分离科学---第七章 制备色谱技术
分离过程中，逐渐增加洗脱剂中高极性溶
剂的比例，开始阶段增加幅度较小
(1%,2%,3%) ， 随 后 幅 度 逐 步 增 大
(5%,10%,20%等)，通常收集20-25个流分即
可将所有成分洗脱。
34
第七章 制备色谱技术
7.3 加压液相柱色谱技术
(1)快速色谱法：约0.2MPa；
(2)低压液相色谱法：<0.5MPa；
17
第七章 制备色谱技术
(2) 健合硅胶
R Si OH + R3SiX Si O Si R R
Si OH + ROH
Si OR
Si OH + SOCl2
Si Cl
Si Cl
+
RNH2
Si NHR
Si Cl
Байду номын сангаас
+
RXMg
Si R
18
第七章 制备色谱技术
(3) 氧化铝
碱性氧化铝：其水提取液为 pH9-10，常用于碳氢化
a. 设备简单，操作方便、分离快速、灵敏度
及分辨率高；
b. 切割谱带更加方便；
c. 自动化：自动点样仪、自动程序展开仪、
薄层扫描仪、多种强制流动技术、多种联
用技术如傅立叶变换红外、拉曼、质谱等。
2
第七章 制备色谱技术
7.1.2 常规制备薄层色谱PTLC
薄层板制备
为了增大上样量，增加了吸附剂用量。
固定相：硅胶、氧化铝、纤维素、 C2 、 C18
离心力加速流动相，分离速度快，操作简单，
占用空间小，使用溶剂少，可反复使用，可进行梯
度洗脱，进样量大，一次分离量0.1-0.2g.
14
第七章 制备色谱技术
不同制备TLC方法的比较
参数 PTLC OPLC 加压 CTLC 离心
流动相迁移方法 毛细作用
薄层厚度/mm
分离长度/cm
0.5-2
18
0.5-2
37
第七章 制备色谱技术
进样量的影响
实验室规模的制备，轻微过载，优点：
(1)便于回收高纯度目标成分，纯度>99%；
(2)纯品几乎完全回收，回收率>95%；
(3)分离程序简单，不需要为了得到纯品进一
步分析所得到的组分。
过载：低浓度时，进样量增加使得
容量因子改变超过10％
38
第七章 制备色谱技术
浓度过载和体积过载
性的基质，活性易保持；
30
第七章 制备色谱技术
常规柱色谱的操作
(1)装柱：干法和湿法；
(2)上样：液体上样和拌样上样，样品带尽可
能窄；
(3)洗脱：始终保持洗脱剂液面高于柱床表面，
可梯度洗脱；
(4)流分收集：常采用固定体积收集法，结合
TLC检验；
(5)样品回收：减压蒸馏或重结晶
31
第七章 制备色谱技术
与SephadexLH20有相似的效果。
25
第七章 制备色谱技术
琼脂糖凝胶----D-半乳糖和3,6位脱水的L-半乳糖
连接构成的多糖链，100℃时呈液态，45 ℃下互相
连接成线性双链单环的琼脂糖，再凝聚成琼脂糖凝
胶。 与1,3-二溴异丙醇在强碱条件下反应，生成CL型 交联琼脂糖，稳定性更好，pH3-14（一般的琼脂糖 pH4.5-9.0 ）；
K不变，线性
结果可预测
K变化，非线性 结果难预测
39
第七章 制备色谱技术
边缘切割与循环色谱分离 －－分离不佳时
等反相健合硅胶
支撑：玻璃板或铝箔
平均25m, 5~40 m 硅胶H、硅胶G、硅胶F254、硅胶F365、硅胶P
3
第七章 制备色谱技术
硅胶粒径范围影响：
1. 越细越均匀，分离度越高，但？
2. 粒径范围宽，分离效率低，怎么办？
------薄层厚度的渐变
薄层厚度从底部到前沿逐渐增加，这样展开剂 的速度逐渐变慢，样品谱带在展开过程中逐步富
(4) 活性炭：分离水溶性物质
吸附作用在水溶液中最强，用有机溶剂洗
脱。
对芳香族的吸附力大于脂肪族；
对大分子吸附力大于小分子；
对极性基团多的分子吸附力大于少的；
易吸附气体“中毒”，用前需活化，120℃
加热4-5小时；
20
第七章 制备色谱技术
(5) 聚酰胺：又称为锦纶或尼龙
同时具有良好的亲水性和亲脂性；
常用显色剂：
a. 硫酸：硫酸:乙醇(1:1)溶液，喷后110℃烤5
分钟，不同有机物显不同的颜色；
b. 0.05% 高锰酸钾溶液，还原性物质显黄色，
背景淡红色；
c. 酸性重铬酸钾：5%重铬酸钾浓硫酸溶液，
必要时150℃烤薄层；
d. 5% 磷钼酸乙醇溶液：喷后 120℃ 烤，还原
性物质显蓝色，再用氨气熏，背景无色。
10
第七章 制备色谱技术
样品收集：
a. 切割：刮刀或与真空相连的管型刮离器；
b. 回收：极性尽可能低的溶剂洗脱，通常1g
吸附剂用 5mL 溶剂，丙酮和氯仿常用，甲
醇因溶解硅胶及其中含有的杂质不常用。
c. 4 型玻璃沙芯漏斗过滤洗脱液，再用 0.2-
0.45m滤膜过滤。
d. 硅胶的黏合剂以及荧光指示剂等杂质，可
合物的分离，从碳氢化合物中除去含氧化合物。
中性氧化铝： 5% 乙酸处理，水提取液为 pH7.5 ，适 用于醛、酮、醌、某些苷以及酸碱溶液中不稳定成 分如酯、内酯等化合物的分离。 酸性氧化铝：2MHCl溶液处理，水提取液pH为4-4.5，
适合于天然及合成酸性色素以及某些醛、酸的分离。
19
第七章 制备色谱技术
用Sephadex LH-20过滤纯化。
11
第七章 制备色谱技术
常规制备TLC速度慢，效率低，如何提高？
加压 离心
12
第七章 制备色谱技术
7.1.3 加压制备OPLC
弹性气垫，外压使没有气相存在，展开剂
强制流动，展开速度加快
更细的固定相颗粒、更长的薄层板
13
第七章 制备色谱技术
7.1.4 离心制备CTLC
(3)中压液相色谱法：0.5～2MPa；
(4)高压液相色谱法：>2MPa；
35
第七章 制备色谱技术
加压液相色谱制备分离方法的建立：
(1)采用薄层色谱确定分离条件。
对于快速和低压色谱，常用薄层色谱选择
分离条件。
硅胶薄层色谱确定正相色谱条件，反相硅
胶薄层色谱确定反相色谱条件，一般选择 Rf
不大于0.3且具有较好分离效果的展开剂。
可溶于浓盐酸、甲酸，不溶于常见溶剂；
含有丰富的酰胺基，与酚类、黄酮类、醌
类、脂肪酸类物质形成氢键；
还含有非极性脂肪链，双重保留机理；
21
第七章 制备色谱技术
(6) 大孔吸附树脂：苯乙烯和丙烯酸酯
骨架结构决定树脂的极性：
非极性、弱极性----苯乙烯或二乙烯基苯聚
合而成；
中等极性----甲基丙烯酸酯；
(6)惰性溶剂：环己烷、正己烷等。
7
第七章 制备色谱技术
上样和展开
1. 先用甲醇展开一次，除去可能存在的杂质；
2. 低挥发性溶剂溶解样品会引起样品带变宽，因此
选用挥发性溶剂（己烷、二氯甲烷、乙酸乙酯 等），且溶剂极性尽可能小。 3. 样品浓度以能均匀分布于吸附剂表面不析出为宜， 5-10%；
4. 带状点样，尽可能窄；如点样带太宽，可用高极
改进方法：减压、加压等
16
第七章 制备色谱技术
柱色谱常用固定相
(1)硅胶：官能团和分子的几何形状，对异构
体的分离选择性远大于其他色谱方法。
烷基<卤素（F<Cl<Br<I）<醚<硝基混合物<腈<叔胺
<酯<酮<醛<醇<酚<伯胺<酰胺<羧酸<磺酸
掺杂硅胶：如硝酸银处理，对不饱和烃有好 的分离效果。1%-10%的添加剂的水或丙酮溶 液与硅胶混合，稍干后110℃干燥即可。
操作参数 展开缸类型 薄层板和 展开缸空 腔体积比 值 温度
6
蒸气相 流动相 选择性 黏度
第七章 制备色谱技术
常用溶剂
(1)电子接受体溶剂：苯、甲苯、乙酸乙酯、丙酮等；
(2)质子给体溶剂：异丙醇、正丁醇、甲醇、无水乙
醇等； (3)强质子给体溶剂：氯仿、冰醋酸、甲酸、水等； (4)质子受体溶剂：三乙胺、乙醚等； (5)偶极作用溶剂：二氯甲烷
价态高，交换能力强；
价态相同，原子序数大能力强；
两性物质的交换取决于物化性质和特定条件下 的离子状态；
29
第七章 制备色谱技术
离子交换树脂的一般原则---选择取决于被分离物质的电荷性质；
强的使用范围宽，弱的分离生物大分子时，活
性不容易失去； 反离子，为了提高交换容量，选择结合力小的 反离子； 亲疏水性选择，一般分离大分子时，选择疏水
27
第七章 制备色谱技术
(4) 干胶使用前需在 5-10 倍的去离子水中充分
溶涨，倾倒掉小颗粒，减压排气。也可用煮
沸的方法溶涨，速度快，可灭菌排气。
(5)填充均匀，无空隙和气泡；
(6)多次使用后，床体积减小或污染，可再生
处理，即用水逆向反复冲洗，再用缓冲溶液
平衡。
28
第七章 制备色谱技术
(8) 离子交换树脂----阳离子交换和阴离子交换
第七章 制备色谱技术
制备色谱的特点：
最有效的制备性分离技术；
实验室规模、小批量生产、产业化制备；
不同领域产品量不一样，阐明化学结构和
生物活性，30－50mg足够，分析用标准品
合集下载
第七章 色谱分离技术
固定相和流动相、操作条件。
④ 设备简单，操作方便，且不含强烈的操作条件， 因而不容易使物质变性，特别适于不稳定的大分子 有机化合物。
缺点： 处理量小、操作周期长、不能连续操作，因此 主要用于实验室，工业生产上应用较少。
3.色谱法的分类 吸附色谱法
分配色谱法
分离机理
离子交换色谱法 凝胶色谱法
亲和色谱法
（一）基本原理
溶液中某组分的分子在运动中碰到一个固体表 面时，分子会贴在固体表面上，发生吸附作用。
1.发生吸附作用的原理：
固体表面分子（或原子）与固体内部分子（或原子） 所处的状态不同：
固体内部分子（或原子）受临近四周分子的作用力是 对称的，作用力总和为零，即彼此互相抵消，故分子处 于平衡状态。
界面上的分子所受的力不对称，作用力总和不等于零， 合力指向固体内部。
小分子
（二）凝胶过滤介质
基本要求：
不能与原料组分发生除排阻之外的任何其他相 互作用，如电荷作用、化学作用、生物学作用
高物理强度、高化学稳定性 耐高温高压、耐强酸强碱 高化学惰性 内孔径分布范围窄 颗粒大小均一度高
常用的凝胶过滤介质 葡聚糖凝胶 琼脂糖凝胶 聚丙烯酰胺凝胶
1. 葡聚糖凝胶
pH、缓冲液浓度、离子强度
③ 柱操作 柱的大小、长短 ④ 流速的控制 高速度、高效率 ⑤ 清洗 除去不结合的所有物质 ⑥ 洗脱 特异性洗脱（竞争性置换目的物） ⑦ 柱的再非生特异性洗脱（调节pH、离子强度和种类、温度）
（五）亲和色谱法的应用
1.亲和色谱法的特点： 专一、高效、简便、快速
2.应用 ① 分离和纯化各种生物分子 纯化生物大分子，适于从组织或发酵液中分离
色谱法应运而生。
色谱分离是一组相关技术的总称，又叫做色 谱法、层析法，是一种高效而有用的生物分离 技术。
④ 设备简单，操作方便，且不含强烈的操作条件， 因而不容易使物质变性，特别适于不稳定的大分子 有机化合物。
缺点： 处理量小、操作周期长、不能连续操作，因此 主要用于实验室，工业生产上应用较少。
3.色谱法的分类 吸附色谱法
分配色谱法
分离机理
离子交换色谱法 凝胶色谱法
亲和色谱法
（一）基本原理
溶液中某组分的分子在运动中碰到一个固体表 面时，分子会贴在固体表面上，发生吸附作用。
1.发生吸附作用的原理：
固体表面分子（或原子）与固体内部分子（或原子） 所处的状态不同：
固体内部分子（或原子）受临近四周分子的作用力是 对称的，作用力总和为零，即彼此互相抵消，故分子处 于平衡状态。
界面上的分子所受的力不对称，作用力总和不等于零， 合力指向固体内部。
小分子
（二）凝胶过滤介质
基本要求：
不能与原料组分发生除排阻之外的任何其他相 互作用，如电荷作用、化学作用、生物学作用
高物理强度、高化学稳定性 耐高温高压、耐强酸强碱 高化学惰性 内孔径分布范围窄 颗粒大小均一度高
常用的凝胶过滤介质 葡聚糖凝胶 琼脂糖凝胶 聚丙烯酰胺凝胶
1. 葡聚糖凝胶
pH、缓冲液浓度、离子强度
③ 柱操作 柱的大小、长短 ④ 流速的控制 高速度、高效率 ⑤ 清洗 除去不结合的所有物质 ⑥ 洗脱 特异性洗脱（竞争性置换目的物） ⑦ 柱的再非生特异性洗脱（调节pH、离子强度和种类、温度）
（五）亲和色谱法的应用
1.亲和色谱法的特点： 专一、高效、简便、快速
2.应用 ① 分离和纯化各种生物分子 纯化生物大分子，适于从组织或发酵液中分离
色谱法应运而生。
色谱分离是一组相关技术的总称，又叫做色 谱法、层析法，是一种高效而有用的生物分离 技术。
快速制备色谱
快速制备色谱
快速制备色谱是一种快速、灵活、有效的色谱分析方法，它可以在较短的时间内对物质的性质进行准确的测定和分析。
快速制备色谱技术的原理是将含有不同物质的样品分离成单个或多个具有明显不同颜色的溶液，然后将这些溶液涂在一张灰度色谱上，其中每一种物质都会呈现出不同的颜色，从而形成一条色谱线，通过对色谱线的分析就可以得出样品中不同物质的组成比例，从而快速准确测定样品中的物质。
快速制备色谱的步骤包括：
1. 样品准备：将样品精细剂量，加入适量的水，搅拌至样品完全溶解。
2. 颜料制备：将各种颜料按照需要的比例混合制备，如青色染料和红色染料。
3. 样品分离：将所制备的样品按照需要的比例混合，并用离心机进行分离，使各种物质分离成不同的溶液。
4. 制备色谱：将各种溶液涂在一张灰度色谱上，每种物质涂一种颜色，形成一条色谱线，从而可以快速准确地测定样品中的物质组成。
5. 解读：通过对色谱线的评价，可以准确地测定样品中不同物质的含量，从而获得样品的性质信息。
快速制备色谱技术具有快速、灵活、有效的特点，可以快速准确地测定物质的性质，因此在化学、生物、食品分析等领域都有广泛的应用。
此外，由于快速制备色谱技术的操作简便，耗时短，所以也被广泛应用于实验室的日常工作中。
第7章 色谱分离技术
(4) 酚-醛型树脂 主要由水杨酸、苯酚和甲醛 缩聚而成，水杨酸和甲醛形成线状结构，苯酚作 为交联剂。
2. 按树脂骨架的物理结构
(1) 凝胶型树脂 (2) 大网格树脂 (3) 均孔树脂
3. 按活性基团分类
1) 阳离子交换树脂 活性基团为酸性， 对阳离子具有交换能力。
(1) 强酸性阳离子交换树脂
超临界流体色谱—流动相是在接近它 的临界温度和压力下工作的液体
三、色谱法的分类
根据固定相的附着方式分类 —固定相装在圆柱管中—柱色谱 —液体固定相涂在纸上—纸色谱(平板色谱)
—固定相涂敷在玻璃或金属板上—薄层色谱
三、色谱法的分类
按分离机理不同，可分为： 吸附色谱法 分配色谱法 离子交换色谱法 凝胶色谱法 亲和色谱法
第7章 色谱分离技术
一、色谱分离技术的概念 色谱（chromatography）分离技术是 一类分离方法的总称，又称色谱法、层析法、 层离法等。它是利用不同组分在固定相和流 动相中的物理化学性质的差别，使各组分在 两相中以不同的速率移动而进一步分离的技 术。
二、色谱分离系统的组成
在色谱法中，表面积较大的固体或附着 在固体上且不运动的液体，静止不动的 一相（称为固定相 ；自上而下运动的一 相（一般是气体或液体）称为流动相 。
展开剂
常用溶剂极性次序为：己烷<环己烷<四 氯化碳<甲苯<苯<氯仿<乙醚<乙酸乙酯< 丙酮<正丙醇<乙醇<甲醇<水<冰醋酸
（2）柱色谱的吸附剂与洗脱剂
吸附剂的选择
一般地说，所选的吸附剂应有最大的比 表面积和足够的吸附能力，它对欲分离 的不同物质应该有不同的解吸能力；与 洗脱剂、溶剂及样品组分不会发生化学 反应；还要求所选的吸附剂颗粒均匀， 在操作过程中不会破裂。
2. 按树脂骨架的物理结构
(1) 凝胶型树脂 (2) 大网格树脂 (3) 均孔树脂
3. 按活性基团分类
1) 阳离子交换树脂 活性基团为酸性， 对阳离子具有交换能力。
(1) 强酸性阳离子交换树脂
超临界流体色谱—流动相是在接近它 的临界温度和压力下工作的液体
三、色谱法的分类
根据固定相的附着方式分类 —固定相装在圆柱管中—柱色谱 —液体固定相涂在纸上—纸色谱(平板色谱)
—固定相涂敷在玻璃或金属板上—薄层色谱
三、色谱法的分类
按分离机理不同，可分为： 吸附色谱法 分配色谱法 离子交换色谱法 凝胶色谱法 亲和色谱法
第7章 色谱分离技术
一、色谱分离技术的概念 色谱（chromatography）分离技术是 一类分离方法的总称，又称色谱法、层析法、 层离法等。它是利用不同组分在固定相和流 动相中的物理化学性质的差别，使各组分在 两相中以不同的速率移动而进一步分离的技 术。
二、色谱分离系统的组成
在色谱法中，表面积较大的固体或附着 在固体上且不运动的液体，静止不动的 一相（称为固定相 ；自上而下运动的一 相（一般是气体或液体）称为流动相 。
展开剂
常用溶剂极性次序为：己烷<环己烷<四 氯化碳<甲苯<苯<氯仿<乙醚<乙酸乙酯< 丙酮<正丙醇<乙醇<甲醇<水<冰醋酸
（2）柱色谱的吸附剂与洗脱剂
吸附剂的选择
一般地说，所选的吸附剂应有最大的比 表面积和足够的吸附能力，它对欲分离 的不同物质应该有不同的解吸能力；与 洗脱剂、溶剂及样品组分不会发生化学 反应；还要求所选的吸附剂颗粒均匀， 在操作过程中不会破裂。
现代分离方法与技术第7章 制备色谱技术
第7章 制备色谱技术
7.1 制备薄层色谱技术 7.2 常规柱色谱技术 7.3 加压液相色谱技术 7.4 逆流色谱法 7.5 超临界流体色谱法 7.6 模拟床移动色谱法 7.7 制备气相色谱法 7.8 径相色谱法 7.9 顶替色谱法 7.10 离子交换与吸附
制备色谱技术
制备色谱的特点：
最有效的制备性分离技术；
实验室规模、小批量生产、产业化制备；
不同领域产品量不一样，阐明化学结构和
生物活性，30－50 mg足够，分析用标准
品100 mg以上，有机合成通常需要g级以
上；
薄层色谱
柱色谱
制备色谱技术
7.1 制备薄层色谱技术
设备简单，操作方便、分离快速、灵敏度及 分辨率高； a. 切割谱带更加方便； b. 自动化：自动点样仪、自动程序展开仪、 薄层扫描仪、多种强制流动技术、多种联 用技术如傅立叶变换红外、拉曼、质谱等。
50-300
2-7
50-500
2-12
制备色谱技术
7.2 常规柱色谱技术
可使用较大直径的色谱柱，更多的固定相，
因此样品量可以更大；
分离速度较慢，样品可能被不可逆吸附；
不适合小颗粒的吸附剂？
改进方法：减压、加压等
制备色谱技术
柱色谱常用固定相
(1)硅胶：官能团和分子的几何形状，对异构
比表面积
制备色谱技术
大孔吸附树脂使用：
用前需预处理除去杂质：
回流法、水蒸气蒸馏法；
渗漉法----乙醇丙酮等有机溶剂湿法装柱，浸泡12
h后洗脱2-3倍柱体积，再浸泡3-5 h后洗脱2-3倍柱体
积，重复直到流出的有机溶剂与水混合不呈现白色乳 浊现象为止，用大量蒸馏水洗去乙醇即可。如单独采 用有机溶剂洗不尽杂质，则可用酸碱处理，2-5%盐 酸、2-5%NaOH溶液浸泡，洗脱，水洗。
7.1 制备薄层色谱技术 7.2 常规柱色谱技术 7.3 加压液相色谱技术 7.4 逆流色谱法 7.5 超临界流体色谱法 7.6 模拟床移动色谱法 7.7 制备气相色谱法 7.8 径相色谱法 7.9 顶替色谱法 7.10 离子交换与吸附
制备色谱技术
制备色谱的特点：
最有效的制备性分离技术；
实验室规模、小批量生产、产业化制备；
不同领域产品量不一样，阐明化学结构和
生物活性，30－50 mg足够，分析用标准
品100 mg以上，有机合成通常需要g级以
上；
薄层色谱
柱色谱
制备色谱技术
7.1 制备薄层色谱技术
设备简单，操作方便、分离快速、灵敏度及 分辨率高； a. 切割谱带更加方便； b. 自动化：自动点样仪、自动程序展开仪、 薄层扫描仪、多种强制流动技术、多种联 用技术如傅立叶变换红外、拉曼、质谱等。
50-300
2-7
50-500
2-12
制备色谱技术
7.2 常规柱色谱技术
可使用较大直径的色谱柱，更多的固定相，
因此样品量可以更大；
分离速度较慢，样品可能被不可逆吸附；
不适合小颗粒的吸附剂？
改进方法：减压、加压等
制备色谱技术
柱色谱常用固定相
(1)硅胶：官能团和分子的几何形状，对异构
比表面积
制备色谱技术
大孔吸附树脂使用：
用前需预处理除去杂质：
回流法、水蒸气蒸馏法；
渗漉法----乙醇丙酮等有机溶剂湿法装柱，浸泡12
h后洗脱2-3倍柱体积，再浸泡3-5 h后洗脱2-3倍柱体
积，重复直到流出的有机溶剂与水混合不呈现白色乳 浊现象为止，用大量蒸馏水洗去乙醇即可。如单独采 用有机溶剂洗不尽杂质，则可用酸碱处理，2-5%盐 酸、2-5%NaOH溶液浸泡，洗脱，水洗。
药物分离纯化技术---制备色谱分离技术共55页
26、要使整个人生都过得舒适、愉快，这是不可能的，因为人类必须具备一种能应付逆境的态度。——卢梭
▪
27、只有把抱怨环境的心情，化为上进的力量，才是成功的保证。——罗曼·罗兰
▪
28、知之者不如好之者，好之பைடு நூலகம்不如乐之者。——孔子
▪
29、勇猛、大胆和坚定的决心能够抵得上武器的精良。——达·芬奇
▪
30、意志是一个强壮的盲人，倚靠在明眼的跛子肩上。——叔本华
谢谢！
55
药物分离纯化技术---制备色谱分离技 术
11、不为五斗米折腰。 12、芳菊开林耀，青松冠岩列。怀此 贞秀姿 ，卓为 霜下杰 。
13、归去来兮，田蜀将芜胡不归。 14、酒能祛百虑，菊为制颓龄。 15、春蚕收长丝，秋熟靡王税。
▪
生物分离工程 第七章 色谱技术
吸附色谱及其分类和基本原理
什么是分配色谱？
离子交换色谱的分类及应用
凝胶色谱的分离原理及分类 离子交换及疏水作用层析的原理
高效液相色谱的分离原理及应用
蛋白质分离的常用色谱方法有哪些？
色谱技术（分配色谱）
概念：色谱技术是一组相关分离方法的总称，色
谱柱的一般结构含有固定相（多孔介质）和流动
（3）线性洗脱法
线形洗脱法（linear gradient elution)
流动相的离子强度线性增大，因此溶质的分配系数连续降低， 移动速度逐渐增大
特点
难于洗脱的溶质在较小流动相体积下洗脱； 改变流动相离子强度增大速度可调节溶质的洗脱体积； 流动相离子强度（盐浓度）连续增大，不出现干扰峰，操作 范围广； 需要特殊调配浓度梯度的设备
滤介质的要求和影响分离特性的因素
应用：掌握凝胶色谱的应用及特点
（1）定义
凝胶过滤色谱利用凝胶粒子为固定 相，是根据料液中溶质相对分子量的差 别进行分离的液相色谱法
（2）原理
在GFC柱中，分子量大的溶质 不能进入凝胶介质，而沿介质 空隙流过 分子量很小的溶质能够进入所 有的细孔中，其洗脱体积接近 柱体积 分子两介于两者之间的溶质能 够进入部分细孔中
形状
纸色谱 薄层色谱 柱色谱 纸层析
薄层层析
（3）操作压力分类
低压液相色谱（<0.5 MPa）
中压液相色谱（0.5-4.0 MPa）
高压液相色谱（>4.0 MPa）
（4）流动相流动方式分类
轴向流色谱
径向流色谱
（5）分离操作方式分类
什么是分配色谱？
离子交换色谱的分类及应用
凝胶色谱的分离原理及分类 离子交换及疏水作用层析的原理
高效液相色谱的分离原理及应用
蛋白质分离的常用色谱方法有哪些？
色谱技术（分配色谱）
概念：色谱技术是一组相关分离方法的总称，色
谱柱的一般结构含有固定相（多孔介质）和流动
（3）线性洗脱法
线形洗脱法（linear gradient elution)
流动相的离子强度线性增大，因此溶质的分配系数连续降低， 移动速度逐渐增大
特点
难于洗脱的溶质在较小流动相体积下洗脱； 改变流动相离子强度增大速度可调节溶质的洗脱体积； 流动相离子强度（盐浓度）连续增大，不出现干扰峰，操作 范围广； 需要特殊调配浓度梯度的设备
滤介质的要求和影响分离特性的因素
应用：掌握凝胶色谱的应用及特点
（1）定义
凝胶过滤色谱利用凝胶粒子为固定 相，是根据料液中溶质相对分子量的差 别进行分离的液相色谱法
（2）原理
在GFC柱中，分子量大的溶质 不能进入凝胶介质，而沿介质 空隙流过 分子量很小的溶质能够进入所 有的细孔中，其洗脱体积接近 柱体积 分子两介于两者之间的溶质能 够进入部分细孔中
形状
纸色谱 薄层色谱 柱色谱 纸层析
薄层层析
（3）操作压力分类
低压液相色谱（<0.5 MPa）
中压液相色谱（0.5-4.0 MPa）
高压液相色谱（>4.0 MPa）
（4）流动相流动方式分类
轴向流色谱
径向流色谱
（5）分离操作方式分类
色谱分离的技术
是所有分离纯化技术中最高的(不计电泳)。 若用理论塔板数来表示柱效率，每米柱长可达103～105块塔板。 通常色谱柱长一般只有几厘米至几十厘米。 从极性到非极性、离子型到非离子型、小分 子到大分子、无机到有机及生物活性物质，以及热稳定到热不稳 定的化合物，都可用色谱法分离。 色谱分离有很强的选择性, 可通过多种途径 选择不同的操作参数，以适应各种不同样品的分离要求。
7.1.2.2 按固定相形状不同分类
(1)柱色谱
进样量大，回收容易。 除用于分析外，还广泛用于生物样品 的制备和工业生物产品的分离与纯化。
(2)纸上色谱 广泛用于定性与定量分析，不用于制备和生产。
(3)薄层色谱
主要用于分析，也可用于小量样品的制备。
7.1.2.3 其他分类方法
(1) 根据流动相的物态分类 气相色谱 、液相色谱和超临界色谱
Ve Vo K d Vi
或
(7-29) (7-30)
Ve Vo Kd Vi
Kd＝1，溶质分子完全不被排阻， 可自由进入所有凝胶颗粒微孔。 Kd＝0，溶质分子完全被排阻于凝胶颗粒微孔之外，最先被洗脱。 对于中等分子，能进入部分凝胶空间，0＜Kd＜1。 当具有不同分子量物质的混合液流经凝胶柱时，其Kd值的大小就 决定了物质的流出顺序，即Kd值小的先流出，Kd值大的后流出。
7.1.4.2 吸附色谱
吸附色谱分离就是根据吸附剂(固定相)对不同物质的吸 附力不同而使混合物分离的。
离子交换色谱和亲和色谱也可归类于吸附色谱，前者主要 是静电引力的作用，而后者是生物专一亲和力的作用。
在一定温度下，分离物质在液相和固相中的浓度关系可用吸附 方程式来表示：
Ka A B A B Kd
极高的分辨率;
1944年 出现纸层析;
7.1.2.2 按固定相形状不同分类
(1)柱色谱
进样量大，回收容易。 除用于分析外，还广泛用于生物样品 的制备和工业生物产品的分离与纯化。
(2)纸上色谱 广泛用于定性与定量分析，不用于制备和生产。
(3)薄层色谱
主要用于分析，也可用于小量样品的制备。
7.1.2.3 其他分类方法
(1) 根据流动相的物态分类 气相色谱 、液相色谱和超临界色谱
Ve Vo K d Vi
或
(7-29) (7-30)
Ve Vo Kd Vi
Kd＝1，溶质分子完全不被排阻， 可自由进入所有凝胶颗粒微孔。 Kd＝0，溶质分子完全被排阻于凝胶颗粒微孔之外，最先被洗脱。 对于中等分子，能进入部分凝胶空间，0＜Kd＜1。 当具有不同分子量物质的混合液流经凝胶柱时，其Kd值的大小就 决定了物质的流出顺序，即Kd值小的先流出，Kd值大的后流出。
7.1.4.2 吸附色谱
吸附色谱分离就是根据吸附剂(固定相)对不同物质的吸 附力不同而使混合物分离的。
离子交换色谱和亲和色谱也可归类于吸附色谱，前者主要 是静电引力的作用，而后者是生物专一亲和力的作用。
在一定温度下，分离物质在液相和固相中的浓度关系可用吸附 方程式来表示：
Ka A B A B Kd
极高的分辨率;
1944年 出现纸层析;
[理学]第7章色谱分离过程2011
极复杂混合物的分离，且通常收率、产率和纯
度都较高。
• (3)操作模式多样
• 在色谱分离中，可通过选择不同的操作模 式，以适应各种不同样品的分离要求。
• 如可选择吸附色谱、分配色谱和亲和色谱等不
同的色谱分离方法;可选择不同的固定相和流动
相状态及种类;可选择间歇式和连续式色谱。
（4）高灵敏度在线检测 • 在分离与纯化过程中，可根据产品的性质， 应用不同的物理与化学原理，采用不间的高灵 敏度检测器进行连续的在线检测。从而保证了 在达到要求的产品纯度下，获得最高的产率。
换树脂和弱碱性阴离子交换树脂。
•
可用于葡萄糖和果糖的分离及蛋白
质的分离与提纯。质子化的强离子交换
树脂能用于分离高度氧化及脱水的二萜 类化合物。
• (3)大孔吸附树脂 • 大孔吸附树脂是单体在聚合物过程中， 同时加入适当的发泡剂聚合而成的球形 颗粒。按其极性分为极性、非极性及中 间极性三种类型。它具有化学稳定性和 机械稳定性能较好，吸附容量大和再生 容易的优点，其应用十分普遍。
• 7.2.2 固定相(色谱柱填料)
•
色谱柱填料分为球形颗粒填料和不规则
形状颗粒填料，前者具有较大的优势。它
有较高的机械强度，不易破碎，柱的填装
重现性好，并可增加样品在柱中的渗透性，
虽价格较高，但其使用寿命较长。选择合
适的柱填料不仅应考虑其化学性质，还应
考虑颗粒大小、色谱柱长度、操作压力等
因素，才能得到好的分离效果。
• 色谱分离过程具有如下特点。 (1)应用范围广 • 从极性到非极性、离子型到非离子型、小
分子到大分子、无机到有机及生物活性物质、
热稳定到不稳定的化合物都可用色谱方法分
离，尤其在生物大分子分离和制备方面，是 其他方法无法替代的。
制备色谱技术与操作及实验经验
制备色谱技术与操作及实验经验1 制备色谱到底是什么？（1）分析色谱的目的，是分析出混合物中一个（或者几个）纯物质的含量。
制备色谱的目的，是从混合物中得到纯物质。
为了加快分离的时间与提高分离的效率，制备色谱的的进样品量很大，导致制备色谱柱子的分离负荷的相应加大，也就必须加大色谱柱填料，增大制备色谱的直径和长度，使用的相对多的流动相。
然而，当色谱柱上样品负载加大的时候，往往导致柱效急剧下降而得不到纯的产品。
制备色谱，要解决容量与柱子效果之间的矛盾，对重现性也要考虑。
从经济上来说。
制备色谱要争取少用填料，少用溶剂，要尽可能多的得到产品。
（2）样品的前处理：制备色谱柱子由于处理的样品多，比分析柱子更容易受污染，所以，必要的前处理就显得非常的必要。
萃取、过滤、结晶、固相萃取等简单的分离方法，如果用得上，而且还不是很麻烦，就要尽可能多的采用以去掉杂质。
（3）制备色谱柱的材质及其特点下面介绍一下，制备色谱柱常用的材质及其特点。
各种规格的玻璃柱子在实验室里头很容易得到，而且价格低廉，但玻璃柱子致命的弱点是它能承受的压力很小，且非常容易破碎。
当由于压力太小而导致流动相流速很慢的时候，高位液面或加高压空气（或者氮气）的采用是一个简单的解决办法。
在底下加真空，也能在一定程度上解决这个问题。
不锈钢柱子具有良好的耐腐蚀、抗压力性能，但其价格相对很贵。
如果，只有很小的分离任务且经费也允许，市面上直径为1cm的小型制备柱就是首选。
有机玻璃柱子也能抗压力耐腐蚀，相对不锈钢柱子而言，它是半透明的，可以看到液体的运行状态，对有色的物质其特点就更为突出。
（4）固定相的选择硅胶、键合固定相（如C18）、离子交换树脂、聚酰胺、氧化铝、凝胶等都可以作为色谱柱的填料。
有不少文献报道，对填料可以进行一下处理提高了分离效果，如，对硅胶进行的硝酸银（或缓冲液）处理。
（5）装柱方法的选择根据固定相颗粒度和柱子的尺寸，采用不同的装柱方法，往往装填越好分离效果越好。
药物分离纯化技术-制备色谱分离技术
适用范围广
制备色谱分离技术适用于各种类型的 混合物，包括有机物、无机物、生物 大分子等。
可重复性高
制备色谱分离技术具有较高的可重复 性，能够保证分离结果的稳定性和可 靠性。
制备色谱分离技术的缺点
01
02
03
成本较高
制备色谱分离技术需要使 用专门的仪器和耗材，成 本较高。
需要专业操作
制备色谱分离技术需要专 业人员进行操作和维护， 操作难度较大。
适用范围广
制备色谱分离技术适用于各种 类型的药物，包括小分子化合 物、大分子蛋白质、多糖等。
操作简便
制备色谱分离技术的操作相对 简单，易于实现自动化和规模
化生产。
制备色谱分离技术的未来展望
新型材料的研发
随着材料科学的不断发展，未来将会有更多新型的色谱填 料和介质被研发出来，进一步提高制备色谱分离技术的效 果和效率。
可能造成样品损失
在制备色谱分离过程中， 可能会造成目标成分的损 失或降解，影响产物的纯 度和产量。
制备色谱分离技术的发展趋势
1 2
新型固定相的开发
随着材料科学的不断发展，新型固定相的研发和 应用将进一步提高制备色谱分离技术的效率和纯 度。
连续色谱分离技术
连续色谱分离技术能够实现连续进样和分离，提 高分离效率，是未来发展的重要趋势。
智能化和自动化
未来制备色谱分离技术将更加智能化和自动化，能够实现 实时监测、自动控制和调整，提高生产效率和产品质量。
绿色环保
随着环保意识的不断提高，未来制备色谱分离技术将更加 注重绿色环保，减少对环境的污染和资源消耗。
联合应用
未来制备色谱分离技术将与其他分离技术联合应用，形成 多级分离流程，进一步提高药物的纯度和收率。