层析分离技术.
层析分离法
层析分离法《层析分离法》是一项重要的实验分析技术，它可以用来分离和鉴定物质，这种技术被广泛应用于化学分析领域，被用于分离，鉴定和测定物质的组成成分和反应产物。
种技术已被广泛应用在食品、药品安全检测，环境污染监测以及材料表征等领域，因其分离准确、选择性强以及分析时间短等优点，在分析领域具有重要的地位和价值。
层析分离法的基本原理是利用空间分离原理，将能够在特定空间内运动的物质分离出来。
它的空间分离原理是基于物质不同的流体性能，将物质经过预先混合的流体层，然后在某一特定的体积内分道扬镳，从而实现物质的分离。
析分离技术可以有效地分离物质，使得混合物中的组分被完全分离，这种分离准确度非常高，可以达到99%以上，且可以在实验条件下进行重复性实验，更容易获得准确的结果。
层析分离法的基本工艺流程是：先将原料溶液进行调节，利用离子交换和混合，然后将上述溶液注入层析柱中，利用不同流体在层析柱中的运动特性，分离出混合物中的组分，然后使用检测仪器进行定量或定性分析。
在层析分离法分离鉴定时，可以根据不同分析需要，选取不同的柱材料和溶剂，以实现不同的分离结果。
比如，选择极性分子容易沉淀的柱材料和溶剂，可以有效地实现有机物的选择性分离。
另一方面，将非常稳定的离子溶剂和非极性柱材料结合应用，可以有效地实现无机盐类混合物的分离及鉴定。
层析分离法有一定的局限性，最主要的限制是柱材料的种类有限，而且这种方法只能分离出混合物中较大的分子，而小分子可能无法有效地分离出来。
此外，由于溶剂的不稳定性，柱材料的运动可能会受到影响，导致测定结果的不准确。
总之，层析分离法是一种广泛应用的实验分析技术，它的优点是分离准确、选择性强以及分析时间短，可以用于分离，鉴定和测定物质的组成成分和反应产物。
但是，这种技术也有一定的局限性，比如柱材料种类有限，溶剂的不稳定性等。
所以，在应用层析分离技术时，要根据实际分析需要，综合考虑和选择合适的材料，确保测定的准确性。
层析分离技术
4.2 吸附层析
吸附层析（Adsorption Chromatography ）是以吸附剂 为固定相，根据待分离物与吸附剂之间吸附力不同而 达到分离目的的一种层析技术。
按吸附剂和吸附物之间的作用力不同，吸附可分为三 种类型： 物理吸附：范德华力，吸附解吸速度快，选择性较差 化学吸附：生成化学键，达到平衡慢，选择性较好 交换吸附：极性分子或离子之间发生交换吸附…….
的活性物质提取分离，如维生素B12、四环素、土霉 素等，还可用于污水处理、糖浆脱色等。
大孔吸附树脂的选择和使用
选择依据： 吸附剂及吸附物的极性
一般来说，非极性吸附剂易从极性溶剂中吸附非极性 物质；极性吸附剂易从非极性溶剂中吸附极性物质； 中等极性的吸附剂对上述两种情况都具有吸附能力。 吸附物质的大小 吸附物分子较大的，应选择大孔树脂中孔径大的。
常用吸附剂按其化学结构可分两类
有机吸附剂，如：活性炭、纤维素、大孔吸附 树脂、聚酰胺等
无机吸附剂，如：硅胶、氧化铝、硅酸镁、硅 藻土、羟基磷灰石等
常用吸附剂简介
硅胶 是一种极性吸附剂，又是一种弱酸性阳离子交换
剂，其表面上的硅醇基能释放弱酸性的氢离子， 遇较强碱性化合物，则可因离子交换反应而吸附 碱性化合物； 应用于萜类、固醇、生物碱、酸性化合物、磷脂、 脂肪、氨基酸等的吸附分离。
HA的吸附机理
HA机理的主要观点是：HA的Ca2+和生物分子表 面的负电荷基团的结合，对生物分子的分离起重 要作用；而HA的磷酸基团与生物分子表面的正 电荷基团的结合，则起次要作用。
大孔吸附树脂
特点 大孔型颗粒，其孔隙、骨架结构和极性可按需要选
层析分离技术
立的玻璃管中，从顶端倒入植物色素的石油醚浸出液，并用 石油醚连续地冲洗。结果在柱中出现了颜色不同的色带。因 此，Tsweet把这种方法称为色谱法。
2
色谱法的发展
在Tswett提出色谱概念后的20多年里没有人关注这一伟大的 发明。 1931年：德国的Kuhn和Lederer在Tswett实验的基础上用氧 化铝和碳酸钙分离了α-，β-，和γ-胡萝卜素，此后用这种方法分 离了60多种这类色素。 1940年：Martin和Synge提出液-液分配色谱法（LiquidLiquid Partion Chromatography）,即固定相是吸附在硅胶上的 水，流动相是某中有机溶剂。 1941年Martin和Synge提出用气体代替液体流动相的可能性。 1952年James和Martin发表了从理论到实践比较完整的气液 色谱方法（Gas-Liquid Chromatography），因而获得了1952年 的诺贝尔化学奖。 1957年Golay开创了开管柱气相色谱法（Open-Tubular Column Chromatography），习惯上称为毛细管气相色谱法 （Capillary Column Chromatography）。
交换树脂表面
操作方法
1.
离子交换剂的处理
2.
装柱及上样
装柱主要是防止出现气泡和分层，装填要
均匀。防止产生气泡和分层的方法是装柱 时柱内先保持一定高度的起始洗脱液(一 般为柱高的1/3)，加入树脂时使树脂借水 的浮力慢慢自然沉降。装柱完毕后，用水 或缓冲液平衡到所需的条件，如特定的 pH、离子强度等。
（4）按使用领域不同对色谱的分类：
①分析型色谱：主要用于各种样品的分析，其特点 是色谱柱较细，分析的样品量少。 ②制备型色谱：又可分为实验室用制备型色谱和工 业用大型制造纯物质的制备色谱。
层析分离技术图文
利用层析分离技术，如活性炭吸附、 聚合物吸附等，可去除水中的有机污 染物，提高水质，保障饮用水安全。
05
层析分离技术的未来发展与挑战
新材料与新技术的研究与应用
新型吸附剂
研究具有高选择性、高吸附容量的新型吸附剂，以提高层析分离 的选择性和效率。
新型固定相
探索具有优异性能的新型固定相，以适应不同分离需求和条件。
层析分离技术图文
• 层析分离技术概述 • 层析分离技术的分类 • 层析分离技术的操作流程 • 层析分离技术的应用实例 • 层析分离技术的未来发展与挑战
01
层析分离技术概述
定义与原理
定义
层析分离技术是一种基于不同物质在 两相中的分配系数不同而实现分离的 物理分离方法。
原理
利用流动相和固定相的相互作用，使 混合物中的各组分在固定相和流动相 之间进行吸附、脱附、溶解、挥发等 过程，从而实现各组分的分离。
上样量控制
控制上样量，确保样品在柱子上得 到有效分离。
洗脱
洗脱液选择
根据分离需求选择合适的洗脱液，如有机溶剂、缓冲液等。
洗脱方式
采用适当的洗脱方式，如分段洗脱、梯度洗脱等。
洗脱速度控制
调节洗脱速度，确保样品得到充分分离。
检测与收集
检测方式
01
根据待分离组分的性质选择合适的检测方式，如紫外可见光谱、
纳米技术
利用纳米材料和纳米技术，开发具有高分离性能的纳米尺度层析分 离材料。
提高分离效率与分辨率
优化分离条件
深入研究层析分离的原理和动力 学过程，优化分离条件，提高分 离效率和分辨率。
联用技术
将层析分离与其他分离技术联用， 实现多维分离，进一步提高分离 效果。
《层析分离技术》课件
总结与展望
1 优势和局限性
层析分离技术具有高效、可靠、灵活等优势，但也存在一些局限性。
2 发展趋势
层析分离技术在分离纯化效果、自动化程度和快速分析方面的发展具有很大潜力。
层析分离技术的应用
1
蛋白质纯化技术
层析分离技术在蛋白质纯化过程中起到关键作用，实现高效的纯化和分离。
2
生物大分子制备
层析分离技术被广泛应用于生物大分子的制备过程，如核酸提取和多肽纯化。
3
制药过程中的应用
总站式层析技术在制药过程中用于分离和纯化药物及其他有关的化合物。
4
其他应用领域
层析分离技术还在食品工业、环境监测等领域得到广泛应用。
应用
层析分离技术广泛应用于蛋白质纯化、生物大分子制备等领域。
层析分离技术的基本原理
1 分子相互作用
层析分离技术基于分子之 间的相互作用，如电荷、 亲疏水性等。
2 物质分子分配系数
物质分子在不同相之间的 分配系数决定了其分离程 度。
3ห้องสมุดไป่ตู้层析柱构成要素
层析柱由填料、梯度溶剂 和流动相等要素构成，起 到分离和纯化作用。
层析分离技术的分类
分离机理
按照分离机理，层析 分离技术可分为吸附 层析、分配层析和离 子交换层析。
层状介质特性
根据层状介质的特性， 可将层析分离技术分 为薄层层析、柱层析 和高效液相层析。
介质形态
介质形态包括液态层 析、凝胶层析和纤维 素层析等。
操作方式
操作方式包括亲和层 析、吸附剂层析和凝 胶过滤层析等。
《层析分离技术》PPT课 件
层析分离技术是一种基于分子之间相互作用的分离技术，通过物质分子在不 同相之间的分配系数实现分离和纯化的方法。
层析分离技术
层析分离技术层析分离技术是一种重要的分离方法，广泛应用于化学、生物、环境等领域。
它基于物质在不同相之间的分配差异，通过多次分配和分离步骤，将混合物中的组分分离开来。
本文将从层析分离技术的原理、类型和应用方面进行介绍。
一、层析分离技术的原理层析分离技术基于物质在不同相中的分配差异，利用不同相中物质的亲疏水性、极性、分子尺寸等特性进行分离。
其原理可以概括为：当混合物通过固定相（静相）时，不同组分会因其与固定相的相互作用力不同而以不同速度通过固定相，从而实现分离。
1. 柱层析：柱层析是最常见的层析分离技术，其主要包括液相层析和气相层析两种形式。
液相层析是在液相中进行分离，常见的有凝胶层析、离子交换层析、亲和层析等；气相层析则是在气相中进行分离，常见的有气相色谱层析、气体吸附层析等。
2. 纸层析：纸层析是一种简单易行的层析分离方法，主要用于分离和鉴定有机化合物。
通过将样品溶液滴到纸上，然后在纸的一端浸入溶剂中，溶剂在纸上上升时，样品中的组分会因其与纸或溶剂的相互作用力不同而以不同速度迁移，从而实现分离。
3. 薄层层析：薄层层析是将样品溶液均匀涂布在薄层层析板上，然后将其浸入溶剂中进行分离。
薄层层析具有操作简便、分离效果好的特点，广泛应用于药物分析、天然产物分离等领域。
三、层析分离技术的应用1. 生物化学：层析分离技术在生物化学研究中得到广泛应用，如蛋白质纯化、核酸提取、酶活性分析等。
2. 药物分析：层析分离技术是药物分析中常用的方法之一，可以用于药物的纯化和分离、药物代谢产物的分析等。
3. 环境监测：层析分离技术可以用于环境中有机物、无机物和杂质的分离和测定，如水质检测、土壤污染分析等。
4. 食品安全：层析分离技术在食品安全领域也有广泛应用，可以用于食品中有害物质的检测和分离，如农药残留、重金属含量等。
层析分离技术作为一种重要的分离方法，具有原理简单、分离效果好、应用广泛的特点。
通过不同类型的层析分离技术，可以实现对混合物中不同组分的高效分离和纯化。
9种层析分离纯化方法详解
9种层析分离纯化方法详解层析法是利用不同物质理化性质的差异而建立起来的技术。
所有的层析系统都由两个相组成：一是固定相，它或者是固体物质或者是固定于固体物质上的成分；另一是流动相，即可以流动的物质，如水和各种溶媒。
当待分离的混合物随溶媒（流动相）通过固定相时，由于各组份的理化性质存在差异，与两相发生相互作用（吸附、溶解、结合等）的能力不同，在两相中的分配（含量对比）不同，而且随溶媒向前移动，各组份不断地在两相中进行再分配。
与固定相相互作用力越弱的组份，随流动相移动时受到的阻滞作用小，向前移动的速度快。
反之，与固定相相互作用越强的组份，向前移动速度越慢。
分部收集流出液，可得到样品中所含的各单一组份，从而达到将各组份分离的目的。
按层析原理可将层析分为以下9种：1、亲和层析利用待分离物质和它的特异性配体间具有特异的亲和力，从而达到分离的目的。
将可亲和的一对分子中的一方以共价键形式与不溶性载体相连作为固定相吸附剂，当含混合组分的样品通过此固定相时，只有和固定相分子有特异亲和力的物质，才能被固定相吸附结合，性无关组分随流动相流出。
改变流动相组分，可将结合的亲和物洗脱下来。
亲和层析中所用的载体称为基质，与基质共价连接的化合物称配基。
具有专一亲和力的生物分子对主要有：抗原与抗体，DNA与互补DNA或RNA，酶与底物、激素与受体、维生素与特异结合蛋白、糖蛋白与植物凝集素等。
亲和层析可用于纯化生物大分子、稀释液的浓缩、不稳定蛋白质的贮藏、分离核酸等。
亲和层析纯化的分离原理特点：亲和层析具有高选择性、高纯度、快速、浓缩等特点，在重组蛋白的分离中多作为第一步的粗纯，实现对绝大部分杂质蛋白的去除。
2、离子交换层析采用具有离子交换性能的物质作固定相，利用它与流动相中的离子能进行可逆交换的性质来分离离子型化合物的方法。
主要用于分离氨基酸、多肽及蛋白质，也可用于分离核酸、核苷酸及其他带电荷的生物分子。
不同蛋白质的等电点（pI，isoelectric point）特性，使在不同pH缓冲液条件下所带正/负净电荷不同，选择不同的离子交换柱实现分离。
层析的原理和应用
层析的原理和应用1. 层析的概念和基本原理层析（Chromatography）是一种将混合物中的组分分离和提纯的技术方法。
它基于组分之间在固定相和流动相之间的相互作用力的不同，使各种组分在系统中以不同速度迁移，达到分离的目的。
层析技术广泛应用于化学、生物、环境等领域。
层析技术的基本原理是利用流动相在固定相上的移动来实现物质的分离。
固定相通常是具有一定吸附性或分配性的材料，如硅胶、纸张、亲水性基质等。
流动相则是将待分离的混合物溶解在溶剂中，通过与固定相的相互作用，使各组分在固定相上以不同速率迁移。
2. 层析技术的分类和应用层析技术根据其基本原理和操作方式的不同，可以分为多种类型。
以下是其中几种常见的层析技术及其应用：2.1 薄层层析法（TLC）薄层层析法是一种在薄层材料上进行的层析技术。
常用的薄层材料包括硅胶和氧化铝等。
它具有简单、快速、经济的特点，广泛应用于药物分析、食品安全检测、环境监测等领域。
2.2 柱层析法柱层析法是将固定相填充在柱中，通过流动相沿着柱内固定相的分布，实现各组分的分离。
根据固定相的不同，柱层析法又可分为凝胶柱层析和高效液相层析等。
柱层析法在药物分离纯化、天然产物提取、有机合成等领域具有广泛应用。
2.3 气相层析法（GC）气相层析法是将待分离的混合物蒸发为气体状态，通过在柱中固定相的分离，最终使各组分在检测器上进行定性和定量分析。
气相层析法广泛应用于石油化学、环境监测、食品安全等领域。
2.4 液相层析法（LC）液相层析法是将待分离混合物溶解于液相，在柱中利用固定相进行分离。
液相层析法根据流动相的不同，可分为常压液相层析和高效液相层析等。
液相层析法在制药、生物、环保等领域具有广泛应用。
2.5 离子层析法（IC）离子层析法是利用不同组分之间的化学亲合性进行分离的一种层析技术。
它广泛应用于水质分析、环境监测、生物学研究等领域，尤其是对离子的分析具有很高的选择性和灵敏度。
3. 层析技术的优点和局限性层析技术具有许多优点，使其成为众多分析方法中的重要手段。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
Ft V R R •=m s m s V V K q q k =='b u 色层分离技术色层分离：是一组相关技术的总称，也称为色谱分离或层析分离。
按固定相的基质（载体）类型分类：层析：载体一般为软基质的凝胶，常用的有纤维素、琼脂糖、交联葡聚糖、交联琼脂糖、聚丙烯酰胺凝胶等，只适合在低压下操作。
色谱：载体一般为高强度的经过表面该性的硅胶、聚甲基丙烯酸或聚苯乙烯材料，适合在高压下使用。
也有人将层析称为色谱。
用途：用在产品的精制阶段，目标是获得合乎使用要求的产品。
层析：一般用于生物大分子或酶的批量纯化。
高压液相色谱：具有生物活性的小分子物质的分离纯化。
色层分离过程包含两部分：●固定相：载体或载体+功能基团●流动相（洗脱液）：缓冲液或有机溶剂 对于高压液相色谱和低压层析，操作模式有很大区别。
液相色谱的基本原理和参数●保留时间(t R )和保留体积(V R )从进样开始到后来出现样品的浓度极大值所需的时间为保留时间，用t R 表示。
在这段时间内冲洗剂（流动相）流过的体积为保留体积，用V R 表示。
理论塔板数的计算公式为：2)(σRt N =容量因子k ' 和平衡常数K某物质的k '定义为在分配平衡时该物质在两相中绝对量之比。
而平衡常数K 为平衡时，物质在两相的浓度比：)()('m s q q k 物质在流动相的量物质在固定相的量=)/)/(m m s s V q V q K 物质在流动相的浓度（物质在固定相的浓度= Vs 和Vm 分别为柱内固定相和流动相所占的体积。
于是有 溶质在固定相停留的时间分数= '1'k k q q q m s s +=+ 溶质在流动相停留的时间分数'11k q q q m s m +=+= 在柱内溶质只有转移到流动相时才能沿柱的方向向前移动，所以对于一个在柱内有保留的溶质，其谱带移动速度( )总是小于流动相的移动速度( )，而等于流动相的移动速度与该谱带对应的溶质在流动相停留的时间分数之积：)'11(k u u m b += 而当柱长一定时，溶质谱带的移动速度和流动相的移动速度与它们通过柱子所花费的时间成反比： Ro R m b t t u u = )'1(0k t t R R += 当柱外死体积可忽略不计时，m R V V =0 s m m m R KV V k V V V +=+='0'0001'R R R R R R R t t t t t t t k =-=-= 柱效率： 塔板高度（H ）和塔板数（N ）是衡量色谱柱效率的两个重要指标。
塔板高度（H ）：在某一段柱长范围内溶质在固定相和流动相之间达到分配平衡，这段柱长就相当于一个理论塔板的高度(HETP 或H)。
理论塔板数的计算公式为： 式中R t 为标准偏差。
理论塔板高度为： 式中， L − 柱长。
m u 2)(σR t N =L H =m R V V =00'0001'RR R R R R R t t t t t t t k =-=-=塔板高度小，塔板数高，色谱分离效率高。
●影响柱效的因素（1）理论塔板高度随填料粒度减少而减少；（2）在一定范围内流速减小有利于提高柱效；（3）减少冲洗剂粘度或提高柱温有利于柱高减小；（4）分子量较小的样品分子柱高较小。
色层分离的类型●凝胶筛分●离子交换●反向色谱●疏水色谱（层析）●亲合色谱（层析）凝胶过滤层析（体积排阻色谱）Gel filtration chromatography,GFCSize exclusion chromatograpy，SEC是一种纯粹按照溶质分子在溶液中的体积大小进行分离的层析技术。
应用：主要用于蛋白质等生物大分子的分级分离和除盐。
一般用作原料液的初分离，获取几个不同分子量物质分级，供进一步分离纯化使用。
●分离原理：含有不同分子大小的样品进入色谱柱（层析柱）后，较大的分子不能通过孔道扩散进入填料颗粒（凝胶珠体）内部，而与流动相一起先流出色谱柱（层析柱）。
较小的分子可通过部分孔道、更小的分子可通过任意孔道扩散进入颗粒（珠体）内部。
这种颗粒内部扩散的结果，使小分子沿柱流动的速度减慢，使混合样品中不同的分子按分子大小的顺序流出色谱柱（层析柱）从而达到分离的目的。
●凝胶过滤介质：良好的凝胶过滤介质应满足如下要求：（1）亲水性高，表面惰性，即介质与溶质之间不发生任何化学或物理相互作用；蛋白质的分级和除盐效果只与溶质的相对分子量、分子形状和凝胶结构（孔径分布）有关，与所用洗脱液的pH值和离子强度等物性无关。
（2）稳定性强，在较宽的pH和离子强度范围以及化学试剂中保持稳定，使用寿命长；（3）具有一定的孔径分布范围；（4）机械强度高，允许较高的操作压力。
常用的分离介质●天然及高分子介质经常使用的是葡聚糖凝胶（Sephadex）、琼脂糖（Sepharose）、琼脂糖与葡聚糖接枝而成的复合凝胶（Superdex）以及聚丙烯酰胺类和聚乙烯醇类合成凝胶（TSKgel）。
（一）交联葡聚糖凝胶（Sephadex）⑴Sephadex G 交联葡聚糖的商品名为Sephadex，不同规格型号的葡聚糖用英文字母G表示，G 后面的阿拉伯数为凝胶得水值的10倍。
例如，G-25为每克凝胶膨胀时吸水2.5克，同样G-200克每克千胶吸水20克。
交联葡聚糖凝胶的种类有G-10，G-15，G-25，G-50，G-75，G-100，G-150，和G-200。
因此，“G”反映凝胶的交联程度，膨胀程度及分部范围。
⑵Sephadex LH-20，是─Sephadex G-25的羧丙基衍生物，能溶于水及亲脂溶剂，用于分离不溶于水的物质。
（二）琼脂糖凝胶：商品名很多，常见的有，Sepharose（瑞典，pharmacia ），Bio-Gel-A（美国Bio-Rad）等。
琼脂糖凝胶是依靠糖链之间的次级链如氢键来维持网状结构，网状结构的疏密依靠琼脂糖的浓度。
一般情况下，它的结构是稳定的，可以在许多条件下使用（如水，pH4-9范围内的盐溶液）。
琼脂糖凝胶在40℃以上开始融化，也不能高压消毒，可用化学灭菌活处理。
（三）聚丙烯酰胺凝胶：是一种人工合成凝胶，是以丙烯酰胺为单位，由甲叉双丙烯酰胺交联成的，经干燥粉碎或加工成形制成粒状，控制交联剂的用量可制成各种型号的凝胶。
交联剂越多，孔隙越小。
聚丙烯酰胺凝胶的商品为生物胶－P （Bio-Gel P ），由美国Bio-Rod 厂生产，型号很多，从P-2至P-300共10种，P 后面的数字再乘1000就相当于该凝胶的排阻限度。
四）聚苯乙烯凝胶商品为Styrogel ， 具有大网孔结构， 可用于分离分子量1600到40，000，000的生物大分子，适用于有机多聚物，分子量测定和脂溶性天然物的分级，凝胶机械强度好，洗脱剂可用甲基亚砜。
凝胶过滤的特点是：填料多为带有羟基、但不带电荷的惰性材料，亲水性能好，又不与待分离物质发生作用，因此分离条件温和，蛋白质回收率高，重现性好；工作范围广，分离分子量的覆盖面大可分离几百到数百万分子量；设备简单、易于操作，周期短。
填料再生性好，可连续使用数百次到上千次。
功能脱盐：分离大小两类不同的分子即无机盐与生物大分子；分级：将分子大小相近的物质分开，通常为大分子间的分离。
缺点：凝胶强度低，可耐受的压力通常低于0.2个大气压，故流速低，通常的线速度小于20cm/h 。
因此，处理速度较慢。
但Superdex 的最大耐受压力可达15个大气压，流速也提高近10倍。
无机填料：表面改性后的硅胶，主要是用有机物或聚合物对硅胶颗粒进行处理，增加其亲水性并消除或抑制体积排阻以外的其他效应。
优点：可耐受较高的压力，最高压力可达上百个大气压。
具有较高的柱效率和分离度。
缺点：pH 的适用范围窄。
以硅胶为基质的填料，pH 范围在2.0-7.0，如果超过了这个范围，将会使有机层的溶解速率加快，减少柱子寿命。
凝胶特性参数（1）排阻极限（exclusion limit):凝胶过滤介质的排阻极限是指不能扩散到凝胶网络内部的最小分子的相对分子质量。
不同的凝胶过滤介质品牌具有不同的排阻极限。
Sephadex G50的排阻极限是30kD 。
（2）分级范围（fractionation range):即能为凝胶阻滞并且相互之间可以得到分离的溶质的相对分子质量范围。
Sephadex G-50的分级范围为1.5 ~30kD.（3）溶胀率：某些市售的干燥凝胶颗粒（如Sephadex G 系列），使用前要用水溶液进行溶胀处理，溶胀后每克干凝胶所吸收的水分的百分率称为溶胀率，即Sephadex G50 的溶胀率为500%±30%。
（4）凝胶粒径：一般为球形，其粒径大小对分离度有重要影响。
粒径越小，分离效率越高。
软凝胶粒径较大，一般为50 ~ 150μm ，硬凝胶粒径较小，一般为5 ~ 50 μm 。
Sepharose 和Sephadex 凝胶粒径分布为45 ~ 165 μm ，而Superdex 和TSK Toyopearl HW 系列可小到20 ~ 40 μm ，甚至6 ~ 10 μm 。
（5）床体积（bed volume ）即1g 干燥凝胶溶胀后所占的体积。
Sephadex G50的床体积为9 ~ 11cm 3/g 干胶。
（6）空隙体积（void volume)指层析柱中凝胶之间空隙的体积，即V 0值。
空隙体积可用相对分子质量大于排阻极限的溶质测定。
一般使用相对分子质量为2000kD 的水溶性兰色葡聚糖。
影响分离特性的因素1、填料分离度和蛋白质的分离范围以及最小分子量之比是选择填料要考虑的首要问题。
目前TSK 系列凝胶柱被认为是最好的蛋白质分离柱，其特点是分离度高和吸附性小。
2、柱长体积排阻色谱的分离度与柱长的平方根成正比，因此应根据分离的要求确定柱长，一般柱%100⨯-=干燥重量干燥重量）（溶胀处理平衡后重量溶胀率长60-120厘米对于蛋白质的分离比较理想，而长30厘米的柱子多用于快速分离。
3、洗脱液洗脱液的pH值和离子强度都将影响到分离效果。
以硅胶为基质的填料，pH范围在2.0-7.5,如果超出这个范围，将会使键合相的有机层溶解。
当离子强度很低时，TSK系列凝胶柱上的硅醇基会与待分离的蛋白发生离子反应，一般通过加入0.3-0.5mol/L的NaCl来抑制。
蛋白质和柱填料的疏水作用一般通过加入5-10%的乙醇或异丙醇来控制。
3、流速是影响蛋白质分离的重要因素。
一般流速低分离效果好。
如流速在小于0.1ml/min时，蛋白质的分离度好；在0.5-1.0ml/min时，对于7.5mm直径的柱子，分离效率较高。
4、样品容量进样体积和样品浓度将明显影响到蛋白质的分离度，高浓度、小体积对分离有利。