apoB多态性检测的方法(包括VNTR,Eco和MSP酶切多态性)

3 点样时枪头下伸，点样孔内不能有气泡，缓冲液不
要太多 4 EB染料有毒（强致癌物），切勿用手接触，更不要
污染环境，胶勿乱扔
5 紫外线观察不要太久
(2)酶切反应时间：37℃ 终止反应。
12小时，最后65℃ 20min
(3)电泳检测
2% 琼脂糖凝胶电泳, 紫外灯下观察结果： MspI 酶切位点出现M+ M+ ( 含395 bp、 85 bp 2 条带) 、M+ M- ( 含480 bp、395 bp、85bp 3 条带) 和M- M- ( 含480 bp 1 条带) 3 种基因型。

四.操作步骤 （1人1孔）
琼脂糖凝胶板的制备（封板、梳子位置与高度、2%胶
3mm、凝固后拔梳）
倒缓冲液，加样（取基因组DNA样品液 8μl+2μl上样缓冲液（5×），混匀, 上样；）
电泳（恒压100V 1小时）
检测（紫外检测）
PCR扩增HBV基因产物的鉴定
取PCR产物20μl直接上样 1 2 3 4 5 6
GAATTC CTTAAG
EcoR I酶切位点多态性检测 PCR反应
（1）NA模板 Mix ddH2O
1μl
1.5 μl 15 μl 12.5 μ l
94℃ 5min（预变性）
总体积：
30 μl
94℃1min（变性） 58℃3min （复性+延伸） 72℃5min（续延伸） 4℃ 保存
• PCR反应体系 • PCR过程 • PCR的基本原理
apoB-VNTR PCR反应
（1）PCR反应体系 （2）PCR程序
引物
DNA模板 Mix ddH2O
1μl
1.5 μl 15 μl 12.5 μ l
94℃ 5min（预变性）
总体积：
30 μl
94℃60’’（变性） 60℃4min （复性+延伸） 60℃5min（续延伸） 4℃ 保存
上样缓冲液：EDTA—螯合镁，防止DNA降解；含有聚蔗 糖—防止样品扩散；迁移指示剂--溴酚蓝相当于0.5Kb大小；
二、实验目的
掌握琼脂糖凝胶电泳分离DNA的原理和方法
掌握检测DNA的实验方法
三、实验材料
基因组DNA 电泳仪，电泳槽，电子天平，移液器，枪头， 微波炉，紫外透射检测仪等。 琼脂糖，1XTAE电泳缓冲液，EB（溴化乙锭）或EB替代物， 6X加样缓冲液 ：Ⅰ 0.25%溴酚蓝（指示剂，约500bp） ， 0.25%二甲苯青 （指示剂，约5000bp） ，40%蔗糖水溶液 （比重加大，防止扩散）; Ⅱ 0.25%溴酚蓝 ，0.25%二甲苯青 ，30%甘油水溶液
E- E-
E- E+
E+ E+
2.MspI 酶切位点多态性
对个体血脂影响不大，但由于它在CHD 人群 中出现频率较高，推测它与脂质代谢、CHD 发病之间存在某种联系
CCGG GGCC
MspI I酶切位点多态性检测 PCR反应
（1）PCR反应体系 （2）PCR程序
引物
DNA模板 Mix ddH2O
apoB基因多态性分析
apoB基因
• 独立位于2号染色体短臂末端（2p23），单 拷贝。基因全长43kb，含28个内含子和29 个外显子。 • 功能：载脂蛋白B（apoB）是VLDL、IDL 和LDL的主要结构蛋白, 其主要功能是转运 内源性胆固醇, 维持体内血胆固醇平衡。
• apoB基因在所有载脂蛋白基因中具有最明 显的多态性，其核苷酸变异有75处，其中 导致氨基酸变异的有54处。



一、实验原理（2）

电场强度：与电泳速度成正比；（DNA/蛋白质等大分子： 100-500V，即常压电泳；高压电泳：氨基酸/核苷酸等小分子） 溶液PH值：距等电点越远，净电荷越多，则速度越快； 离子强度：越低则带电物质的速度越快。



DNA分子量：越小则越快；
DNA构象：超螺旋＞线性＞开环（质粒） 胶浓度：越低则速度越快 TAE 缓冲液：超螺旋结构更符合其实际分子质量； TBE：缓冲能力强，适合≤ 1 Kb DNA片段
---DNA琼脂糖凝胶电泳
7
1：Marker 2：阳性模板 3：待测样品1
4：待测样品2
5: 待测样品1 6: 待测样品2 7: 待测样品1 8：待测样品2
EB替代品，无需 染色，紫外灯下观 察结果
1%胶，电泳（100V 30min）
五
太高会使制板变形
注意事项
1 倒胶时把握好胶的温度，不要高于60℃ ，否则温度 2 胶一定要凝固好才能拔梳子，方向一定要竖直向上， 不要弄坏点样孔
PCR-VNTR(Variable numble of tandemly repeated short DNA sequence) 多态性检测
PCR；电泳检测
有关PCR反应
标准的PCR反应体系
4种dNTP混合物 引物 Taq DNA聚合酶 Mg2+ 模板DNA 各200μmol/L 各10～100pmol 2.5u 1.5mmol/L 0.1～2μg
一、apoB-VNTR
有关3’ VNTR多态性
3’VNTR位于该基因3’端下游第2个Poly A信号以下 位置的一个可变数目串连重复序列，也称小卫星区 （minisatellite）。根据重复序列长度的不同，可分为 不同的等位基因型，自从1989年首先发现14种Apo B 基因3’VNTR等位基因以来，国内外至今已发现22种 等位基因，长度在400～1200 bp之间，根据重复序列 的内部结构可以把这些重复序列分为两类：一类是 ATAATTAAATATTTT，称为X型；另一类是 ATAATTAAAATATTT，称为Y型。其序列中发生单核苷 酸取代（即G或C取代T）， 又可产生X或Y的变异体Xi、 Yi、Xii和Yii等。VNTR重复序列数目的不同，以及每一 重复序列内部结构的变化决定了VNTR的高度多态性。
30cycle
二、酶切位点多态性
1.EcoR I酶切位点
apoB 基因的EcoR I酶切位点多态性是由于 4154 位密码子突变，使原有的EcoRI 酶切 位点消失，产生E- 等位基因，并使所编码 的谷氨酸被赖氨酸取代。有研究认为具有 突变的E- 等位基因与血浆高胆固醇（TC） 及高低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）的水平 有关，与血浆甘油三酯(TG)、LDL-C 水平 升高相关。
1μl
1.5 μl 15 μl 12.5 μ l
94℃ 5min（预变性）
总体积：
30 μl
94℃1min（变性） 60℃1min （复性） 72℃1min （延伸） 72℃5min（续延伸） 4℃ 保存
30cycle
酶切反应及电泳检测
(1)酶切反应体系：
PCR反应产物 10Xbuffer EcoR I 双蒸水 EcoR I 10ul 2ul 18ul 1ul
M- M-
M- M+
M+ M+
基因组DNA的琼脂糖电泳检测
一、实验原理（1）

琼脂糖是一种天然聚合长链状分子，沸水中溶解 （84-96度），36-42℃ 开始形成多孔性刚性滤孔， 凝胶孔径的大小决定于琼脂糖的浓度（分离0.250kb）； DNA分子在碱性缓冲液（pH8.0）中带负电荷，在外 加电场作用下向正极泳动； DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时，有电荷效应与分 子筛效应。不同DNA的分子量大小、构象及电荷数 不同，电泳时的泳动率就不同，从而分出不同的区带； DNA显色剂多用EB（致癌作用），它能和碱基间的 氢键结合，在波长为254nm~365nm的紫外光（防止 损伤）照射下呈橘红色（530nm）的荧光；
30cycle
酶切反应及电泳检测
(1)酶切反应体系：
PCR反应产物 10Xbuffer EcoR I 双蒸水 EcoR I 10ul 2ul 18ul 1ul
(2)酶切反应时间：37℃ 终止反应。
12小时，最后65℃ 20min
(3)电泳检测
2% 琼脂糖凝胶电泳, 紫外灯下观察结果：
EcoRI 酶切位点出现E+ E+ ( 含253 bp、227 bp 2 条带) 、E+ E- ( 含480bp、253 bp、227 bp 3 条带) 和E- E- ( 含480 bp 1 条带) 3 种基 因型。