第七章色谱分离技术凝胶筛分
凝胶层析技术(凝胶过滤)
目前使用较多的是葡聚糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶 聚丙烯酰胺凝胶，其商品为生物凝胶-P（Bio-Gel P）组成单位是丙烯酰胺（CH2=CH-CONH2）与 甲叉双丙稀酰胺，共聚交联成聚丙烯酰胺。 优点：全惰性的，适宜作为凝胶层析的载体。 缺点：不耐酸，遇酸时酰胺键会水解成羧基，使凝 胶带有一定的离子交换基团，一般只在pH为11范 围内使用。 交联葡聚糖凝胶（商品名为Sephadex）。 优点：具有良好的化学稳定性等优点。目前最常用。
原理
● 凝胶是一类多孔性高分子聚合物，每 个颗粒犹如一个筛子。 ● 当样品溶液通过凝胶柱时，相对分子 质量较大的物质沿着凝胶颗粒间的孔隙， 随着溶剂流动，首先流出层析柱； ● 相对分子质量较小的物质可自由地进出 凝胶颗粒的网孔，使流量增长，移动速率 慢而最后流出层析柱。 ● 中等大小的分子在大分子物质与小分子 物质之间被洗脱。 ● 这样，经过层析柱，混合物中的各物质 按其分子大小不同而被分离。
3、样品的加入 吸取1ml血红蛋白——核黄素混合液，加到凝胶床的表面上， 不要沿柱壁加样品，注意加样时勿将床冲起。 打开出口管，用少量水流一下，接触过样品的管壁，再加水扩 展洗脱，用试管将洗脱液。 4、洗脱： 加0.1mol/l的Nacl溶液洗脱，流速为每分钟1ml,两分钟收一 管。 5、比色测定：波长，红色部分520nm,黄色部分450nm 绘制洗脱曲线： 以光密度为纵座标，以时间为横座标，并标明洗脱峰的名称 。 6、凝胶的回收。
特点：与被分离物质分子的 大小和凝胶颗粒孔隙的大小 有关
Kd=0
大分子量 小分子量
Hale Waihona Puke 0＜Kd<1 Kd=1
洗脱体积
应用
凝胶层析法适用于分离和提纯蛋白质、酶、多肽、激素、 多糖、核酸类等物质。 分子大小彼此相差25%的样品，只要通过单一凝胶床就可 以完全将它们分开。 利用凝胶的分子筛特性，可对这些物质的溶液进行脱盐、 去热源和脱色。
凝胶色谱法
凝胶色谱法 添加摘要 凝胶色谱法又叫凝胶色谱技术，是六十年代初发展起来的一种快速而又简单的分离分析技术，由于设备简单、操作方便，不需要有机溶剂，对高分子物质有很高的分离效果。
凝胶色谱法又称分子排阻色谱法。
凝胶色谱法主要用于高聚物的相对分子质量分级分析以及相对分子质量分布测试。
目前已经被生物化学、分子生物学、生物工程学、分子免疫学以及医学等有关领域广泛采用，不但应用于科学实验研究，而且已经大规模地用于工业生产。
凝胶色谱法-分类根据分离的对象是水溶性的化合物还是有机溶剂可溶物，又可分为凝胶过滤色谱（GFC ）和凝胶渗透色谱（GPC ）。
凝胶过滤色谱一般用于分离水溶性的大分子，如多糖类化合物。
凝胶的代表是葡萄糖系列，洗脱溶剂主要是水。
凝胶渗透色谱法主要用于有机溶剂中可溶的高聚物 (聚苯乙烯、聚氯已烯、聚乙烯、聚甲基丙烯酸甲酯等) 相对分子质量分布分析及分离，常用的凝胶为交联聚苯乙烯凝胶，洗脱溶剂为四氢呋喃等有机溶剂。
凝胶色谱不但可以用于分离测定高聚物的相对分子质量和相对分子质量分布，同时根据所用凝胶填料不同，可分离油溶性和水溶性物质，分离相对分子质量的范围从几百万到100以下。
近年来，凝胶色谱也广泛用于分离小分子化合物。
化学结构不同但相对分子质量相近的物质，不可能通过凝胶色谱法达到完全的分离纯化的目的。
凝胶色谱系统凝胶色谱仪凝胶渗透色谱技术原理凝胶色谱法-分子筛效益一个含有各种分子的样品溶液缓慢地流经凝胶色谱柱时，各分子在柱内同时进行着两种不同的运动：垂直向下的移动和无定向的扩散运动。
大分子物质由于直径较大，不易进入凝胶颗粒的微孔，而只能分布颗粒之间，所以在洗脱时向下移动的速度较快。
小分子物质除了可在凝胶颗粒间隙中扩散外，还可以进入凝胶颗粒的微孔中，即进入凝胶相内，在向下移动的过程中，从一个凝胶内扩散到颗粒间隙后再进入另一凝胶颗粒，如此不断地进入和扩散，小分子物质的下移速度落后于大分子物质，从而使样品中分子大的先流出色谱柱，中等分子的后流出，分子最小的最后流出，这种现象叫分子筛效应。
凝胶色谱法
凝胶色谱法添加摘要凝胶色谱法又叫凝胶色谱技术，是六十年代初发展起来的一种快速而又简单的分离分析技术，由于设备简单、操作方便，不需要有机溶剂，对高分子物质有很高的分离效果。
凝胶色谱法又称分子排阻色谱法。
凝胶色谱法主要用于高聚物的相对分子质量分级分析以及相对分子质量分布测试。
目前已经被生物化学、分子生物学、生物工程学、分子免疫学以及医学等有关领域广泛采用，不但应用于科学实验研究，而且已经大规模地用于工业生产。
凝胶色谱法-分类根据分离的对象是水溶性的化合物还是有机溶剂可溶物，又可分为凝胶过滤色谱（GFC和凝胶渗透色谱（GPC。
凝胶过滤色谱一般用于分离水溶性的大分子，如多糖类化合物。
凝胶的代表是葡萄糖系列，洗脱溶剂主要是水。
凝胶渗透色谱法主要用于有机溶剂中可溶的高聚物（聚苯乙烯、聚氯已烯、聚乙烯、聚甲基丙烯酸甲酯等）相对分子质量分布分析及分离，常用的凝胶为交联聚苯乙烯凝胶，洗脱溶剂为四氢呋喃等有机溶剂。
凝胶色谱不但可以用于分离测定凝胶色谱仪高聚物的相对分子质量和相对分子质量分布，同时根据所用凝胶填料不同，可分离油溶性和水溶性物质，分离相对分子质量的范围从几百万到100以下。
近年来，凝胶色谱也广泛用于分离小分子化合物。
化学结构不同但相对分子质量相近的物质,不可能通过凝胶色谱法达到完全的分离纯化的目的。
---------------------------- 愆虫凝胶渗透色谱技术原理凝胶色谱法-分子筛效益一个含有各种分子的样品溶液缓慢地流经凝胶色谱柱时，各分子在柱内同时进行着两种不同的运动：垂直向下的移动和无定向的扩散运动。
大分子物质由于直径较大，不易进入凝胶颗粒的微孔，而只能分布颗粒之间，所以在洗脱时向下移动的速度较快。
小分子物质除了可在凝胶颗粒间隙中扩散外，还可以进入凝胶颗粒的微孔中，即进入凝胶相内，在向下移动的过程中，从一个凝胶内扩散到颗粒间隙后再进入另一凝胶颗粒，如此不断地进入和扩散，小分子物质的下移速度落后于大分子物质，从而使样品中分子大的先流出色谱柱，中等分子的后流出，分子最小的最后流出，这种现象叫分子筛效应。
凝胶净化色谱
凝胶净化色谱
凝胶净化色谱是一种常用的生物分离技术，可用于分离、纯化和富集蛋白质、DNA、RNA等生物大分子。
该技术基于溶液中物质的分子大小、电荷、亲疏水性等物理化学特性，利用凝胶的孔隙结构和交联程度实现分离和纯化。
凝胶材料包括琼脂糖、聚丙烯酰胺、琥珀酸纤维素等，不同材料具有不同的孔隙结构和交联程度，可以选择不同的材料实现不同的分离效果。
凝胶净化色谱可分为大小分离色谱、离子交换色谱、亲和色谱等多种类型，其具有分离效果好、操作简便、纯化度高等优点，被广泛应用于生物化学、分子生物学、药物研发等领域。
- 1 -。
凝胶色谱层析定义以及分离原理
凝胶色谱层析是一种基于分子大小差异进行分离的色谱技术，也称为凝胶层析或凝胶过滤。
其定义如下：
凝胶层析是一种利用多孔凝胶作为分离介质的色谱技术。
在凝胶层析中，样品混合物被流动相带入凝胶柱或凝胶片中。
由于不同大小的分子在凝胶层中的扩散速率不同，大分子先被流动相冲出柱体，而小分子后流出。
因此，大小不同的分子被分离。
关于其分离原理，可以这样理解：
凝胶色谱的分离原理基于分子在凝胶基质中的不同扩散速率。
样品在多孔凝胶柱中随着流动相的移动，待分离的组分沿凝胶颗粒间的孔隙移动。
大分子由于尺寸较大，只能通过凝胶颗粒间的孔隙，因此移动路径较短，先流出色谱柱。
而小分子由于尺寸较小，可以扩散进入凝胶颗粒内部，因此迁移路径长，后流出色谱柱。
这样，不同大小的分子就实现了分离。
以上内容仅供参考，建议查阅专业生物化学书籍或者咨询专业人士以获取更准确的信息。
生物制药工艺学课件讲稿—凝胶层析
第七章凝胶层析定义：将样品混合物通过一定孔径的凝胶固定相，由于流经体积的差异，使不同分子量的组份得以分离的层析（色谱）方法，又叫扩散层析，排阻层析，分子筛层析第一节基本原理一.分离原理凝胶是由胶体溶液凝结而成的固体物质，内部具有网状筛孔，利用球状凝胶内的筛孔，使分子流过填充凝胶的管柱时，大分子无法进入凝胶筛孔，而只流经凝胶及管柱间的孔隙，很快就可以流出管柱，较小的分子因为进入凝胶内的筛孔，故在管柱内的停留时间较长，由此区分大小不同的分子，亦可与已知大小的分子作比较而定出一分子的分子量。
一般状况下，凝胶不会吸附成份，所有欲分离物质都会被洗出，这是凝胶层析法与其它层析法不同的地方。
凝胶层析分离的基本原理如下：凝胶层析介质分离的分子主要分3部分。
第——部分是全排阻分子，也可称之为上限分子，是不能起筛分作用的大分子。
第二部分是部分渗透分子，称为分离分子，是凝胶介质有效分离的分子。
第三部分是全渗透分子，称之为下限分子，是不能起筛分作用的小分子。
如图2—27所示。
从图2—27可以看出，A—B之间为该凝胶的有效分离范围．可分离相对分子质量范围是103一105，高于相对分子质量为105的是全排阻分子，低于相对分子质量为105的是全渗透分子。
二.参数的表示方法及其意义1.表示方法(1)柱床体积凝胶层析介质经溶胀、装柱、沉降、体积稳定后，所占层析柱内的总体积，称为柱床体积或床体积，以Vt(totle volume)表示，单位为m1。
(2)外水体积存在于柱床体积内凝胶颗粒之外、颗粒之间的空隙所占有的那—部分水相体积或溶剂体积，称之为外水体积或外体积、空隙体积，以Vo(outer volume)表示，单位为ml(3)内水体积是凝胶吸水溶胀后，存在于凝胶颗粒内所占有的那一部分水相体积或溶剂体积，称之为内水体积或内体积，以V i(inner volume)表示，单位为ml。
(4)凝胶体积是凝胶颗粒自身的体积．也就是床体积减去外水体积和内水体积后所占有的体积，称为胶体积或称干胶体积，以Vg(gel volume)表示，单位为ml。
吸附色谱 分配色谱 凝胶过滤色谱的分离原理
吸附色谱分配色谱凝胶过滤色谱的分离原理吸附色谱、分配色谱和凝胶过滤色谱是常用的分离技术，它们分别基于不同的分离原理。
本文将详细介绍这三种色谱的分离原理和应用。
一、吸附色谱的分离原理吸附色谱是一种根据样品组分与固定相之间吸附平衡差异进行分离的技术。
其基本原理是样品中的组分在固定相上发生吸附作用，不同组分的吸附性质不同，从而实现分离。
常见的吸附色谱方法有气相色谱和液相色谱两种。
1. 气相色谱气相色谱是利用气体作为流动相，以吸附剂涂覆在固定相上进行分离的技术。
样品进入色谱柱后，根据样品组分与吸附剂的亲和性进行分离。
亲和性较强的组分在吸附剂上停留时间长，而亲和性较弱的组分则快速通过柱床。
通过测量样品组分在柱床中停留时间的长短，可以得到分离结果。
2. 液相色谱液相色谱是以液体作为流动相，将样品溶解在流动相中进行分离的技术。
根据不同的吸附剂、固定相和流动相，液相色谱又可分为几十种不同的分离方式，如反相色谱、离子交换色谱等。
二、分配色谱的分离原理分配色谱是根据样品组分在液相和固定相之间均匀分配的原理进行分离。
该技术适用于有机化合物的分离。
分配色谱依赖于样品分子在两个不相溶相中的平衡分配系数差异，即液相中样品分子在固定相和溶液中的平衡浓度比。
常见的分配色谱方法有液液分配色谱和气液分配色谱两种。
1. 液液分配色谱液液分配色谱是利用两种不相溶的液体相来进行分离的技术。
样品先溶解在一个氢溶剂中，再与另一个极性溶剂进行分离。
样品分子在两种液体相之间均匀分配，根据各自的溶解度、极性等特征，实现不同组分的分离。
2. 气液分配色谱气液分配色谱是将气体作为流动相，液体作为固定相进行分离的技术。
样品在气相和液相之间的分配系数不同，导致分离效果。
常见的气液分配色谱方法有蒸气压色谱和气相色谱。
三、凝胶过滤色谱的分离原理凝胶过滤色谱是一种利用凝胶材料的孔隙大小和形状特征分离不同分子量的技术。
凝胶材料通常是多孔的，通过孔隙对样品分子进行筛分。
凝胶色谱
（四）样品溶液的处理 样品溶液如有沉淀应过滤 或离心除去，如含脂类可高速离心或通过 Sephadex G-15短柱除去。样品的粘度不可大， 含蛋白为超过4％，粘度高影响分离效果。上柱样 品液的体积根据凝胶床体积的分离要求确定。分 离蛋白质样品的体积为凝胶床的1-4％（一般约 0.5-2ml），进行分族分离时样品液可为凝胶床的 10％，在蛋白质溶液除盐时，样品可达凝胶床的 20-30％。 分级分离样品体积要小，使样品层尽 可能窄，洗脱出的峰形较好。
凝胶的种类及性质
（一）交联葡聚糖凝胶（Sephadex） ⑴Sephadex G交联葡聚糖的商品名为Sephndex，不同规 格型号的葡聚糖用英文字母G表示，G后面的阿拉伯数为 凝胶得水值的10倍。例如，G-25为每克凝胶膨胀时吸水 2.5克，同样G-200克每克千胶吸水20克。交联葡聚糖凝胶 的种类有G-10，G-15，G-25，G-50，G-75，G-100，G150，和G-200。因此，“G”反映，凝胶的交联程度，膨 胀程度及分部范围。 ⑵Sephadex LH-20，是─Sephadex G-25的羧丙基衍生 物， 能溶于水及亲脂溶剂，用于分生物的污染 交联葡聚糖和琼脂糖都是多糖 类物质，防止微生物的生长，在凝胶层析中十分重要，常 用的抑菌剂有: ⑴叠氨钠（NaN3）在凝胶层析中只要用0.02％叠氮钠已 足够防止微生物的生长，叠氮钠易溶一水，在20℃时约为 40％；它不与蛋白质或碳水化合物相互作用，因此叠氮钠 不影响抗体活力；不会改变蛋白质和碳水化合物的层析我 特性。叠氮钠可干扰荧光标记蛋白质。 ⑵可乐酮[Cl3C-C(OH)(CH3)2]在凝胶层析中使用浓度为 0.01-0.02％。在微酸性溶液中它的杀菌效果最佳，在强碱 性溶液中或温度高于60℃时易引起分解而失效。 ⑶乙基汞代巯基水杨酸钠 在凝胶层析中作为抑菌剂使用 浓度为0.05-0. 01％。在微酸性溶液中最为有效。重金属 离子可使乙基代巯基的物质结合，因而包含疏基的蛋白质 可在不同程度上降低它的抑菌效果。 ⑷苯基汞代盐 在凝胶层析中使用浓度为0.001-0.01％。在 微碱性溶液中抑效果最佳，长时间放置时可与卤素、硝酸 根离子作用而产生沉淀；还原剂可引起此化合物分解；含 疏基的物质亦可降低或抑制它的抑菌作用。
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常规的色层分离
色层分离过程包含两部分： 固定相：载体或载体+功能基团 流动相（洗脱液）：缓冲液或有机溶剂
对于高压液相色谱和低压层析，操作模式有很 大区别。
第七章色谱分离技术凝胶筛分
上样 洗脱
上样 冲洗 洗脱
高压液相色谱 分离操作过程
层析分离操作过程
第七章色谱分离技术凝胶筛分
N (tR )2
第七章色谱分离技术凝胶筛分
色谱流出曲线及参数
第七章色谱分离技术凝胶筛分
容量因子k 和平衡常数K 某物质的k定义为在分配平衡时该物质在两
相中绝对量之比。
k'
物质在固定相的(q量 s ) 物质在流动相的(q量 m)
而平衡常数K为平衡时，物质在两相的浓度比：
K
物质在固定相的(浓 qs /度 Vs) 物质在流动相的浓qm度/V（ m)
第七章色谱分离技术凝胶筛分
分离原理： 含有不同分子大小的样品进入色谱柱（层析
柱）后，较大的分子不能通过孔道扩散进入填料 颗粒（凝胶珠体）内部，而与流动相一起先流出 色谱柱（层析柱）。较小的分子可通过部分孔道、 更小的分子可通过任意孔道扩散进入颗粒（珠体） 内部。这种颗粒内部扩散的结果，使小分子沿柱 流动的速度减慢，使混合样品中不同的分子按分 子大小的顺序流出色谱柱（层析柱）从而达到分 离的目的。
用途：用在产品的精制阶段，目标是获得合乎使 用要求的产品。
第七章色谱分离技术凝胶筛分
色层分离原理
当两相作相对移动时，利用溶质在互不相溶的 两相中吸附或分配的差异，引起移动速度的不 同而进行分离的方法。
第七章色谱分离技术凝胶筛分
分类
流动相与固定相：
流动相：可为气相、液相、超临界流体等 固定相：固体、液体和以固体为载体的液体薄层
第七章色谱分离技术凝胶筛分
第七章色谱分离技术凝胶筛分
液相色谱的基本原理和参数
第七章色谱分离技术凝胶筛分
保留时间(tR)和保留体积(VR)
从进样开始到后来出现样品的浓度极大值所
需的时间为保留时间，用tR表示。在这段时间
内冲洗剂（流动相）
VR tR•F
流过的体积为保留体积，用VR 表示。
理论塔板数的计算公式为：
第七章色谱分离技术凝胶筛分
第七章色谱分离技术凝胶筛分
凝胶过滤介质：良好的凝胶过滤介质应满足如 下要求：
（1）亲水性高，表面惰性，即介质与溶质之间不发生任 何化学或物理相互作用； 蛋白质的分级和除盐效果只与溶质的相对分子量、
分子形状和凝胶结构（孔径分布）有关，与所用洗脱液 的pH值和离子强度等物性无关。 （2）稳定性强，在较宽的pH和离子强度范围以及化学试
剂中保持稳定，使用寿命长； （3）具有一定的孔径分布范围； （4）机械强度高，允许较高的操作压力。
第七章色谱分离技术凝胶筛分
常用的分离介质
天然及高分子介质 经常使用的是葡聚糖凝胶（Sephadex）、琼
脂糖（Sepharose）、琼脂糖与葡聚糖接枝而成 的复合凝胶（Superdex）以及聚丙烯酰胺类和聚 乙烯醇类合成凝胶（TSKgel）。
前移动，所以对于一个在柱内有保留的溶质，其谱带移
动速度(u b )总是小于流动相的移动速度(u m )，而等于流
动相的移动速度与该谱带对应的溶质在流动相停留的时
间分数之积：
ub um(11k')
而当柱长一定时，溶质谱带的移动速度和流动相的移 动速度与它们通过柱子所花费的时间成反比：
ub
t
o R
um tR
理论塔板高度H 为： 式中， L 柱长。
HL N
塔板高度论塔板高度（ H）随填料粒度减少而减少； 2）在一定范围内流速减小有利于提高柱效； 3）减少冲洗剂粘度或提高柱温有利于 H减小； 4）分子量较小的样品分子 H较小。
第七章色谱分离技术凝胶筛分
固定相的形状：
纸层析 薄层层析 柱层析
第七章色谱分离技术凝胶筛分
操作压力
低压：﹤0.5 MPa 中压：0.5-4.0 MPa
用于大量制备
高压：4.0-40 MPa，用于分析目的
分离操作模式
洗脱展开：最常用 前沿（迎头）分析 顶替展开
第七章色谱分离技术凝胶筛分
分配机理
根据溶质和固定相间的作用机理 凝胶过滤 离子交换 反相色谱 疏水层析 亲和色谱
凝胶过滤层析（体积排阻色谱）
Gel filtration chromatography,GFC Size exclusion chromatograpy，SEC
是一种纯粹按照溶质分子在溶液中的体积大 小进行分离的层析技术。
应用：主要用于蛋白质等生物大分子的分级分离 和除盐。一般用作原料液的初分离，获取 几个不同分子量物质分级，供进一步分离 纯化使用。
tR tR 0 ( 1 k ')
第七章色谱分离技术凝胶筛分
当柱外死体积可忽略不计时， VR0 Vm
VRVmVm k'VmKsV
k'tR 1tR tR 0tR '
tR 0
tR 0 tR 0
第七章色谱分离技术凝胶筛分
选择性( ' )和相对保留值()
=
t
' R
2
t
' R
1
' = tR2 1 k'(2)
tR1 1 k'(1)
柱效率： 塔板高度（H）和塔板数（N）是衡量色谱柱 效率的两个重要指标。
塔板高度（H）：在某一段柱长范围内溶质在固定相和流 动相之间达到分配平衡，这段柱长就相 当于一个理论塔板的高度(HETP或H)。
理论塔板数的计算公式为：
式中为标准偏差。
N (tR )2
第七章色谱分离技术凝胶筛分
第七章色谱分离技术凝胶筛分
Vs和Vm分别为柱内固定相和流动相所占的体
积。于是有
k' qs K Vs
qm
Vm
溶质在固定相停留的时间分数= qs k' qs qm 1k'
溶质在流动相停留的时间分数 qm 1 qs qm 1k'
第七章色谱分离技术凝胶筛分
在柱内溶质只有转移到流动相时才能沿柱的方向向
色层分离技术
色层分离：是一组相关技术的总称，也称为色谱 分离或层析分离。
惯用法 按固定相的基质（载体）类型分类：
层析：载体一般为软基质的凝胶，常用的有纤维 素、琼脂糖、交联葡聚糖、交联琼脂糖、 聚丙烯酰胺凝胶等，只适合在低压下操 作。
第七章色谱分离技术凝胶筛分
色谱：载体一般为高强度的经过表面该性的硅胶、 聚甲基丙烯酸或聚苯乙烯材料，适合在高 压下使用。 也有人将层析称为色谱。