第七章 层析分离技术层析技术导论
1．分配系数
分离因数α
在吸附层析过程中，为了更好地描述被分离物质在液 相和固相中的浓度关系，常采用吸附等温曲线来表示。
Cs Cs Cs
a
b
c
0
Cm
0
Cm
0
Cm
图9-2 几种典型的吸附等温线 a-凸形 b-凹形 c-S形
a——单分子层吸附； b——多分子层吸附； c——单分子层和多分子层混合吸附。
第七章 层析（色谱）分离技术
本章内容
7.1 层析技术导论 7.2 凝胶过滤层析 7.3 离子交换层析 7.4 亲和层析 7.5 固定金属离子亲和层析 7.6 疏水作用层析 7.7 反相色谱（层析） 7.8 柱层析分离的工艺设计策略及典型实例
本章教学要求
基本要求：掌握色谱（层析）分离法的 基本概念和分类，了解常用层析分离 方法的基本原理及应用。 重点：凝胶过滤层析、离子交换层析、 亲和层析、固定金属离子亲和层析。 难点：常用层析法的分类及其合理选 用。
7.1 色谱技术导论
一、层析分离的基本概念及其特点
2. 层析分离的特点
分离效率高 应用范围广 选择性强 高灵敏度的在线检测 快速分离 过程自动化操作
7.1 色谱技术导论
二、层析分离的分类
1.按分离机理不同分类
吸附层析、分配层析、凝胶过滤层析
2.按固定相形状不同分类
柱层析、纸层析、薄层层析
7.1 色谱技术导论
三、层析分离的基本原理
1. 吸附层析
原理：混合物随流动相通过固定相（吸附
剂）时，由于固定相对不同物质的吸附力不 同而使混合物得到分离。
吸附剂：氧化铝、硅胶、活性炭、磷酸钙
等。
特点：应用最早，价格较低；选择性低。 新型吸附层析技术：离子交换层析、亲
和层析、疏水作用层析、金属鳌合层析等。
7.1 色谱技术导论
一、层析分离的基本概念及其特点
1. 层析分离的基本概念:
层析分离是一种物理的分离过程，利用多组分 混合物中各组分的物理化学性质的差异，使各 组分以不同程度分布在两个相（固定相和流动 相）中。 当多组分混合物随流动相流动时，由于各组分 物理化学性质的差异，在固定相和流动相之间 经过多次分配（吸附-解吸-再吸附-再解吸……） 以不同的速率移动，从而达到分离的目的。
7.1 色谱技术导论
三、层析分离的基本原理
2. 分配层析
原理：其固定相和流动相都是液体，其原
理类似于液液萃取，利用混合物中各物质在 两液相中的分配系数不同而分离。其中，固 定相是由固定液与载体结合后形成的。 正相层析：固定相为极性，流动相为非极性；
反相层析：固定相为非极性，流动相为极 性。
1．分配系数
分离因数α
分离因数：某一瞬间被吸附的溶质量占总量的分数 （表示）：
=cs/ct=cs/(cs+cm)
0≤≤1：
当=0时，此种溶质不与固定相产生吸附作用，或固 定相已无空余的结合位点，此时溶随流动相以同样的 速度移动； 当=1时，溶质全部被吸附在固定相上，且不随流动 相移动。 在柱色谱分离中，有效的分离通常要求值至少为0.8。
3. 根据流动相的物理形态不同分类
气相层析、液相层析、超临界层析
4. 根据操作压力不同分类
低压层析分离（<0.5MPa） 中压层析分离（0.5~5MPa） 高压层析分离（5~50MPa）
5. 根据层析分离的规模大小分类
分析型（一次进样量<10 mg）、半制备型（一次进样量10-50 mg）、 制备型（一次进样量0.1-10 g）和工业生产型（> 20 g/d）
7.1 色谱技术导论
三、层析分离的基本原理
3. 凝胶过滤层析
原理：根据物质分子大小不同而进行分离
的色谱技术，又称分子筛色谱。由于大分子 和小分子在通过色谱柱时，所通过得路径不 同（大分子进入空隙，小分子进入孔内）， 流出色谱柱的时间不同，从而得到分离。其 固定相为凝胶，流动相可根据实验需要选择 不同的缓冲溶液。
7.1 层析技术导论
一、层析分离的基本概念及其特点 二、层析分离的分类 三、层析分离的基本原理 四、层析理论 五、层析过程和仪器设备
一、层析分离的基本概念及其特点
层析分离技术早在二十世纪初就已在生产实践 中使用:
1903年，俄国植物学家茨维特(Tswett)在研究植物 叶子的组成时，用碳酸钙作吸附剂，用石油醚作为 洗脱剂，他把干燥的碳酸钙粉末装到一根细长的玻 璃管中，然后把植物叶子的石油醚萃取液倒入管中 的碳酸钙上，萃取液中的色素就吸附在管内上部的 碳酸钙里，再用纯净的石油醚洗脱被吸附的色素， 于是在管内形成了数条相互分离的色带，当时茨维 特把这种色带叫作“色谱”（Chromatographie）。 在这一方法中把玻璃管称为“色谱柱”，碳酸钙称 为“固定相”，纯净的石油醚称为“流动相” 。 因此，层析分离又称色谱分离（Chromatographic Resolution, CR）或色层分离，本章统一使用层析 分离这一名称。
如果在整个层析过程中，Cm与 Cs之间呈线 性关系，即分配系数K为常数，那么该层析 过程称为线性层析； 如果Cm与 Cs之间不存在线性关系，而是出 现其他的函数关系，那么相应的层析分离过 程就称为非线性层析。
1．分配系数
为了更好地描述层析过程中Cm与 Cs之间 的关系
在分配层析中直接用分配系数K表示 在吸附层析中衍生出分离因数α 在凝胶层析中衍生出分配常数Kd
1．分配系数
分配系数K
在分配层析中 ，分配系数：类似于溶剂萃
取中的分配系数 K=cs/cm
cs、cm分别为溶质在固定相和流动相中的浓度， K为分配系数。
在一定温度下，当溶质的浓度较低时， K为常数——线性 色谱； 当溶质的浓度较高时， K为溶质浓度的函数——非线性色 谱。
在层析过程中，分配系数较大的组分，迁移速度较 慢；而分配系数较小的组分，迁移速度较快。因此， 分配系数相差较大的两种物质很容易通过层析过程 进行分离。
主要用于脱盐、分级分离和分子量测 定等。
图9-10
凝胶过滤层析原理
7.1 色谱技术导论
四、层析理论
1．分配系数 2．层析曲线 3．理论塔板数 4．分离度
1．分配系数Fra bibliotek在层析过程的某一时刻，如果流动相中 样品的浓度为Cm，固定相中样品的浓度 为Cs， 则分配系数K定义为：K=Cs/Cm。
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层析技术及原理
思考题 1. 血清r-球蛋白分离与纯度鉴定的原理?
层析可分哪几类？
3．简述离子交换层析和凝胶层析的原理? 4．主要有哪几个操作步骤?
图3-2 Rs计算示意图
图3-3 垂直线法计算Rs示意图
若Rs=1，则组分定会分离；Rs<1，则组分部分分离；Rs=0，组分不能分离或分离极差。
四.分配系数
在层析分离过程中，物质既进入固定相，又进入流 动相，此过程称分配过程。无论哪一种层析法，在一定条 件下，物质在固定相和流动相达到平衡时，它在两相中平 均浓度的比值称分配系数(K)。 分配系数是由溶质的性质(分子大小、电荷、分子量等) 所决定的。不同的层析机制，其K值涵义不同。吸附层析 中，K值表示吸附平衡常数；分配层析中，表示分配系数； 离子交换层析中，表示交换常数；亲和层析中，表示亲和 常数。K值大表示其溶质在固定相中浓度大，在洗脱过程 中，溶质出现较晚。K值小表示其溶质在流动相中浓度大， 故在洗脱液中出现较早。 若两组分在同一条件下具有相似的K值，则表明两组 分层析峰重叠大，分离效果差。为达到分离目的，需重新 选择实验条件，包括层析方式和流动相的改变。
ห้องสมุดไป่ตู้
实际计算理论塔板数时，只要在层析图谱 上测出某组分的保留值和在一定纸速下相应的 峰宽，就可计算出在某一实验条件下的理论塔 板数的近似值，以衡量柱效。若要得到真正的 塔板数时，必需扣除未被固定相所占有的空间 死体积(如柱的接口、连接柱接口的管路体积) 和流动相为充满死体积时所需的时间，此时得 到的塔板数称为有效塔板数(neff)。故上述公 式可转化为：
层析中的常用术语
一、保留值(Retention Value)
保留值表示样品中各组分 在层析柱中停留时间的长短或 组分流出时所需流动相体积的 多少。它用来描述层析峰在层 析图上的位置(图3-1)
生物工程下游技术第七章_生物大分子的色谱分离和纯化
由分子扩散的阻碍情况； D—组分在流动相中的扩散系数。组份为气体或 液体时，分别以Dg或Dm表示；
B=2D
讨论：
分子量大的组分，Dg小，即B小
Dg 随柱温升高而增加，随柱压降低 而减小；
球状颗粒； 大分子量流 动相； 适当增加流 速； 短柱； 低温。
流动相分子量大，Dg小，即B小；
u增加，组份停留时间短，纵向扩散 小； （ B/u ）对于液相色谱，因Dm 较小， B项可勿略。
组分在固定相中物质的 量 ns csVs Vs k' k 组分在流动相中物质的 量 nm cmVm Vm
其中Vm、Vs分别为固定相和流动相的体积
k′也等于组分的调整保留时间与死时间或 调整保留体积与死体积的比值：
t ' R tR t 0 V ' R VR V 0 k' 或k ' t0 t0 V0 V0
系数小的组分，先离开蒸馏塔（色谱柱）， 分配系数大的组分后离开蒸馏塔（色谱 柱），从而使分配系数不同的组分彼此得 到分离。
（三）分离过程模拟图
（四）柱效能指标
对于一个色谱柱来说，其分离能力
（叫柱效能）的大小主要与塔板的数目
有关，塔板数越多，柱效能越高。
色谱柱的塔板数可以用理论塔板数和有效
塔板数来表示。
提取液）的石油醚倒入管中。
素，并可分别进行鉴定。色
谱法也由此而得名。
一、色谱分离基本原理：
在色谱法中存在两相，一相是固定不动 的，称作固定相；另一相则不断流过固定相， 称作流动相。 色谱法的分离原理就是利用待分离的
各种物质在两相中的分配系数、吸附能
力等亲和能力的不同来进行分离的。
（含样品的）流动相通过固定相表面，混
B=2D
讨论：
分子量大的组分，Dg小，即B小
Dg 随柱温升高而增加，随柱压降低 而减小；
球状颗粒； 大分子量流 动相； 适当增加流 速； 短柱； 低温。
流动相分子量大，Dg小，即B小；
u增加，组份停留时间短，纵向扩散 小； （ B/u ）对于液相色谱，因Dm 较小， B项可勿略。
组分在固定相中物质的 量 ns csVs Vs k' k 组分在流动相中物质的 量 nm cmVm Vm
其中Vm、Vs分别为固定相和流动相的体积
k′也等于组分的调整保留时间与死时间或 调整保留体积与死体积的比值：
t ' R tR t 0 V ' R VR V 0 k' 或k ' t0 t0 V0 V0
系数小的组分，先离开蒸馏塔（色谱柱）， 分配系数大的组分后离开蒸馏塔（色谱 柱），从而使分配系数不同的组分彼此得 到分离。
（三）分离过程模拟图
（四）柱效能指标
对于一个色谱柱来说，其分离能力
（叫柱效能）的大小主要与塔板的数目
有关，塔板数越多，柱效能越高。
色谱柱的塔板数可以用理论塔板数和有效
塔板数来表示。
提取液）的石油醚倒入管中。
素，并可分别进行鉴定。色
谱法也由此而得名。
一、色谱分离基本原理：
在色谱法中存在两相，一相是固定不动 的，称作固定相；另一相则不断流过固定相， 称作流动相。 色谱法的分离原理就是利用待分离的
各种物质在两相中的分配系数、吸附能
力等亲和能力的不同来进行分离的。
（含样品的）流动相通过固定相表面，混
层析分离技术
1903年，俄国植物学家Tsweet将CaCO3固体粉末装入竖
立的玻璃管中，从顶端倒入植物色素的石油醚浸出液，并用 石油醚连续地冲洗。结果在柱中出现了颜色不同的色带。因 此，Tsweet把这种方法称为色谱法。
2
色谱法的发展
在Tswett提出色谱概念后的20多年里没有人关注这一伟大的 发明。 1931年：德国的Kuhn和Lederer在Tswett实验的基础上用氧 化铝和碳酸钙分离了α-，β-，和γ-胡萝卜素，此后用这种方法分 离了60多种这类色素。 1940年：Martin和Synge提出液-液分配色谱法（LiquidLiquid Partion Chromatography）,即固定相是吸附在硅胶上的 水，流动相是某中有机溶剂。 1941年Martin和Synge提出用气体代替液体流动相的可能性。 1952年James和Martin发表了从理论到实践比较完整的气液 色谱方法（Gas-Liquid Chromatography），因而获得了1952年 的诺贝尔化学奖。 1957年Golay开创了开管柱气相色谱法（Open-Tubular Column Chromatography），习惯上称为毛细管气相色谱法 （Capillary Column Chromatography）。
交换树脂表面
操作方法
1.
离子交换剂的处理
2.
装柱及上样
装柱主要是防止出现气泡和分层，装填要
均匀。防止产生气泡和分层的方法是装柱 时柱内先保持一定高度的起始洗脱液(一 般为柱高的1/3)，加入树脂时使树脂借水 的浮力慢慢自然沉降。装柱完毕后，用水 或缓冲液平衡到所需的条件，如特定的 pH、离子强度等。
（4）按使用领域不同对色谱的分类：
①分析型色谱：主要用于各种样品的分析，其特点 是色谱柱较细，分析的样品量少。 ②制备型色谱：又可分为实验室用制备型色谱和工 业用大型制造纯物质的制备色谱。
立的玻璃管中，从顶端倒入植物色素的石油醚浸出液，并用 石油醚连续地冲洗。结果在柱中出现了颜色不同的色带。因 此，Tsweet把这种方法称为色谱法。
2
色谱法的发展
在Tswett提出色谱概念后的20多年里没有人关注这一伟大的 发明。 1931年：德国的Kuhn和Lederer在Tswett实验的基础上用氧 化铝和碳酸钙分离了α-，β-，和γ-胡萝卜素，此后用这种方法分 离了60多种这类色素。 1940年：Martin和Synge提出液-液分配色谱法（LiquidLiquid Partion Chromatography）,即固定相是吸附在硅胶上的 水，流动相是某中有机溶剂。 1941年Martin和Synge提出用气体代替液体流动相的可能性。 1952年James和Martin发表了从理论到实践比较完整的气液 色谱方法（Gas-Liquid Chromatography），因而获得了1952年 的诺贝尔化学奖。 1957年Golay开创了开管柱气相色谱法（Open-Tubular Column Chromatography），习惯上称为毛细管气相色谱法 （Capillary Column Chromatography）。
交换树脂表面
操作方法
1.
离子交换剂的处理
2.
装柱及上样
装柱主要是防止出现气泡和分层，装填要
均匀。防止产生气泡和分层的方法是装柱 时柱内先保持一定高度的起始洗脱液(一 般为柱高的1/3)，加入树脂时使树脂借水 的浮力慢慢自然沉降。装柱完毕后，用水 或缓冲液平衡到所需的条件，如特定的 pH、离子强度等。
（4）按使用领域不同对色谱的分类：
①分析型色谱：主要用于各种样品的分析，其特点 是色谱柱较细，分析的样品量少。 ②制备型色谱：又可分为实验室用制备型色谱和工 业用大型制造纯物质的制备色谱。
第七章层析
tR′ = tR - t0 ⑥校正保留体积VR′ 扣除死体积后的保留体积称为校
正保留体积（或调整保留体积）；其定义式为：
VR′ = VR–V0
VR′与tR′之间的关系为：
VR′ = tR′ Fc
死体积V0反映了色谱柱的几何特性，它与被测物质的性
质无关。保留体积VR中扣除死体积V0后，即校正保留体积
VR′，将更合理地反映被测组分的保留特点。
第一节 层析的基本原理及分类
2．阻滞因数或比移值Rf
在色谱柱（纸、板）中，溶质的移动速度与流动相的移 动速度之比，称为阻滞因数或比移值Rf，其定义式可写为：
R f 溶 质 （ 流 浓 动 度 相 中 的 心 移 ） 动 的 速 移 度 动 速 度 在 同 溶 一 质 时 （ 间 浓 流 度 动 中 相 心 前 ） 沿 的 的 移 移 动 动 距 距 离 离 ( r ) ( R )
分离度R综合考虑了保留值的差值与峰宽两方面的因素
对柱效率的影响，可衡量色谱柱的总分离效能。
第一节 层析的基本原理及分类
根据分离度R的大小可 以判断被物质在色谱柱中
的分离情况；R值越大，两
色谱峰的距离越远，分离 效果就越好，如图7-5所示。 当R<1时，两峰有部分重叠； 当R = 1时，两峰有98%的 分离；当R = 1.5时，分离 程度可达99.7%；一般用R = 1.5作为相邻两峰完全分 离的标志。
第一节 层析的基本原理及分类
2．固定相的形状
根据固定相或层析装置形状的不同，液相层析法又分纸 层 析 法 ( Paper chromatography)、 薄 层 层 析 法 ( Thin—1ayer chromatography)和柱层析法(Column chromatography)。纸层 析和薄层层析多用于分析目的，而柱层析易于放大，适用于 大量制备分离，是主要的层析分离手段。
层析分离技术图文
水处理中的有机物去除
利用层析分离技术，如活性炭吸附、 聚合物吸附等，可去除水中的有机污 染物，提高水质，保障饮用水安全。
05
层析分离技术的未来发展与挑战
新材料与新技术的研究与应用
新型吸附剂
研究具有高选择性、高吸附容量的新型吸附剂，以提高层析分离 的选择性和效率。
新型固定相
探索具有优异性能的新型固定相，以适应不同分离需求和条件。
层析分离技术图文
• 层析分离技术概述 • 层析分离技术的分类 • 层析分离技术的操作流程 • 层析分离技术的应用实例 • 层析分离技术的未来发展与挑战
01
层析分离技术概述
定义与原理
定义
层析分离技术是一种基于不同物质在 两相中的分配系数不同而实现分离的 物理分离方法。
原理
利用流动相和固定相的相互作用，使 混合物中的各组分在固定相和流动相 之间进行吸附、脱附、溶解、挥发等 过程，从而实现各组分的分离。
上样量控制
控制上样量，确保样品在柱子上得 到有效分离。
洗脱
洗脱液选择
根据分离需求选择合适的洗脱液，如有机溶剂、缓冲液等。
洗脱方式
采用适当的洗脱方式，如分段洗脱、梯度洗脱等。
洗脱速度控制
调节洗脱速度，确保样品得到充分分离。
检测与收集
检测方式
01
根据待分离组分的性质选择合适的检测方式，如紫外可见光谱、
纳米技术
利用纳米材料和纳米技术，开发具有高分离性能的纳米尺度层析分 离材料。
提高分离效率与分辨率
优化分离条件
深入研究层析分离的原理和动力 学过程，优化分离条件，提高分 离效率和分辨率。
联用技术
将层析分离与其他分离技术联用， 实现多维分离，进一步提高分离 效果。
利用层析分离技术，如活性炭吸附、 聚合物吸附等，可去除水中的有机污 染物，提高水质，保障饮用水安全。
05
层析分离技术的未来发展与挑战
新材料与新技术的研究与应用
新型吸附剂
研究具有高选择性、高吸附容量的新型吸附剂，以提高层析分离 的选择性和效率。
新型固定相
探索具有优异性能的新型固定相，以适应不同分离需求和条件。
层析分离技术图文
• 层析分离技术概述 • 层析分离技术的分类 • 层析分离技术的操作流程 • 层析分离技术的应用实例 • 层析分离技术的未来发展与挑战
01
层析分离技术概述
定义与原理
定义
层析分离技术是一种基于不同物质在 两相中的分配系数不同而实现分离的 物理分离方法。
原理
利用流动相和固定相的相互作用，使 混合物中的各组分在固定相和流动相 之间进行吸附、脱附、溶解、挥发等 过程，从而实现各组分的分离。
上样量控制
控制上样量，确保样品在柱子上得 到有效分离。
洗脱
洗脱液选择
根据分离需求选择合适的洗脱液，如有机溶剂、缓冲液等。
洗脱方式
采用适当的洗脱方式，如分段洗脱、梯度洗脱等。
洗脱速度控制
调节洗脱速度，确保样品得到充分分离。
检测与收集
检测方式
01
根据待分离组分的性质选择合适的检测方式，如紫外可见光谱、
纳米技术
利用纳米材料和纳米技术，开发具有高分离性能的纳米尺度层析分 离材料。
提高分离效率与分辨率
优化分离条件
深入研究层析分离的原理和动力 学过程，优化分离条件，提高分 离效率和分辨率。
联用技术
将层析分离与其他分离技术联用， 实现多维分离，进一步提高分离 效果。
《层析分离技术》课件
总结与展望
1 优势和局限性
层析分离技术具有高效、可靠、灵活等优势，但也存在一些局限性。
2 发展趋势
层析分离技术在分离纯化效果、自动化程度和快速分析方面的发展具有很大潜力。
层析分离技术的应用
1
蛋白质纯化技术
层析分离技术在蛋白质纯化过程中起到关键作用，实现高效的纯化和分离。
2
生物大分子制备
层析分离技术被广泛应用于生物大分子的制备过程，如核酸提取和多肽纯化。
3
制药过程中的应用
总站式层析技术在制药过程中用于分离和纯化药物及其他有关的化合物。
4
其他应用领域
层析分离技术还在食品工业、环境监测等领域得到广泛应用。
应用
层析分离技术广泛应用于蛋白质纯化、生物大分子制备等领域。
层析分离技术的基本原理
1 分子相互作用
层析分离技术基于分子之 间的相互作用，如电荷、 亲疏水性等。
2 物质分子分配系数
物质分子在不同相之间的 分配系数决定了其分离程 度。
3ห้องสมุดไป่ตู้层析柱构成要素
层析柱由填料、梯度溶剂 和流动相等要素构成，起 到分离和纯化作用。
层析分离技术的分类
分离机理
按照分离机理，层析 分离技术可分为吸附 层析、分配层析和离 子交换层析。
层状介质特性
根据层状介质的特性， 可将层析分离技术分 为薄层层析、柱层析 和高效液相层析。
介质形态
介质形态包括液态层 析、凝胶层析和纤维 素层析等。
操作方式
操作方式包括亲和层 析、吸附剂层析和凝 胶过滤层析等。
《层析分离技术》PPT课 件
层析分离技术是一种基于分子之间相互作用的分离技术，通过物质分子在不 同相之间的分配系数实现分离和纯化的方法。
层析分离技术
层析分离技术层析分离技术是一种重要的分离方法，广泛应用于化学、生物、环境等领域。
它基于物质在不同相之间的分配差异，通过多次分配和分离步骤，将混合物中的组分分离开来。
本文将从层析分离技术的原理、类型和应用方面进行介绍。
一、层析分离技术的原理层析分离技术基于物质在不同相中的分配差异，利用不同相中物质的亲疏水性、极性、分子尺寸等特性进行分离。
其原理可以概括为：当混合物通过固定相（静相）时，不同组分会因其与固定相的相互作用力不同而以不同速度通过固定相，从而实现分离。
1. 柱层析：柱层析是最常见的层析分离技术，其主要包括液相层析和气相层析两种形式。
液相层析是在液相中进行分离，常见的有凝胶层析、离子交换层析、亲和层析等；气相层析则是在气相中进行分离，常见的有气相色谱层析、气体吸附层析等。
2. 纸层析：纸层析是一种简单易行的层析分离方法，主要用于分离和鉴定有机化合物。
通过将样品溶液滴到纸上，然后在纸的一端浸入溶剂中，溶剂在纸上上升时，样品中的组分会因其与纸或溶剂的相互作用力不同而以不同速度迁移，从而实现分离。
3. 薄层层析：薄层层析是将样品溶液均匀涂布在薄层层析板上，然后将其浸入溶剂中进行分离。
薄层层析具有操作简便、分离效果好的特点，广泛应用于药物分析、天然产物分离等领域。
三、层析分离技术的应用1. 生物化学：层析分离技术在生物化学研究中得到广泛应用，如蛋白质纯化、核酸提取、酶活性分析等。
2. 药物分析：层析分离技术是药物分析中常用的方法之一，可以用于药物的纯化和分离、药物代谢产物的分析等。
3. 环境监测：层析分离技术可以用于环境中有机物、无机物和杂质的分离和测定，如水质检测、土壤污染分析等。
4. 食品安全：层析分离技术在食品安全领域也有广泛应用，可以用于食品中有害物质的检测和分离，如农药残留、重金属含量等。
层析分离技术作为一种重要的分离方法，具有原理简单、分离效果好、应用广泛的特点。
通过不同类型的层析分离技术，可以实现对混合物中不同组分的高效分离和纯化。
蛋白质化学中的层析技术
采用离子强度较大的梯度洗脱 选用粗而短的柱子为宜。因为当柱上洗 脱液的离子强度高到足以完全取代被吸附的离 子时，这些被臵换的离子则以同洗脱液等 速率从柱上向下移动，如果柱细长，即从 脱附到流出之间的距离长，使脱附的离子扩散 的机会增加，结果造成分离峰过宽，降低分辨 率。用交联葡聚糖离子交换剂和纤维素离子交 换剂时，常用的柱高为15～20cm。
荷间的相互作用，进而达到分离纯化的 目的。
高分子聚合物基质、配基和平衡离子
平衡离子是结合于配基上的相 反离子，它能与溶液中其它的离 子基团发生可逆的交换反应。 阳离子交换剂：平衡离子带正 电的离子交换剂，能与带正电的 离子基团发生交换作用
阴离子交换剂：平衡离子带负 电的离子交换剂，与带负电的离 子基团发生交换作用
结构
-OSO3H -(CH2) nSO3H -OPO3H2 -(CH2) nCOOH 2(CH2) nN+ H(C2H5)2 2(CH2) n-2N+ ≡(R)3
pK
<2 <2 < 2和6 3.5-4.2 8.159.15 >9
分类
强酸 强酸 中等酸 性 弱酸 弱碱 强碱
简称
S SM(n = 1) ，SE(n = 2) ， SP(n = 3) ，SB(n = 4) P CM(n = 1) DEAE(n = 2) Q ，QAE
度进行洗脱，相对的选择性较高
四、基本操作
离子交换剂的选择
缓冲液的选择
层析柱的选择
↑
离子交换剂的处理
↓
↓ 洗脱 ← 洗脱流速 ↓ 洗脱液的监测收
集及组分鉴定
加样
离子交换剂的清洗、 再生和保存
↓
1、离子交换剂的选择
层析分离技术.
Ft V R R •=m s m s V V K q q k =='b u 色层分离技术色层分离：是一组相关技术的总称，也称为色谱分离或层析分离。
按固定相的基质（载体）类型分类：层析：载体一般为软基质的凝胶，常用的有纤维素、琼脂糖、交联葡聚糖、交联琼脂糖、聚丙烯酰胺凝胶等，只适合在低压下操作。
色谱：载体一般为高强度的经过表面该性的硅胶、聚甲基丙烯酸或聚苯乙烯材料，适合在高压下使用。
也有人将层析称为色谱。
用途：用在产品的精制阶段，目标是获得合乎使用要求的产品。
层析：一般用于生物大分子或酶的批量纯化。
高压液相色谱：具有生物活性的小分子物质的分离纯化。
色层分离过程包含两部分：●固定相：载体或载体+功能基团●流动相（洗脱液）：缓冲液或有机溶剂 对于高压液相色谱和低压层析，操作模式有很大区别。
液相色谱的基本原理和参数●保留时间(t R )和保留体积(V R )从进样开始到后来出现样品的浓度极大值所需的时间为保留时间，用t R 表示。
在这段时间内冲洗剂（流动相）流过的体积为保留体积，用V R 表示。
理论塔板数的计算公式为：2)(σRt N =容量因子k ' 和平衡常数K某物质的k '定义为在分配平衡时该物质在两相中绝对量之比。
而平衡常数K 为平衡时，物质在两相的浓度比：)()('m s q q k 物质在流动相的量物质在固定相的量=)/)/(m m s s V q V q K 物质在流动相的浓度（物质在固定相的浓度= Vs 和Vm 分别为柱内固定相和流动相所占的体积。
于是有 溶质在固定相停留的时间分数= '1'k k q q q m s s +=+ 溶质在流动相停留的时间分数'11k q q q m s m +=+= 在柱内溶质只有转移到流动相时才能沿柱的方向向前移动，所以对于一个在柱内有保留的溶质，其谱带移动速度( )总是小于流动相的移动速度( )，而等于流动相的移动速度与该谱带对应的溶质在流动相停留的时间分数之积：)'11(k u u m b += 而当柱长一定时，溶质谱带的移动速度和流动相的移动速度与它们通过柱子所花费的时间成反比： Ro R m b t t u u = )'1(0k t t R R += 当柱外死体积可忽略不计时，m R V V =0 s m m m R KV V k V V V +=+='0'0001'R R R R R R R t t t t t t t k =-=-= 柱效率： 塔板高度（H ）和塔板数（N ）是衡量色谱柱效率的两个重要指标。
层析理论及技术
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凝胶柱的选择
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凝胶的前处理
a. 溶胀：称取适量凝胶干粉，用约10倍蒸馏水 浸泡24小时以上，待凝胶充分溶胀后，倾去 上层悬浮物及蒸馏水。 b. 碱洗：用0.5 M NaOH 溶液浸泡半个小时，然 后用蒸馏水洗至中性。 c. 酸洗：用0.5 M HCl 溶液浸泡半个小时，然 后用蒸馏水洗至中性。 d. 平衡：用起始缓冲液浸泡凝胶，直至凝胶液 pH与起始缓冲液相同。
根据层析分离机制
根据操作形式不同
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按层析过程的机理分类：
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离子交换层析法原理
利用离子交换剂对各种离子的亲和力不同。 特点：利用带有相反电荷的颗粒之间具有 引力作用 固定相：带有大量电荷的离子交换剂 流动相：具有一定pH值和一定离子强度的 电解质溶液 常采用柱层析 洗脱方法：增加离子强度、改变pH值。
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上柱、洗脱、收集
a. 如图装好层析装置，打开下端出 口，使溶液流出至刚好达到凝胶 胶面 b. 沿柱壁缓慢加入2ml样品，打开下 端出口，使样品溶液流出至刚好 达到凝胶胶面，再取少量起始缓 冲液洗涤柱壁。 c. 打开起始缓冲液阀门，连续洗脱。 d. 用自动部分收集器自动或手动收 集，合并同一高峰各管。
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装柱
a. 将层析柱垂直固定，加入适 量溶剂排走空气。 b. 将平衡好的凝胶搅匀，连续 倾入柱中，待其自然沉降至 1/4~1/3高时打开下端出口， 让溶剂慢慢流出，继续侵入 凝胶至沉降到所需高度。装 柱时要注意操作压。 c. 用3-5倍柱床体积的起始缓冲 液走柱，使交换剂充分平衡， 柱床稳定。