细菌的革兰氏染色
细菌的革兰氏染色法
细菌的革兰氏染色法细菌的革兰氏染色法实验二细菌的革兰氏染色法学习细菌的革兰氏染色原理和方法。
单染色法：只能观察微生物的大小、形状、和细胞排列状况，但不能鉴别微生物以及它的特殊构造等。
复染色法：用两种或两种以上染色液进行染色，有协助鉴别微生物的作用，故也称鉴别染色法。
常用的有：革兰氏染色法、抗酸染色法、芽孢染色法、鞭毛染色法等。
革兰氏染色机制：由于G－肽聚糖层较薄，交联度低，含较多脂质，故用乙醇等有机溶剂脱色时融解了类脂质，增加了细胞的通透性，使初染的结晶紫和碘的复合物易于渗出，经沙黄复染呈红色。
而G＋细胞壁结构致密，用脱色剂处理后，肽聚糖层孔径缩小，通透性降低，故细菌仍保留初染时的紫色。
大肠杆菌、金黄色葡萄球菌（24h培养物）、革兰氏染色液一套3. 初染：在做好的涂面上滴加草酸铵结晶紫染液，染1分钟，倾去染液，流水冲洗至无紫色。
4. 媒染：先用新配的路哥氏碘液冲去残水，而后用其覆盖涂面1分钟，后水洗。
5. 脱色：除去残水后，滴加95%酒精进行脱色约15-20秒，后立即用流水冲洗。
6. 复染：滴加番红染色液，染3－5分钟，水洗后用吸水纸吸干。
7. 镜检：观察染色结果并绘图。
记录所观察到的两种菌革兰氏染色颜色的差别，并绘图。
如图所示，被染为紫色的部分即为金黄色葡萄球菌，红色部分即为大肠杆菌。
六、问题与讨论要得到正确的革兰氏染色结果必须注意哪些操作？哪一步是关键？Why?按照操作顺序来看1、首先，必须强调的是实验过程中全程的无菌操作：玻片的消毒、接种环的杀菌以及实验所用材料试管的无菌使用；2、其次，是金黄色葡萄球菌以及大肠杆菌的刮取过程中，它们的量一定要适中，以免过多影响后期观察结果；3、再者，涂片操作结束后，通过酒精灯的烘烤将细菌固定，要注意控制烘干的程度，防止细菌全被烧死；4、接下来的染色过程中，注意各染色剂染色的时间长度，尤其是95%乙醇脱色的时长，18秒为适宜时长；5、最后，就是吸干水分，注意油镜的使用，先在低倍镜下找视野，再转成高倍镜、油镜。
细菌革兰氏染色
05
革兰氏染色的注意事项与局限性
染色过程中的注意事项
染色时间
染色时间对染色结果的影响较大，过短或过长的 染色时间都可能导致染色效果不佳。
涂片厚度
涂片过厚或过薄都会影响染色效果，需保持适当 的涂片厚度。
脱色程度
脱色时间与脱色剂的浓度需严格控制，否则会影 响染色结果。
染色液的新旧
染色液使用一段时间后，颜色会变淡，影响染色 效果，需定期更换。
细菌革兰氏染色
目
CONTENCT
录
• 革兰氏染色的历史与发展 • 革兰氏染色的基本原理 • 革兰氏染色的操作步骤 • 革兰氏染色的结果分析 • 革兰氏染色的注意事项与局限性
01
革兰氏染色的历史与发展
革兰氏染色技术的起源
1884年，丹麦医生革兰发明了革兰氏染色法，用于 区分细菌的形态和性质。
革兰氏染色法最初用于鉴别肠道细菌，如大肠杆菌 和志贺氏菌。
革兰氏阳性菌的细胞壁较厚，经过染色后菌体形态饱满，不易被 渗透，呈现出比较清晰的紫色或蓝紫色。
革兰氏阴性菌的染色结果
红色或淡红色
革兰氏阴性菌的细胞壁较薄，经过革兰氏染色后呈现红色或淡红色，这是由于 其细胞壁较薄，容易渗透染色液，与碘液结合形成复合物，呈现出红色或淡红 色。
菌体形态透亮
由于革兰氏阴性菌的细胞壁较薄，经过染色后菌体形态透亮，容易观察其形态 特征。
03
革兰氏染色的操作步骤
涂片
取洁净的载玻片，在中央涂一薄层琼 脂，用接种环取少量待检细菌涂布均 匀，然后迅速将涂有细菌的载玻片置 于酒精灯火焰上加热，使琼脂凝固。
冷却后将玻片翻转，用铅笔在背面画 一横线，再将玻片正面朝上放置于显 微镜载物台上。
固定
用夹子夹住载玻片一端，用火焰加热固定液（甲醇或乙醇）直至冒蒸汽，然后将 载玻片放入固定液中，持续加热1-2分钟，使细菌被固定在载玻片上。
实验二 细菌的革兰氏染色法
实验二细菌的革兰氏染色法一、目的要求1.掌握革兰氏染色的方法及原理。
2.进一步熟悉显微镜的使用二、基本原理1. 革兰氏染色的意义：革兰氏染色的反应是细菌分类和鉴定的重要性状。
它是1884年由丹麦医生Gram 创立的。
革兰氏染色法（Gram stain）不仅能观察到细菌的形态特征而且还可将所有细菌区分为两大类：染色反应呈蓝紫色的称为革兰氏阳性细菌，用G+表示；染色反应呈红色（复染颜色）的称为革兰氏染色阴性细菌，用G-表示。
2. 革兰氏染色的原理：细菌对于革兰氏染色的不同反应，是由于它们细胞壁的成分和结构不同造成的。
革兰氏阳性细菌的细胞壁主要是肽聚糖形成的网状结构组成的，在染色过程中，当用乙醇处理时，由于脱水而引起网状结构中的孔径变小，通透性降低，使结晶紫－碘复合物被保留在细胞内而不易着色，因此，呈现蓝紫色；革兰氏阴性细菌的细胞壁中肽聚糖含量低，而脂类物质含量高，当用乙醇处理时，脂类物质溶解，细胞壁的通透性增加，使结晶紫－碘复合物易被乙醇抽出而脱色，然后又被染上了复染液（番红）的颜色，因此呈现红色。
三、器材大肠杆菌，金黄色葡萄球菌12～20h斜面培养物；革兰氏染液，载玻片，显微镜等。
四、操作步骤1. 涂片取两块载玻片，各滴一小滴蒸馏水于玻片中央，用接种环以无菌操作分别从培养14～16h的枯草芽孢杆菌和培养24h的大肠杆菌的斜面上挑取少量菌苔于水滴中，混匀并涂成薄膜。
载玻片要洁净无油迹；滴蒸馏水和取菌不宜过多；涂片要均匀，不宜过厚。
2. 干燥室温自然干燥。
3. 固定固定时通过火焰2～3次即可。
此过程称热固定，其目的是使细胞质凝固，以固定细胞形态，并使之牢固附着在载玻片上。
热固定温度不易过高，以载玻片背面不烫手为宜，否则会改变甚至破坏细胞形态。
4. 初染加草酸铵结晶紫一滴，约1～2min，水洗。
5. 媒染滴加碘液冲去残水，并覆盖约1min，水洗。
6. 脱色将载玻片上面的水甩净，并衬以白背景，用95％酒精滴洗至流出酒精刚刚不出现蓝色时为止，约20～30s，立即用水冲净酒精。
细菌的革兰氏染色
2009年8月 一厂品控
目的要求
•学习并掌握革兰氏染色的方法
实验材料
•菌种：枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、金 黄色葡萄球菌。 •染料：草酸铵结晶紫液、革兰氏碘 液、95%乙醇、番红液（沙皇复染液） •其他：显微镜、载玻片、接种环、酒 精灯、无菌生理盐水、香柏油、二甲 苯等。
基本原理
•革兰氏染色法是细菌学中广泛使用的一 种鉴别染色法。 •1884年由丹麦医师Gram创立。
关键点
•严格掌握乙醇脱色程度，如脱色过度， 则阳性菌被误染为阴性菌；而脱色不够 时，阴性菌被误染为阳性菌。
•菌龄也影响染色结果，如阳性菌培养时 间很长，或已死亡及部分自行溶解了， 都常呈阴性反应
大肠杆菌（G-）
枯草芽孢杆菌（G+）
金黄色葡萄球菌与大肠杆菌
实验思考题
•大肠杆菌和枯草芽孢杆菌染色后，是G-还是 G+？ •为什么革兰氏染色所用细菌的菌龄有所要求？ •你的实验结果与与培训中所述是否一致？如 果不一致，试分析原因。
革兰氏阴性菌细胞壁脂类物质含量 高，肽聚糖含量较低，乙醇溶解了 脂类物质，使细胞壁通透性增加， 结晶紫——碘复合物易被抽出，于 是被脱色。
•阳性菌菌体等电点较阴性菌低，在相同 pH条件下进行染色，阳性菌吸附碱性染料 较多，因此不易脱去，阴性菌则相反。所 以染色时的条件要严格控制。
方法与步骤
•涂片→干燥→固定→草酸铵结晶紫染色 （1min）→水洗→路哥氏碘液媒染 （1min）→水洗→95%乙醇脱色（30s） →水洗→番红复染（1min）→水洗→干 燥→镜检。
实验内容
•对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡 萄球菌分别进行革兰氏染色。 •对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌混合涂片进 行革兰氏染色。
细菌革兰氏染色原理
细菌革兰氏染色原理细菌革兰氏染色是一种常用的细菌分类染色方法，它是由丹麦细菌学家克里斯蒂安·格拉姆（Christian Gram）于1884年首次提出的。
革兰氏染色的原理是利用细菌细胞壁的化学成分差异，将细菌分为革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌两大类。
革兰氏染色是细菌学中的基础实验技术，对于细菌的鉴定和分类具有重要意义。
革兰氏染色的原理基于细菌细胞壁的特点。
细菌细胞壁是细菌的外部结构，它包裹在细菌细胞膜的外侧，起着支撑和保护细菌的作用。
细菌细胞壁的主要成分是肽聚糖和肽聚肌醇，革兰氏阳性菌的细胞壁含有较多的肽聚糖和肽聚肌醇，而革兰氏阴性菌的细胞壁则含有较少的肽聚糖和肽聚肌醇，但含有脂多糖层。
这种化学成分的差异使得革兰氏染色可以区分不同类型的细菌。
革兰氏染色的操作步骤相对简单，主要包括以下几个步骤，首先，将待染色的细菌涂抹在玻片上并固定；然后，用紫色的革兰氏染色液涂抹在细菌上，使其染色；接着，用碘液固定染色；最后，用酒精脱色，再用脱色后的细菌用洋红染色。
经过这些步骤，革兰氏阳性菌会呈现紫色，而革兰氏阴性菌则会呈现红色。
革兰氏染色的原理和操作方法虽然简单，但却具有重要的应用价值。
通过革兰氏染色，我们可以快速、准确地区分细菌的类型，为细菌的鉴定和分类提供了重要的依据。
在临床诊断中，革兰氏染色常常被用于鉴定引起感染的细菌，为临床治疗提供重要参考。
此外，在食品卫生、环境监测等领域，革兰氏染色也被广泛应用。
总的来说，革兰氏染色是一种简单而有效的细菌分类染色方法，它的原理基于细菌细胞壁的化学成分差异，通过染色的方式将细菌分为革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌。
革兰氏染色在细菌学研究和临床诊断中具有重要的应用价值，对于细菌的鉴定和分类起着至关重要的作用。
通过深入了解革兰氏染色的原理和操作方法，我们可以更好地理解细菌的特性，为相关领域的研究和实践提供有力支持。
实验 细菌的革兰氏染色
实验八、细菌革兰氏染色实验一、实验目的和内容目的：1.熟悉油镜的使用与保养。
2.掌握细菌革兰氏染色法的原理及实验操作。
3.了解革兰氏染色实验在细菌分类鉴定上的重要性。
内容：1.学习显微镜（油镜）的使用和保养。
2.学习细菌革兰氏染色实验。
3.用油镜观察枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌染色装片并判断其结果。
二、实验原理革兰氏染色法是1884年由丹麦病理学家C．Gram所创立的。
革兰氏染色法可将所有的细菌区分为革兰氏阳性菌(G+)和革兰氏阴性菌(G-)两大类，是细菌学上最常用的鉴别性染色法。
染色前必须先固定细菌，其目的有二：一是杀死细菌，使细胞质凝固，菌体粘附于玻片上；二是增加其对染料的亲和力。
常用的有加热和化学固定两种方法。
固定时应尽量维持细胞原有形态，防止细胞膨胀或收缩。
三、实验材料和用具（1）菌种：培养12-16h的苏云金杆菌（Bacillus thuringiensis）或者枯草杆菌（Bacillus subtilis），培养24小时的青枯假单胞杆菌。
（2）染色液和试剂：吕氏碱性美蓝染液(或草酸铵结晶紫染液)，石炭酸复红染液、结晶紫、鲁哥尔碘液、95 %酒精、复染剂（蕃红）、二甲苯、香柏油。
（3）器材：废液缸、洗瓶、载玻片、接种杯、酒精灯、打火机、记号笔、擦镜纸、显微镜。
四、实验步骤：①涂片：取干净载玻片一块，在载玻片的加一滴蒸馏水，按无菌操作法取菌涂片，做成菌液。
干燥（可过火3—4次）制成薄的涂面，注意取菌不要太多，过火速度要快。
②初染：在做好的涂面上滴加草酸铵结晶紫染液，染1 min，倾去染液，流水冲洗至无色。
③媒染：先用新配的碘液冲去残水，而后用其覆盖涂面1 min，后水洗。
④脱色：除去残水后，滴加95 %酒精进行脱色约15－20 sec，后立即用流水冲洗。
⑤复染：滴加复染剂——番红染色液，染3－5 min，水洗后用吸水纸吸干。
⑥镜检：先低倍观察，再高倍观察，并找出适当的视野后，将高倍镜转出，在涂片上加香柏油一滴，将油镜头浸入油滴中仔细调焦观察染色结果并绘图。
实验二细菌革兰氏染色
（一）革兰氏染色 涂片—风干—固定—初染—水洗—媒染—水洗—
脱色—水洗—复染—水洗—干燥—镜检
菌悬液
涂片
干燥
滴加无 菌水
取菌苔
涂片
固定
Smear preparation
Heat fixing
Staining
crystal violet stain
wash with water
Counterstain with Safranin
3、用乙醇或丙酮冲洗进行脱色。在经历脱色后 仍将结晶紫保留在细胞内的为革兰氏阳性细 菌，而革兰氏阴性细菌的结晶紫被洗掉，细 胞呈无色。
4、用一种与结晶紫具有不同颜色的碱性染料对 涂片进行复染。例如沙黄，它使原来无色的 革兰氏阴性细菌最后呈现桃红到红色，而革 兰氏阳性细菌继续保持深紫色
成分
肽聚糖 磷壁酸 类脂质 蛋白质源自占细胞壁干重的%革兰氏阳性细菌
革兰氏阴性细菌
含量很高（50~90）
含量很低（~10）
含量较高（＜50）
无
一般无（＜2）
含量较高（~20）
无
含量较高
三、实验材料
1、菌种：大肠杆菌（E.C）、枯草杆菌（B.S） 2、染料：结晶紫、复红、碘液等 3、材料：95%酒精等 4、标本片：芽孢、荚膜、孢子丝
四、实验方法
注意事项：
（1）在涂片时不可过厚，否则在染色脱色时，都不易均匀， 固定时，不可过热，以载玻片不烫手为宜。
（2）严格掌握脱色程度，是革兰氏染色的关键步骤。如脱色 时间太长，阳性菌会误为革兰氏阴性菌，时间不足，革 兰氏阴性菌会误为革兰氏阳性菌。
（3）在镜检时，以分散开的菌体的革兰氏染色反应为准。 （4）设定阴性和阳性对照，确保实验的可靠性。
实验二-细菌的革兰氏染色
实验二-细菌的革兰氏染色摘要在本实验中，我们学习了细菌的革兰氏染色方法，它是一种常用的细菌分类技术。
通过革兰氏染色，可以将细菌分为革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌。
在实验中，我们将细菌样本进行了革兰氏染色，并观察了染色后不同类型菌落的变化。
背景细菌的革兰氏染色是细菌学中常用的分类技术，它可以将细菌分为革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌。
革兰氏染色的原理是利用不同类型菌壁对染色剂的染色特性。
革兰氏阳性菌具有较厚的层状菌壁，菌壁数量较多且含有高量的肽聚糖和穿孔蛋白，故在革兰氏染色中易被靛基紫染色，即为紫色。
而革兰氏阴性菌菌壁较少，含有脂质多糖结构，靛基紫容易被脱色，失去颜色，再染上对比色——碘液后，在有机溶剂乙醇中去除结晶紫染料，洗净后再用第二种常规染色溶液（抗色素溶液）染色，为粉红色。
实验方法和步骤1.将郑重筛选发酵技术及纯化分离后的细菌分别进行涂片。
2.在涂片上滴上靛基紫染剂，静置1分钟，然后用水冲洗。
3.在涂片上滴上碘液，静置1分钟，然后再次用水冲洗。
4.滴上有机溶剂乙醇将片洗去结晶紫染料，然后再滴抗色素溶液在片上静置1~2分钟。
5.用水冲洗干净，然后把涂片放到显微镜下观察即可。
结果与分析在此次实验中，我们观察到了不同类型菌落的变化。
在涂片上的细菌，经过靛基紫的染色后，革兰氏阳性菌的细胞呈现出紫色颜色，而革兰氏阴性菌的细胞颜色并没有明显变化。
在加上碘液后，革兰氏阴性菌的细胞依旧没有变化，而革兰氏阳性菌的细胞则变得更加明显，呈现更深的紫色。
在使用有机溶剂乙醇将片洗去结晶紫染料后，再加上抗色素溶液，革兰氏阳性菌的细胞会继续呈现紫色，而革兰氏阴性菌的细胞则变成粉红色。
据此可知，我们通过革兰氏染色的方法，有效地将细菌分为革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌。
此外，我们还观察到不同类型菌落的变化，这对于后续实验中判断细菌种类及其特性非常有帮助。
细菌的革兰氏染色是一种常用的细菌分类技术，在本实验中我们成功地实现了对不同细菌样本的革兰氏染色及观察。
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五、注意事项
• 1.革兰氏染色成败的关键是酒精脱色。如脱色过
度，革兰氏阳性菌也可被脱色而染成阴性菌；如 脱色时间过短，革兰氏阴性菌也会被染成革兰氏 阳性菌。脱色时间的长短还受涂片厚薄及乙醇用 量多少等因素的影响，难以严格规定。 • 2.染色过程中勿使染色液干涸。用水冲洗后（冲 反面），应吸去玻片上的残水，以免染色液被稀 释而影响染色效果。
N-乙酰葡萄糖胺 N-乙酰胞壁酸 肽聚糖（15-50层） β -1,4糖苷键
四肽链 五肽桥
细胞膜（双层脂质 蛋白嵌镶） 脂质
蛋白质
革兰阴性菌细胞壁的化学组成
脂蛋白 外膜 脂质双层 脂多糖 性菌与革兰阴性菌细胞壁
区别要点 革兰阳性菌 革兰阴性菌
肽聚糖组成 聚糖骨架、四肽侧链、五肽交联桥 聚糖骨架、四肽侧 链 肽聚糖层数 肽聚糖含量 强度 磷壁酸 可多达50层 占细胞壁干重50%-80% 较坚韧，三维立体结构 有 仅1-2层 占细胞壁干重5%-10% 较疏松，二维平面结构 无
结晶紫
1
2
碘液
酒精 复红
3
？
4
三、实验器材
• 1、活材料：培养24小时的大肠杆菌和葡萄 球菌。 • 2、染色液和试剂：结晶紫、碘液、95%酒精、 石炭酸复红 、蒸馏水、乙醚-乙醇混合液、 香柏油。 • 3、器材：废液缸、洗瓶、载玻片、接种杯、 酒精灯、擦镜纸、显微镜。
四、实验方法：
（1）涂片：取干净载玻片一块，在载玻片中 央加一滴蒸馏水，按无菌操作法取大肠杆菌 涂片，做成浓菌液，注意取菌不要太多。 • （2）晾干：让涂片自然晾干或者在酒精灯火 焰上方文火烘干。 • （3）固定：手执玻片一端，让菌膜朝上，通 过火焰2-3次固定（以不烫手为宜）。
革兰氏阳性杆菌
革兰氏阴性杆菌
（10)实验完毕后的处理：
• ①将浸过油的镜头按下述方法擦拭干净， • a.先用擦镜纸将油镜头上的油擦去。 • b.用擦镜纸沾少许乙醚-乙醇混合液（二甲 苯）将镜头擦2-3次。 • c.再用干净的擦镜纸将镜头擦2-3次。注意 擦镜头时向一个方向擦拭。将显微镜小心 轻拿，按号放入显微镜柜中。 • ②观察后的染色玻片用废纸将香柏油擦干 净，放入回收容器内。
•
•
（4）结晶紫染色：将玻片置于废液缸玻片搁 架上，加适量（以盖满细菌涂面）的结晶 紫染色液染色1分钟；水洗：倾去染色液， 用水小心地冲洗。 （5）媒染：碘液，媒染1min；水洗：用水 洗去碘液。
• （6）脱色：将玻片倾斜，连续滴加95%乙醇
脱色20—25s至流出液无色，立即水洗。 • （7）复染：滴加复红复染3-5min；水洗： 用水洗去涂片上的复红染色液。 • （8）晾干：将染好的涂片用吸水纸吸干。 • （9）镜检：镜检时先用低倍，再用高倍， 最后用油镜观察，并判断菌体的革兰氏染 色反应性。
细菌的革兰氏染色
• 一、目的： 学习细菌的革兰氏染色法。
二、原 理
• 革兰氏染色法：是1884年由丹麦病理学家所创立的。革兰 氏染色法可将所有的细菌区分为革兰氏阳性菌（G+）和革 兰氏阴性菌（G—）两大类，该染色法所以能将细菌分为G+ 菌和G—菌，是由这两类菌的细胞壁结构和成分的不同所 决定的。
革兰阳性菌细胞壁的化学组成
外膜
青霉素、溶菌酶
无
敏感
有
不敏感
• G+菌细胞壁较厚，肽聚糖含量较高，网格结构紧密， 含脂量低，当被酒精脱色时，引起了细胞壁肽聚糖层 网状结构的孔径缩小以至关闭，从而阻止了不溶性结 晶紫-碘复合物的逸出，还是原来的颜色；G¯细菌的 细胞壁肽聚糖层较薄，含量较少，而脂类含量高，当 酒精脱色时，脂类物质溶解，细胞壁透性增大，结晶 紫-碘复合物也随之被抽提出来，故G¯细菌细菌菌体 呈复染液的红色。