SDS法提取DNA
SDS碱裂解法制备质粒DNA提取和纯化_百替生物
SDS碱裂解法制备质粒DNA提取和纯化[适用对象] 生物工程专业[实验学时] 8学时一、实验目的使学生掌握从大肠杆菌中制备质粒DNA的方法，提供实验所需载体。
二、实验原理质粒细菌染色体外的DNA分子，其范围大小在1kb至200kb以上不等。
它独立于细菌染色体外进行复制和遗传的辅助性遗传单位。
质粒在基因工程中是最常用的载体。
提取质粒DNA也是基因工程中最常见的实验操作。
提取质粒首先进行大肠杆菌细胞的制备，制备后用碱裂解液进行细胞裂解，使细胞壁破裂，染色体DNA和蛋白质变性，将质粒DNA释放到上清中。
尽管碱性溶剂使碱基配对完全破坏，闭环的质粒DNA双链仍不会彼此分离，这因为它们在拓扑学上是相互缠绕的。
而裂解过程中，细菌蛋白、破裂的细胞壁和变性的染色体DNA会相互缠绕成大型复合物，后者被十二烷基硫酸盐包盖。
当用钾离子取代钠离子时，这些复合物会从溶液中有效地沉淀下来。
离心除去变性剂后，就可以从上清中回收复性的质粒DNA，最后用聚乙二醇沉淀法进行质粒的纯化。
对于小量制备的质粒DNA，经过苯酚、氯仿抽提，RNA酶消化和乙醇沉淀等简单步骤去除残余蛋白质和RNA，所得纯化的质粒DNA已可满足细菌转化、DNA片段的分离和酶切、常规亚克隆及探针标记等要求，故在分子生物学实验室中常用。
三、仪器设备培养皿摇床天平高速离心机（×12000g）微量移液器（2－20μl、20－200μl、200－1000μl）、电泳仪、微波炉。
四、相关知识点本课程知识点综合：涉及到质粒DNA提取过程、质粒纯化过程和琼脂糖凝胶电泳技术。
多课程知识点的综合：微生物学细菌的培养和质粒抽提技术。
五、实验步骤细胞培养接种培养挑取LB固体培养基上生长的单菌落，接种于2.0ml LB（含相应抗生素）液体培养基中，37℃、250g振荡培养过夜（约12-14hr）。
离心取1.5ml培养物入微量离心管中，室温离心8000g×1min，弃上清，将离心管倒置，使液体尽可能流尽。
实验一 SDS法提取植物基因组DNA
实验一SDS法提取植物基因组DNA【实验目的】学习和掌握常用基因组DNA提取方法。
【实验要求】1.设计所采用实验方案并独立完成所有实验操作；2..获得高纯度、完整DNA样品。
一、原理利用含高浓度SDS的抽提缓冲液在较高温度（55—65℃）条件下裂解植物细胞，使染色体离析，蛋白质变性，释放出核酸，然后提高盐浓度（KAc）和降低温度（冰上保温）的办法沉淀除去蛋白质和多糖（在低温条件下KAc与蛋白质及多糖结合成不溶物），离心除去沉淀后，上清液中的DNA用酚/氯仿抽提，反复抽提后用乙醇沉淀水相中的DNA。
二、药品试剂及耗材——液氮——提取缓冲液：500 mmol/L NaCl, 100 mmol/L Tris-HCl ph8, 50 mmol/L EDTA ph8，10 mmol/L 2-巯基乙醇（用前加入） ---- 20% SDS ph7.2 ---- 5 mol/L KAc---- 氯仿：异戊醇（24：1）——异丙醇—— 70%乙醇—— TE缓冲液 :10 mmol/L Tris-HCl,1 mmol/L EDTA,PH8.0 耗材：移液枪，15、2.0、1.5ml离心管，篮、黄、白枪头各四套离心管架4个，离心管盒2个，水浴泡沫8个，研钵及小药勺8套棉手套，薄膜手套，透明胶布，剪刀三、操作程序1. 将1 g植物材料于液氮速冻，然后在研钵中将其磨碎，将粉末转至2 ml离心管中。
2. 加入 1.2 ml预热至65℃的提取缓冲液(3V)，轻缓振荡混匀，加入120μl 20%SDS(达到终浓度2%)，混匀，置65℃水浴中放置30分钟，不时颠倒混匀。
3. 加入0.45 ml 5M的醋酸钾（1/10V），混匀，冰浴20分钟，在10000 rpm离心20 min。
需要的话，Miracloth纱布过滤除去沉淀，取上清液转入另一离心管中。
4. 加入等体积氯仿：异戊醇（24：1），轻轻颠倒混匀， 12000 rpm离心15 min。
SDS 法DNA提取
SDS法提取植物基因组DNA
(可用于southern blot)
1、称取材料放入液氮充分预冷的研钵中，液氮充分研磨至粉末状。
研磨过程中不断添加液氮，勿使其干。
2、将研磨成粉末的材料转入50mL离心管中，移入15mL预热至65℃的SDS提取缓冲液（100mmol/L Tris-HCl（pH8.0），50mmol/L EDTA，500mmol/L NaCl），2%体积的β-巯基乙醇，2mL 10% SDS。
65℃水浴20min，其间轻轻颠倒混匀数次。
3、加入5mL 5mol/L乙酸钾（KAc）冰浴放置20min，8000r/min离心10min，取上清。
4、加入等体积酚/氯仿/异戊醇（25：24：1），混匀，8000r/min离心10min，取上清。
再加入等体积酚/氯仿/异戊醇（25：24：1）抽提1次。
5、加入2/3倍体积的-20℃预冷的异丙醇，混匀，-20℃静置1~2h，12000r/min离心15min，去上清。
6、用适量预冷70%乙醇清洗沉淀2次。
7、将沉淀干燥后溶于TE。
8、加入1%体积10mg/L RNaseA于37℃保温60min。
9、加等体积酚/氯仿/异戊醇（25：24：1）抽提2次，12000r/min离心5min，取上清。
10、加入1/10体积3mol/L醋酸钠和2倍体积-20℃预冷的无水乙醇混匀，-20℃静置60min。
11、12000r/min离心10min，弃上清，
12、用70%乙醇清洗沉淀2次，室温干燥。
13、沉淀溶于100μL双蒸水中。
-20℃保存备用。
SDS法提取DNA
DNA抽提缓冲液（lysisbuffer）：50mMTris-Hcl（Ph7.2）50mMEDTA3%SDS1%B-巯基乙醇（用时加）饱和酚：氯仿（V：V,l：1）异丙醇3M醋酸钠NaOAc（Ph8.0）1.称取0.075—0.085g干菌丝置于预冷的研钵中，加入液氮研磨至细粉末状，迅速转至1.5ml的离心管中并加入750plDNA提取缓冲液（65°C预热），在振荡器上振荡几秒钟充分混匀，然后放到65°C水浴锅中水浴60min,每10min摇动一次。
2.加入750』饱和酚：氯仿（V：V4：1）轻轻颠倒离心管数次充分混匀，室温下12000rpm离心15min,取上清液置于新的离心管中。
3.加入1/30体积的3M醋酸钠NaOAc（PH8.0）和0.54体积的异丙醇，轻轻混匀后置于4°C冰箱中30min,室温下12000rpm离心2min,小心倒掉上清液，然后用冷的70%乙醇洗涤沉淀两次（轻轻颠倒离心管若干次），倒掉乙醇。
4.将装有DNA沉淀的离心管置于真空干燥器中，干燥约30min（时间以DNA变干为准）。
5.加入500』的ddH2O溶解DNA沉淀，同时加入1—2plRNase（终浓度为20pg/ml）,37水浴60min。
6.加入等体积的饱和酚：氯仿（V：V4：1），充分混匀，然后室温下12000rpm离心15min,取上清液置于新的离心管中。
7.重复步骤3。
8.重复步骤4。
9.加入100mlTE溶解DNA,待完全溶解后置于一20°C冰箱中备用。
关于基因组酶切：每次切100ul体系，79ulDNA,（浓度200微克以上），单酶切的话酶7微升，buffer14ul，酶切5小时或者过夜都可以。
Q1：Southern杂交的基本原理是什么？应用范围？原理：其基本原理是：具有一定同源性的两条核酸单链在一定的条件下，可按碱基互补的原则形成双链，此杂交过程是高度特异的。
基因组DNA首先用一种或几种限制性内切核酸酶消化，消化后的片段通过标准琼脂糖电泳按照大小进行分离。
SDS提取DNA的方案
1.5.2.2 菌丝体DNA的提取与检测提取缓冲液I：6.2g 葡萄糖，2.0g 聚乙烯吡咯烷酮（PVP），80μL 巯基乙醇，加去离子水定容至100mL。
提取缓冲液II：100mmol/L Tris-Cl（pH8.0），20mmol/L EDTA，500mmol/L NaCl，1.5% SDS。
TE 缓冲液：10 mmol/L Tris-CL（pH 8.0），1 mmol/L EDTA（pH 8.0）酚∶氯仿∶异戊醇（25∶24∶1）。
氯仿∶异戊醇∶乙醇（80∶4∶16）。
其他试剂：液氮、异丙醇、无水乙醇、70%乙醇、3 mol/L NaAc（pH5.2）。
实验步骤:（1）称0.5g 菌丝，放入适中石英砂和液氮，迅速研磨成粉末状，液氮要加3次。
（2）将磨得粉末移入2mL 离心管中，加0.5mL 提取缓冲液I，缓慢混匀。
10000rpm 室温离心10min，吸去上清液；向沉淀中加入0.8mL 提取缓冲液II，缓慢混匀。
65ºC水浴锅中水浴30min，每5min 缓慢旋转混匀一次。
（3）加入0.7mL 酚:氯仿:异戊醇（25:24:1），缓慢混匀。
6000rpm 离心5min。
（4）取上清液转移到另一离心管中，加入1mL 氯仿:异戊醇:乙醇（80:4:16），缓慢倒入混匀，室温下静置5-10min。
（5）室温6000rpm 离心5min。
（6）小心吸取上清液转移到另一离心管中，加入等体积异丙醇，缓慢上下颠倒混匀。
室温下放置5min，出现絮状沉淀。
室温下6000rpm 离心5min。
（7）吸去上清液，向沉淀中加入40ulTE缓冲液，30ul，3mol/L NaAc 和80μL 预冷的无水乙醇，缓慢上下颠倒混匀，-20ºC 冰箱放置2h。
（8）室温下6000rpm 离心5min。
（9）吸去上清液，用1mL70%乙醇漂洗液漂洗两次，6000rpm 离心5min。
倒去上清液，将离心管倒置在干净的吸水纸上轻轻磕几下，尽量去除上清液，放置三min自然干燥后，将沉淀溶于25μLTE 缓溶液中，-20ºC 贮存。
SDS法提取植物基因组DNA
SDS法提取植物基因组DNA【实验目的】学习和掌握常用基因组DNA提取方法。
【实验要求】1.设计所采用实验方案并独立完成所有实验操作；2.获得高纯度、完整DNA样品。
一、原理：利用含高浓度SDS的抽提缓冲液在较高温度（55—65℃）条件下裂解植物细胞，使染色体离析，蛋白质变性，释放出核酸，然后提高盐浓度（KAc）和降低温度（冰上保温）的办法沉淀除去蛋白质和多糖（在低温条件下KAc与蛋白质及多糖结合成不溶物），离心除去沉淀后，上清液中的DNA用酚/氯仿抽提，反复抽提后用乙醇沉淀水相中的DNA。
二、药品试剂及耗材：——液氮——提取缓冲液：500 mmol/L NaCl, 100 mmol/L Tris-HCl ph8, 50 mmol/L EDTA ph8，10 mmol/L 2-巯基乙醇（用前加入）---- 20% SDS ph7.2---- 5 mol/L KAc---- 氯仿：异戊醇（24：1）——异丙醇—— 70%乙醇—— TE缓冲液 :10 mmol/L Tris-HCl,1 mmol/L EDTA,PH8.0耗材：移液枪，15、2.0、1.5ml离心管，篮、黄、白枪头各四套离心管架4个，离心管盒2个，水浴泡沫8个，研钵及小药勺8套棉手套，薄膜手套，透明胶布，剪刀三、操作程序1.将 2 ml离心管中。
2.加入65℃的提取缓冲液(3V)，轻缓振荡混匀，加入达到终浓度2%)，混匀，置65℃水浴中放置30分钟，不时颠倒混匀。
3.加入的醋酸钾（1/10V），混匀，冰浴20分钟，在10000 rpm离心20 min。
需要的话，Miracloth纱布过滤除去沉淀，取上清液转入另一离心管中。
4.24：1），轻轻颠倒混匀， 12000 rpm离心15 min。
5.转移上清液到另一新离心管中，加入（见丝状沉淀）-20℃放置30分钟沉淀核酸。
6.25℃，12000 rpm，离心10 min，收集沉淀。
7.弃上清，70％乙醇洗两次。
DNA提取液配方,粗体方法
主要成分是：NaCl，Tris-HCl（PH=7.4），EDTA（PH=8），SDS。
NaCl，Tris-HCl主要是调节溶液的PH，维持一定的离子浓度,提供一个缓冲液的环境，防止核酸被破坏；EDTA主要是二价金属离子的螯合剂，使影响DNA的DNA酶中的钙离子，锰离子，镁离子等和EDTA结合，使酶失去活性，有利于提取完整DNA；SDS主要是和蛋白质结合，使其变形沉淀，从而利于DNA的提取，减少和清除带白质杂质；裂解细胞！配方：每升中加入EDTA 9.3g， SDS 5g， NaCl 14.6g， Tris 24.2g 相当于Tris 200mM PH=7.4 EDTA 25mM PH=8注意：Tris与EDTA 应当分别配好调PH值器材：灭菌的研磨棒，离心管，配好的DNA提取液，1000ul的移液枪，预冷的异丙醇，离心机，７５％的乙醇，灭超水拟南芥ＤＮＡ粗提步骤；１．选取两片适当大小的叶片放入１．５ｍｌ离心管（已标记）中，用液氮浸没１—２ｓ，取出立刻磨碎至粉末状。
或不用液氮，研磨至匀浆状；２．加入ＤＮＡ提取液８００ｕｌ溶解，同时再次磨样，使之彻底为匀浆，摇匀；３．在１２０００ｒｐｍ条件下，离心１０ｍｉｎ，取上清至另一新离心管（同标记）中，弃去沉淀，（切记：宁少勿沉淀）；４．加入７００ｕｌ异丙醇（－２０℃预冷）至管中，摇晃混匀，然后放置－２０℃下１－２ｈ，或者４℃下过夜，析出ＤＮＡ；５．在１２０００ｒｐｍ下，离心１０ｍｉｎ，弃上清，留沉淀；６．向沉淀中加入７００ｕｌ、７５％的乙醇，进行洗涤，然后在１２０００ｒｐｍ下，离心４ｍｉｎ，重复三次；７．倒出乙醇，在超净工作台上吹干，加入５０ｕｌ灭超水溶解，１２０００ｒｐｍ下，离心４ｍｉｎ，吸取上清液，转至另一新管中备用。
DNA抽提原理解析
分子生物学实验用到的DNA主要是质粒DNA和基因组DNA其提取的主要原理有:1，碱裂解法制备质粒DNA质粒是细胞内的一种环状的小分子DNA是进行DNA重组的常用载体。
作为一个具有自身复制起点的复制单位独立于细胞的主染色体之外，质粒DNA上携带了部分的基因信息，经过基因表达后使其宿主细胞表现相应的性状。
在DNA重组中，质粒或经过改造后的质粒载体可通过连接外源基因构成重组体。
从宿主细胞中提取质粒DNA是DNA重组技术中最基础的实验技能。
分离质粒DNA 有三个步骤:培养细菌使质粒扩增，收集和裂解细菌，分离和纯化质粒DNA。
碱法质粒抽提用到三种溶液:溶液I , 50 mM葡萄糖/ 25 mM Tris-CI / 10 mM EDTA ，pH 8.0 溶液II ，0.2 N NaOH / 1% SDS 溶液III ，3 M醋酸钾/ 2 M醋酸让我们先来看看溶液I的作用。
任何生物化学反应，首先要控制好溶液的pH值，因此用适当浓度的和适当pH值的Tris-Cl溶液，是再自然不过的了。
那么50 mM 葡萄糖是干什么的呢？说起来不可思议，加了葡萄糖后最大的好处只是悬浮后的大肠杆菌不会快速沉积到管子的底部。
因此，如果溶液I 中缺了葡萄糖其实对质粒的抽提本身而言，几乎没有任何影响。
所以说溶液I 中葡萄糖是可缺的。
那么EDTA 呢？大家知道EDTA是Ca2+和Mg2+等二价金属离子的螯合剂，配在分子生物学试剂中的主要作用是：抑制DNase的活性，和抑制微生物生长。
在溶液I 中加入高达10 mM的EDTA无非就是要把大肠杆菌细胞中的所有二价金属离子都螯合掉。
如果不加EDTA其实也没什么大不了的。
只要是在不太长的时间里完成质粒抽提，就不用怕DNA 会迅速被降解，因为最终溶解质粒的TE缓冲液中有EDTA如果哪天你手上正好缺了溶液I，可不可以抽提质粒呢？实话告诉你，只要用等体积的水，或LB培养基来悬浮菌体就可以了。
有一点不能忘的是，菌体一定要悬浮均匀，不能有结块。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
SDS法提取DNA
植物各个部位都可用作总DNA抽提的材料，常用的材料一般为植物幼叶。
其基本原理是：先用机械的方法使组织和细胞破碎，然后加入十二烷基磺酸钠（SDS）等离子型表面活性剂，溶解细胞膜和核膜蛋白，使细胞膜和核膜破裂。
再加入酚和氯仿等表面活性剂，使蛋白变性。
最后加入无水乙醇沉淀DNA；沉淀的DNA，即为植物总DNA，溶于TE溶液中保存备用。
三、实验材料、器具及试剂
水稻幼叶
高速台式离心机，振荡器，水浴箱，离心管架，玻璃滴管，移液器，研钵，离心管，2ml离心管，枪头，烧杯，量筒等。
无水乙醇，氯仿，异戊醇，TE缓冲液（）,抽提液（200mM Tris-HCl, ; 250mM NaCl; 25mM EDTA; %SDS）
四、实验步骤
⑴取幼叶5g左右放于研钵中,加入少许石英砂，再加入400μl抽提液，磨成绿色浆状。
⑵倒入2 ml离心管。
约用400μl抽提液洗涤研钵，也倒入离心管，将两次抽提液混匀。
⑶置于56℃水浴中5分钟。
⑷加入适量氯仿，振荡，充分混匀。
⑸14000rpm离心5分钟。
取上清液于离心管。
⑹加入等体积预冷的无水乙醇，轻轻混匀，静置直到DNA析出。
⑺14000rpm离心2分钟，去上清液。
⑻ 加入70%乙醇漂洗。
适当风干，溶于100-200μl TE溶液中待用。
五、注意事项：
⑴幼叶不宜太多；氯仿的量尽可能多些；与氯仿混合时充分摇匀，否则蛋白变性不完全。
⑵研磨幼叶后匀浆较重要，这直接影响DNA的产量。
⑶ 处理：若第5步上清液较为混浊，则需要重复第4和第5步。