BV2小胶质细胞经典激活及替代激活的诱导及鉴定
BV2小胶质细胞经典激活及替代激活的诱导及鉴定
BV2小胶质细胞经典激活及替代激活的诱导及鉴定发表时间：2016-06-01T16:50:22.310Z 来源：《河南中医》2015年8月作者：吴非1,2 罗涛2 郭远瑾2 黎红华1 梅元武2[导读] 小胶质细胞是中枢神经系统内重要的固有免疫细胞，也是介导免疫反应的主要效应细胞。
吴非1,2 罗涛2 郭远瑾2 黎红华1 梅元武2（1.广州军区武汉总医院神经内科湖北武汉 430070）（2.华中科技大学协和医院神经内科湖北武汉 430022）【摘要】目的：观察BV2小胶质细胞经典激活及替代激活后代谢分子的变化，判断鉴别M1及M2极化型小胶质细胞的方法。
方法：小胶质细胞以100ng/ml的LPS及20ng/mL的IL-4分别经典激活及替代激活24小时，以ELISA方法检测IL-12、IL-10、TNF-α的分泌量，以实时荧光定量聚合酶链反应检测iNOS、Arg-1、IL-10、IL-12的mRNA表达，以流式细胞术检测细胞膜MMr蛋白表达。
结果：小胶质细胞被LPS 经典激活后呈M1型极化，IL-12、TNF-α分泌量、iNOSmRNA、IL-12mRNA表达量明显升高，与生理对照组比较有统计学差异（p<0.05)。
小胶质细胞被IL-4替代激活后呈M2极化， IL-10分泌量、Arg-1mRNA及IL-10mRNA表达量显著升高，流式细胞术检测MMr蛋白荧光强度较生理对照组显著上升（p<0.05)。
结论：小胶质细胞的能够被LPS经典激活呈M1型极化，IL-4替代激活呈M2型极化，M1/M2极化状态的小胶质细胞能够通过检测炎性相关因子、精氨酸代谢分子及细胞膜特异性蛋白三个方面得到鉴别。
【关键词】小胶质细胞；经典激活；替代激活；M1/M2型极化；脂多糖；白介素-4【中图分类号】R741 【文献标识码】B 【文章编号】1003-5028（2015）8-0651-02The Identification of Classical or Alternative Activation on BV2 MicrogliaWu Fei1,2,Luo Tao2,GuoYuan-jing2,Li Hong-Hua1, Mei Yuan-wu2（1 Department of neurology, Wuhan General Hospital of Guangzhou Military 430070）（2.Department of neurology, Wuhan Union Hospital, HuaZhong University of Science and Technology 430022)【Abstract】Objective：To observe the changes in metabolic molecule of BV2 microglia after it is classical or alternative activated, and judge the methods to identify the M1 or M2 -type polarized microglia cells. Methods：BV2 microglia cells were classical activated by LPS in the concentration of 100ng/ml and alternative activated by IL-4 in the concentration of 20ng/mL for 24 hours, then ELISA was used to measure the levels of IL-12, IL-10, TNF-α , and Real-time PCR was used to detect the mRNA expression of iNOS,Arg-1, IL-10 and IL-12. Flow cytometry(FCM) was used to measure the levels of MMr membrane protein . Results：Microglia presented M1-type polarization state after it were classical activated, the secretion of IL-12 and TNF-α, the expression of iNOS mRNA and IL-12mRNA were significantly increased , and the difference were significant compare with that of in normal control group（P<0.05）. Microglia presented M2-type polarization state after it were alternative activated, and the secretion of IL-10, the expression of Arg-1mRNA and IL-10mRNA were significantly increased, and the difference were significant compared with that of in normal control group（P<0.05）. The levels of MMr were also increased significantly measured by Flow cytometry(FCM). Conclusion： BV2 microglia could present M1-type polarization state after it were classical activated, M2-type polarization state after alternative activated. The two type polarization could be identified detected from three aspects including inflammatory factors , arginine metabolic molecular and specific cell membrane proteins. 【Keywords】microglia，classical activation，alternative activation，M1/M2 type polarization， lipopolysaccharide，interleukin-4 小胶质细胞是中枢神经系统内重要的固有免疫细胞，也是介导免疫反应的主要效应细胞[1]。
小胶质细胞生物学特性及对神经元调控作用
小胶质细胞生物学特性及对神经元调控作用李杰;周军媚;田绍文【摘要】Microglia are resident immune cells within the brain parenchyma. In physiological conditions,microglia are highly dynamic, expressing multiple immune receptors and neurotransmitter receptors, tightly monitoring the microenvironment of central nervous system (CNS). Recent researches have revealed that these immune cells ac-tively modulate the functions of neurons,which potentially affecting neuronal activity and synaptic pruning,contrib-ute to synaptic plasticity and preventing neurotoxicity. The functional changes of microglia play an important role in the development,maturation and degeneration of the brain.%小胶质细胞是常驻脑实质内免疫细胞,在生理状态下是高度动态的,表达多种免疫受体与神经递质受体,严格监控着中枢神经系统(CNS)微环境.近来大量研究揭示这类免疫细胞具有积极地调控神经元作用,其潜在的影响了神经元发生、突触修剪,调节突触可塑性,阻止神经毒性.小胶质细胞功能性变化对CNS的发育、成熟及退化有重要作用.【期刊名称】《基础医学与临床》【年(卷),期】2018(038)004【总页数】5页(P563-567)【关键词】小胶质细胞;细胞生物学特性;神经元【作者】李杰;周军媚;田绍文【作者单位】南华大学药学与生命科学学院,湖南衡阳421001;南华大学神经科学研究所,湖南衡阳421001;南华大学药学与生命科学学院,湖南衡阳421001;南华大学神经科学研究所,湖南衡阳421001【正文语种】中文【中图分类】R338小胶质细胞是中枢神经系统(central nervous system, CNS)内数量最多的单核巨噬细胞。
A151对糖氧剥夺和脂多糖诱导的BV-2细胞极化的影响
A151对糖氧剥夺和脂多糖诱导的 BV- 2 细 胞 极 化 的 影 响
2021年 3 月 Mar. 2021
•基础医学•
闵 傲 雪 ，朱 天 瑞 ，张 凤 ，王 冉 冉 ，李 晓 红
(山东大学附属济南市中心医院神经内科，山 东 济 南 250013)
摘 要 ：0 的 探 讨 抑 制 性 寡 核 苷 酸 A 1 5 1 治 疗 对 糖 氧 剥 夺 （OGD)和 脂 多 糖 （LPS)诱 导 的 小 胶 质 细 胞 M 1/M2 极 化 的 影 响 。 方 法 倒 置 显 微 镜 下 观 察 A 1 5 1 治 疗 对 BV- 2 细 胞 形 态 改 变 的 影 响 。ELISA检 测 细 胞 上 清 液 中 细 胞 因 子 含量:，RT-P C R 检 测 细 胞 因 子 转 录 水 平 。 Western blotting检 测 小 胶 质 细 胞 M l 表 型 、M2 表 型 表 面 标 志 物 的 表 达 ， 检 测 NLRP3 炎 症 小 体 的 表 达 。 免 疫 荧 光 检 测 小 肢 质 细 胞 M l 表 型 、M2 表 型 表 面 标 志 物 的 表 达 。 结果 A 1 5 1 可 抑 制 L P S 和 O G D 共 同 刺 激 引 起 的 BV- 2 细 胞 形 态 变 化 < A 1 5 1 能 下 调 小 胶 质 细 胞 M l 表 型 表 面 标 志 物 和 高 表 达 的 细 胞 因 子 诱 导 型一 氧 化氮 合 酶（iNOS) 、CD16/CD3 2 、肿瘤坏死因子-a (TNF-a ) 、白介素-丨3(扎-旧）（尸均<0.00丨），下 调 TNF-a mRNA、IL-lp m RNA 的 转 录 水平 （P 均<0.00丨）。上 调 小 股 质 细 胞 M2 表 型 表 面 标 志 物 和 高 表 达 的 细 胞 因
利莫宁在LPS刺激的BV2微胶质细胞炎症过程中作用研究
利莫宁在 LPS刺激的 BV2微胶质细胞炎症过程中作用研究摘要：鉴于近些年来神经性退行性疾病的病发率越来越高的现象，医学界对该类疾病的研究也在不断深入。
从医学角度上来看，炎症是一种保护反应，以确保稳态，它针对有毒物质，对抗病原体和防止组织损伤从而有利于组织修复。
相反，不受控制的炎症会导致过度的细胞和组织损伤，通过激活细胞死亡来破坏正常组织。
线粒体过量产生ROS和过度产生细胞因子通常被认为是脑损伤、炎症和退行性疾病的发病机制。
导致对患者正常组织带来负面影响。
从现行研究结果来看，利莫宁以其优异的治疗价值广受人们的关注，其药理价值相对比较复杂，本文研究即针对该药物对患者的作用机理进行深入研究，为神经性退行性疾病的治疗提供参考。
关键词：神经性退行性疾病；细胞脑组织；药理价值；利莫宁引言中枢神经系统(CNS)包括神经元、内皮细胞、星形胶质细胞和胶质细胞。
活化的胶质细胞，即小胶质细胞和星形胶质细胞通过激活炎症途径在神经变性的发病机制中起着至关重要的作用。
胶质瘤是一种以星形细胞增生、细胞体肥大为特征的炎症状态。
当用脂多糖(LPS)等毒素刺激时，胶质细胞产生白介素(IL)1β和肿瘤坏死因子TNF-α，导致炎症发病。
在创伤、阿尔茨海默病(AD)、帕金森病(PD)、亨廷顿病(HD)等疾病中，活化的小胶质细胞产生炎症介质，如环加氧酶(COX-2)/前列腺素(PGS)、iNOS/一氧化氮(NO)或细胞因子以及神经毒性物质，介导脑组织损伤。
此外，越来越多的证据还表明，炎症促进不同的脑疾病，显然通过激活胶质细胞和炎症途径杀死神经元。
因此，本研究的重点是旨在激活胶质细胞和相关炎症途径和/或介质的策略或方法，可能有助于临床管理炎症相关神经退行性疾病[1]。
一、研究整体概述柠檬苦素是一种柠檬酸盐(柠檬酸盐D-环内酯和柠檬酸二-δ内酯)，存在于柑橘植物的叶片、果实和根茎中，化学性质为呋喃内酯。
据报道，大约有300个柠檬素类似物已从自然资源中分离出来。
大麻素2型受体拮抗剂对激活态BV2小胶质细胞的免疫调节作用
大麻素2型受体拮抗剂对激活态BV2小胶质细胞的免疫调节作用李琳;楼之茵;程洁;赵忠新【摘要】目的观察大麻素2型受体(cannabinoid 2 receptor,CB2R)拮抗剂对BV2小胶质细胞免疫调节功能的影响.方法使用适量浓度的IFN-γ刺激激活BV2小胶质细胞,建立模拟EAE炎性环境的细胞模型,比较静息态BV2细胞组、激活态BV2细胞组和大麻素2型受体拮抗剂SR144528A(SR2)干预组CB2R mRNA和蛋白的表达情况,用ELISA方法检测细胞因子和趋化因子的浓度,MTT法检测细胞增殖率.结果 IFN-γ激活的BV2小胶质细胞CB2RmRNA和蛋白的表达均高于静息组(P ＜0.05);使用SR2干预激活的BV2小胶质细胞,可降低其CB2R mRNA和蛋白的表达(P＜0.05);SR2可显著上调激活态BV2细胞致炎因子IFN-y、IL-17、IL-6和TNF-α的水平,促进BV2小胶质细胞增殖和NO的释放(P＜0.05),同时显著下调IL-4和MCP-1的浓度,对IL-1β、IL-10、CX3CL1无调节作用.结论 CB2R参与了小胶质细胞介导的炎症反应,CB2R在调节Th1/Th17/Th2细胞因子网络平衡中发挥了一定的作用.【期刊名称】《同济大学学报（医学版）》【年(卷),期】2016(037)002【总页数】6页(P14-18,23)【关键词】大麻素2型受体;小胶质细胞;细胞因子;趋化因子【作者】李琳;楼之茵;程洁;赵忠新【作者单位】上海交通大学医学院附属新华医院神经内科,上海200092;上海交通大学医学院附属新华医院神经内科,上海200092;上海交通大学医学院附属新华医院神经内科,上海200092;第二军医大学附属长征医院神经内科,上海200003【正文语种】中文【中图分类】R744.5小胶质细胞是中枢神经系统内最主要的炎症效应细胞，在神经免疫性疾病的发生发展中起重要作用。
Dectin-1Syk信号通路介导脂多糖诱导的BV2细胞中的炎症反应
山西医科大学学报，202-年-月，第52卷第(期-71-Dectin-1/Syk信号通路介导脂多糖诱导的BV2细胞中的炎症反应程林3,可红"(山东省立第三医院急诊科，济南254000；5山东第一医科大学第三附属医院神经内一科；通讯作者, E-mPR1508430456@)摘要：目的探讨脂多糖(LPS)诱导BV5细胞神经炎症反应中树突状细胞相关C型凝集素-(dendrXW cell-associawd Cdype hctiuO,DectiuO)及其下游脾酪氨酸激酶(sphen tynsiue kinase,Syk)信号通路发挥的作用。
方法采用LPS建立BV5细胞炎症模型。
将BV5细胞分为对照组、LPS3U组、LPS6U组、LPS17U组和LPS24U组，然后用免疫印迹法检测Declu-S,Syk 和P-Syk的表达，随后选出LPS最佳刺激时间。
根据LPS最佳刺激时间，再将BV5细胞分为空白对照组、对照+LAM组、对照+PIC组、LPS组、LPS+LAM组和LPS+PIC组;用免疫印迹法检测DecluF、pPyk、肿瘤坏死因子a(TNFp)和一氧化氮合酶(iNOS)的表达，观察抑制DechuO和Syk对促炎因子表达的影响。
结果与对照组相比丄PS诱导3,6,7,24U组DechuO, Syk和p-Syk蛋白在BV2细胞中的表达均增加，且在24U表达量最高(P<2.05)。
与空白对照组比较，对照+LAM组和对照+PIC组中各蛋白表达无明显差异(P>0.43)；与LPS组相比较丄PS+LAM组DecluF,p-Syk,TNFp和iNOS的蛋白表达明显下调(P<2.05)。
类似的，与LPS组比较,LPS+PIC组TNFp和iNOS的蛋白表达也明显下调(P<2.05)。
结论Dechu--/Syk信号通路可作为治疗神经炎症反应的潜在靶点。
关键词：脂多糖；炎症反应；树突状细胞相关C型凝集素-；脾酪氨酸激酶中图分类号：R363文献标志码：A文章编号：1057-6611(2521)51-0578-53DOI：S7.I3733/j.2x5.757-6611.2521.51.512Dectin-1/Syk sionaling triggert inOammation after libopolyspccharine stimulation in BV2cellsCHENG Liu1,KE Hong5*(Z)up£mdi£qf Emergency,Shandong Provincial Third Hospital,Jinan250000 ,China；2D epartment of Neurology,Third Afinated Hospital of Shandong FirsP Medical University；^CofesponCing authoo,E-mait■5508030056@) Abstraci:Objectiee To iuvestigate the nh of dendriXe cell-associated type C help-(DecUu-S)and its downstream spleen tynsiue kinase(Syk)signal pathway iu u euninUammato j response of BV5cells induced by lipopolysaccharihe(LPS):Methods The inUam-matorj model of BV5cells was induced by LPS.BV5cells were divided into control group,LPS3U group,LPS6U group,LPS7U group and LPS24U groupc The expression of Dechu-S,Syk and p-Syk was UeWcWp by Westers bhtlng,and the best stimulation time of LPS was senened.According to the opimai stimulation time of LPS,BV5cells were divided into blaud control group,blauk control +LAM gnap,blaud control+PIC gnap,LPS group,LPS+LAM group and LPS+PIC gnap.The expression levels of Wmor uecnsis factor-F(TNF-f),nitric oxide syythase(iNOS),Dechu-S and p-Syk were UeWcWp by Western bhtlng.Results Compared with control gnap,the proWix expression of Dechu-S,Syk and p-Syk was iucnased iu BV5cells induced by LPS for3,6,7,24U,and theexpression was the highest at24h(P<4.43).There was uo sipnificaut UNference iu the expression of each proWix between control gnap and control+LAM gnap,control+PIC gnap(P>4.43).Compared with LPS yrosp,the proWix expression of Dechu-S:p-Syk, TNF-f and iNOS was siynificanly dowu-regulawd iu LPS+LAM gnap(P<4.43).SimimSy,compared with LPS gnap,the proWix expression of TNF-f and iNOS was sipnificanly dowu-regulawd iu LPS+PIC gnap(P<4.43).Conclusion Dectix-S/Syk signal pathway cau be used as a poWnlai tarjet for the Weatwent of ueuninUammaW j nsponse.Key words：lipopolysacchariPe；dUammalon；dendriXe cell-associated C-type leclu-S;sphen tyrosiue kinase近年来,神经系统疾病的发生率和死亡率越来越高。
小胶质细胞的研究方法
小胶质细胞的研究方法小胶质细胞是一类位于中枢神经系统的非神经元细胞，它们在神经发育、维持神经环境稳定以及参与神经传导等方面发挥着重要的作用。
因此，研究小胶质细胞的方法对于深入了解神经系统的功能和疾病机制具有重要意义。
本文将介绍几种常用的小胶质细胞研究方法。
一、细胞培养小胶质细胞的细胞培养是研究小胶质细胞的基础方法之一。
细胞培养可以提供一个受控的实验环境，使得研究者可以对小胶质细胞进行多种实验操作。
通常，从小鼠或人脑中分离小胶质细胞，然后将其培养在含有合适培养基和生长因子的培养皿中。
通过细胞培养，可以研究小胶质细胞的形态、生理功能以及对外界刺激的响应等方面的特性。
二、免疫组织化学免疫组织化学是一种常用的研究小胶质细胞的方法。
通过标记特定的抗体，可以检测和定位小胶质细胞中的蛋白质或其他分子。
例如，通过使用特异性抗体标记小胶质细胞的特定表面标志物，可以帮助研究者确定细胞的类型和分布情况。
此外，免疫组织化学还可以用于检测小胶质细胞在神经系统中的反应和功能改变。
三、转录组学分析转录组学分析是研究小胶质细胞基因表达的重要方法。
通过RNA 测序技术，可以全面地了解小胶质细胞中基因的表达水平和变化。
这种方法可以帮助研究者发现小胶质细胞在不同发育阶段、疾病状态或受到不同刺激时的基因表达差异，进而揭示小胶质细胞在神经系统功能和疾病中的作用。
四、原位杂交原位杂交是研究小胶质细胞基因表达和分布的重要方法之一。
通过标记适当的探针，可以检测和定位小胶质细胞中具体基因的mRNA。
这种方法可以帮助研究者确定小胶质细胞中不同基因的表达模式和分布情况，进一步了解小胶质细胞的功能和相互作用。
五、功能性研究为了研究小胶质细胞的功能和影响，研究者还可以使用多种功能性实验方法。
例如，通过细胞钙成像技术可以监测小胶质细胞中的钙离子浓度变化，从而研究其对于神经信号传导的调控作用。
此外，还可以利用细胞电生理技术记录小胶质细胞的膜电位变化，以及使用基因敲除或过表达等方法研究小胶质细胞中特定基因的功能。
没食子酸通过NF-κB通路对缺氧诱导的 BV2小胶质细胞损伤的保护作用机制
没食子酸通过NF-κB通路对缺氧诱导的 BV2小胶质细胞损伤的保护作用机制陈洁;陈科;孟宪丽;王小博;陈小睿【期刊名称】《成都中医药大学学报》【年(卷),期】2024(47)2【摘要】目的:建立BV2细胞缺氧损伤模型,研究没食子酸通过NF-κB通路对缺氧诱导的BV2小胶质细胞损伤的保护作用机制。
方法:取BV2小胶质细胞分为空白组、模型组、低剂量、中剂量及高剂量组,通过三气培养箱建立BV2小胶质细胞缺氧损伤模型,低剂量、中剂量及高剂量组分别给予1.7 g/mL、3.4 g/mL、8.5g/mL没食子酸进行干预。
采用CCK-8法检测没食子酸对缺氧的BV2细胞的保护作用,使用试剂盒检测上清中乳酸脱氢酶(LDH)、细胞中超氧化物歧化酶(SOD)活力、丙二醛(MDA)和活性氧(ROS)的含量,ELISA检测上清中炎症因子表达水平(TNF-α、IL-1β、IL-6),Western blot检测BV2细胞内p-IKK/IKK、p-IκB/IκB和pNF-κBp65/NF-κB p65蛋白的表达水平以及NF-κB p65的核位移。
结果:与空白对照组相比,缺氧可造成BV2细胞培养基上清液LDH的活力增加和炎症因子(TNF-α、IL-1β、IL-6)的释放,细胞中SOD活力降低,MDA和ROS的水平升高,NF-κB通路(p-IKK/IKK、p-IκB/IκB和p-NF-κB p65/NF-κB p65蛋白的表达水平)的激活以及NF-κB p65的核位移。
没食子酸能通过降低LDH的活力,抑制氧化应激(提高SOD 的活力,下调MDA和ROS水平)、抑制炎症因子的释放、抑制NF-κB通路相关蛋白的激活以及NF-κB p65的核位移改善缺氧引起的BV2细胞损伤。
结论:没食子酸对缺氧诱导的BV2细胞炎症具有保护作用。
【总页数】7页(P11-17)【作者】陈洁;陈科;孟宪丽;王小博;陈小睿【作者单位】成都中医药大学药学院;成都中医药大学创新研究院/交叉学科研究院【正文语种】中文【中图分类】R285.5【相关文献】1.枸杞多糖对LPS诱导BV2小胶质细胞的抗炎活性及NF-κB信号通路的调控作用2.乙酰水杨酸姜黄素酯通过TLR4/NF-κB通路拮抗LPS诱导的BV2小胶质细胞炎症损伤3.丹酚酸A抑制NF-κB信号通路减轻脂多糖诱导的BV2小胶质细胞炎症反应4.丁酸钠通过TLR4/NF-κB信号通路调控脂多糖诱导的BV2小胶质细胞表型极化5.2-Hydroxycircumdatin C通过抑制TLR4/NF-κB/MAPK和JAK2/STAT3通路对脂多糖诱导BV2小胶质细胞发挥抗炎作用因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
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BV2小胶质细胞经典激活及替代激活的诱导及鉴定发表时间：2016-06-01T16:50:22.310Z 来源：《河南中医》2015年8月作者：吴非1,2 罗涛2 郭远瑾2 黎红华1 梅元武2[导读] 小胶质细胞是中枢神经系统内重要的固有免疫细胞，也是介导免疫反应的主要效应细胞。
吴非1,2 罗涛2 郭远瑾2 黎红华1 梅元武2（1.广州军区武汉总医院神经内科湖北武汉 430070）（2.华中科技大学协和医院神经内科湖北武汉 430022）【摘要】目的：观察BV2小胶质细胞经典激活及替代激活后代谢分子的变化，判断鉴别M1及M2极化型小胶质细胞的方法。
方法：小胶质细胞以100ng/ml的LPS及20ng/mL的IL-4分别经典激活及替代激活24小时，以ELISA方法检测IL-12、IL-10、TNF-α的分泌量，以实时荧光定量聚合酶链反应检测iNOS、Arg-1、IL-10、IL-12的mRNA表达，以流式细胞术检测细胞膜MMr蛋白表达。
结果：小胶质细胞被LPS 经典激活后呈M1型极化，IL-12、TNF-α分泌量、iNOSmRNA、IL-12mRNA表达量明显升高，与生理对照组比较有统计学差异（p<0.05)。
小胶质细胞被IL-4替代激活后呈M2极化， IL-10分泌量、Arg-1mRNA及IL-10mRNA表达量显著升高，流式细胞术检测MMr蛋白荧光强度较生理对照组显著上升（p<0.05)。
结论：小胶质细胞的能够被LPS经典激活呈M1型极化，IL-4替代激活呈M2型极化，M1/M2极化状态的小胶质细胞能够通过检测炎性相关因子、精氨酸代谢分子及细胞膜特异性蛋白三个方面得到鉴别。
【关键词】小胶质细胞；经典激活；替代激活；M1/M2型极化；脂多糖；白介素-4【中图分类号】R741 【文献标识码】B 【文章编号】1003-5028（2015）8-0651-02The Identification of Classical or Alternative Activation on BV2 MicrogliaWu Fei1,2,Luo Tao2,GuoYuan-jing2,Li Hong-Hua1, Mei Yuan-wu2（1 Department of neurology, Wuhan General Hospital of Guangzhou Military 430070）（2.Department of neurology, Wuhan Union Hospital, HuaZhong University of Science and Technology 430022)【Abstract】Objective：To observe the changes in metabolic molecule of BV2 microglia after it is classical or alternative activated, and judge the methods to identify the M1 or M2 -type polarized microglia cells. Methods：BV2 microglia cells were classical activated by LPS in the concentration of 100ng/ml and alternative activated by IL-4 in the concentration of 20ng/mL for 24 hours, then ELISA was used to measure the levels of IL-12, IL-10, TNF-α , and Real-time PCR was used to detect the mRNA expression of iNOS,Arg-1, IL-10 and IL-12. Flow cytometry(FCM) was used to measure the levels of MMr membrane protein . Results：Microglia presented M1-type polarization state after it were classical activated, the secretion of IL-12 and TNF-α, the expression of iNOS mRNA and IL-12mRNA were significantly increased , and the difference were significant compare with that of in normal control group（P<0.05）. Microglia presented M2-type polarization state after it were alternative activated, and the secretion of IL-10, the expression of Arg-1mRNA and IL-10mRNA were significantly increased, and the difference were significant compared with that of in normal control group（P<0.05）. The levels of MMr were also increased significantly measured by Flow cytometry(FCM). Conclusion： BV2 microglia could present M1-type polarization state after it were classical activated, M2-type polarization state after alternative activated. The two type polarization could be identified detected from three aspects including inflammatory factors , arginine metabolic molecular and specific cell membrane proteins. 【Keywords】microglia，classical activation，alternative activation，M1/M2 type polarization， lipopolysaccharide，interleukin-4 小胶质细胞是中枢神经系统内重要的固有免疫细胞，也是介导免疫反应的主要效应细胞[1]。
目前研究证实小胶质细胞来源于单核吞噬细胞系统，因此能够表现出巨噬细胞的很多生物学特征，比如被各种内源性及外源性病理刺激所激活、具有特异性的巨噬细胞表面抗原等等。
巨噬细胞的激活途径主要包括经典激活途径和替代激活途径[2], 经典激活的巨噬细胞为M1型巨噬细胞，主要分泌大量促炎因子参予对病原体清除及疾病的炎性损伤过程，而替代激活的巨噬细胞为M2型巨噬细胞，它主要干预炎症的进展、修复损伤组织等。
小胶质细胞受到不同的刺激后亦可表现为促炎和抗炎的双重作用，在老年性痴呆、帕金森病、多发性硬化等等神经系统疾病免疫反应中即能分泌具有神经毒性的炎性因子，又能分泌神经营养因子及抗炎因子[3, 4]，它的也因些被区分为M1型或M2型小胶质细胞，但小胶质细胞极化后是否能通过鉴定巨噬细胞的方法来进行鉴别目前仍无明确阐述，研究小胶质细胞极化状态对于通过其干预神经系统免疫性疾病具有重要意义。
1 材料与方法1.1材料与试剂BV2小胶质细胞购北北京协和医院基础所细胞中心，DMEM培养基、胎牛血清、胰蛋白酶购于Gibcol公司，脂多糖及白介素-4购于Sigma公司、小鼠 TNF-α、IL-10、IL-12ELISA检测试剂盒购于Biolegend公司，FITC标记Anti-MMr抗体购于北京雅吉生物公司，Real-time PCR （实时荧光定量）相关试剂盒购买于大连TaKaRa公司。
1.2 RT-PCR引物设计iNOS、Arg-1、IL-10引物南京金斯瑞生物科技有限公司合成，引物序列如下：1.2 BV2细胞的培养BV2小胶质细胞系作为研究载体，复苏后将细胞置于含10%胎牛血清的DMEM完全培养基培养，以5%CO2、37℃培养箱内培养至细胞贴壁，每隔2－3天传代，当细胞贴壁生长且状态良好后按1×106/ml接种于6孔板。
1.3 BV2细胞分组及给药细胞分组给药。
A组为生理对照组（DMEM）、B组为经典激活组（100ng/ml的LPS诱导24小时）、C组为替代激活组（20ng/mL的IL-4诱导24小时）、 D组为M1向M2转化组（100ng/ml的LPS 刺激24小时后洗脱换液用20ng/mLIL-4再培养24小时）；E组为M2向M1转化组（20ng/mLIL-4刺激24小时后洗脱换液用100ng/ml的LPS再培养24小时）。
1.4 ELISA 测定各组TNF-α、IL-12、IL-10组织含量将结束诱导后的各组细胞培养上清收集，按ELISA试剂盒说明书检测各组TNF-α、IL-12、IL-10水平，显色结束后用酶标仪450nm波长检测各组吸光度( D值) ，利用标准品建立标准曲线，根据标准曲线对照各组OD值计算TNF-α、IL-12、IL-10含量。
1.5 实时荧光定量PCR测定iNOS、Arg-1、IL-10mRNA的表达按TaKaRa公司RNA提取试剂盒说明书及反转录试剂盒说明书操作，分别提取各组细胞总RNA，NanoDrop1000检测RNA的浓度，采用TAKARA逆转录及实时荧光定量试剂盒检测iNOS，Arg-1，IL-10mRNA的表达，内参对照为三磷酸甘油醛脱氢酶( GADPH)，PCR反应设置参数：95℃变性4 min；95℃ 30 s，55℃ 1 min，72℃ 1 min，35 个循环；72℃延伸 5 min。
分每个待检样本设3个复孔检测。
CT值代表RT-PCR的检测结果,待检目的基因的表达通过计算所得，计算公式为ΔCT=CT（目的基因）—CT（内参基因），ΔΔCT=ΔCT（实验组）—ΔCT（对照组），2-ΔΔCT=待检目的基因表达/对照组细胞中目的基因表达。
1.6 流式细胞仪检测BV2膜蛋白甘露糖受体MMr的表达各组BV2细胞以用PBS洗净后以1ml胰酶消化成细胞悬液，以DMEM中止消化，以1000rpm离心5分钟，以PBS洗涤细胞2次并重悬调整细胞浓度为约1×105/ml， 100ul PBS 再次重悬，此时细胞浓度调整为1×105/ml，每管中加入0.125μl FITC-Anti-MMr(甘露糖受体)，4℃孵化0.5 h，然后用PBS洗两次。