到
4. 要求所有组分的响应因子相当
7
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浓度 C1 C2 C3 C4
8
外标法
面积 A1
A2
峰面积
A4 A3
标准曲线
A2 A3
A1
A4
C1
C2
C3
C4
浓度
8
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外标法
Ci fi Ai
fi——i组分工作曲线的斜率
是实验室最常用的定量方法，定量结果准确
特点： 1. 不需所有峰都流出或被检测到，只对目标组分作校正 2. 需要标准样品 3. 进样量必须准确 4. 仪器必须有良好的稳定性
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❖ 面积归一化 ❖ 外标法 ❖ 内标法 ❖ 标准加入法
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面积归一化法
不能作为准确定量的方法，仅在特定情况下使用
公式：
特点：
Ci%
Ai
Ai
100%
1. 无需做校正，简便，快速
2. 进样量不严格要求
Hale Waihona Puke Shimadzu International Trading (Shanghai) Co. Limited
浓度 目标 内标
C1 CIS C2 CIS
C3 CIS
C4 CIS
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内标法
面积 A1 AIS
A2 AIS
面积比: 目标/ 内标
A4 /AIS A3 /AIS
标准曲线
A3 AIS
A2 /AIS A1/AIS
单点校正法
当被测试样中各组分浓度变化范围不大时，可不 必绘制多点的标准曲线，而用单点校正法（比较法）。 配制一个和被测组分含量接近的标准溶液，定量进样， 根据被测组分和外标组分峰面积比或峰高比计算被测 组分的含量。
wi Ai ws As
当方法存在较大的系统误差, 单点校正法的误差较大.
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