第十章 吸光光度法 10.3
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第10章 吸光光度法
产生的光电流应与照射于检测器上的光强度成正比。
光电管 光电倍增管 光二极管阵列
2019/3/30
24
10.2.2 吸收光谱
A~l作图得
吸收曲线 (吸收光谱)
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25
•
最大吸收波长 lmax= 525nm。 吸收曲线是一种特征曲线
•
•
在最大吸收波长附近，吸光度测量的灵敏度最高
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1 S bc M 10 6 ( g / cm 2 ) 1000
将（1）式代（2）中得：
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S = M/ε
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摩尔吸光系数ε的讨论
（1）吸收物质在一定波长和溶剂条件下的特征常数； （2）不随浓度c和光程长度b的改变而改变。在温度和波长
等条件一定时，ε仅与： 扣除非待测组分的吸收
A （样） = A （待测吸光物质） + A （干扰）+ A （池） A （参比） = A （干扰）+ A （池）
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以显色反应为例进行讨论 若欲测 M-R 的吸收 试液 无吸收 基质吸收 无吸收 基质吸收 显色剂 无吸收 无吸收 吸收 吸收 lmax 溶剂 光 学 透 明
该物质的灵敏度越高。ε>105：超高灵敏；
ε=(6～10）×104 ：高灵敏； ε<2×104
：不灵敏。 （6）ε在数值上等于浓度为1mol/L、液层厚度为1cm时该溶 液在某一波长下的吸光度。
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例：氯磺酚S测定钢中的铌 50ml容量瓶中有Nb30μg，用2cm比色池，在 650nm测定光吸收，A＝0.43,求S. (Nb原子量92.91)。
COOH HO CH3 Cl C Cl SO3H COOH O CH3
吸光光度法
单色器 作用:产生单色光 常用的单色器：棱镜和光栅 样品池（比色皿） 厚度(光程): 0.5, 1, 2, 3, 5…cm 材质：玻璃比色皿－－可见光区 石英比色皿－－可见、紫外光区
检测器 作用：接收透射光，并将光信号转化为电信号 常用检测器： 光电管 光电倍增管 光二极管阵列
光电管分为红敏和紫敏，阴极表面涂银和氧 化铯为红敏，适用625－1000nm波长；阴极 表面涂锑和铯为紫敏，适用200－625nm波长
T－透光率（透射比）（Transmittance）
T=
A 吸光度
It I0
A = lg (I0/It) = lg(1/T) = -lgT
I I-dI I0
朗伯定律(1760)
It
s
b dx
A=lg(I0/It)=k1b
比尔定律(1852)
A=lg(I0/It)=k2c
A=lg(I0/It)=kbc
根据吸光度的加和性可以进行多组分的测定以及 某些化学反应平衡常数的测定
光吸收曲线
有色溶液对各种波长的光的吸收情 况，常用光吸收曲线来描述。将不 同波长λ的单色光依次通过一定的 有色溶液，分别测出对各种波长光 的吸收程度（即吸光度，用字母A 表示）。以波长λ为横坐标，吸光 度为纵坐标作图，所得的曲线称为 吸收曲线或吸收光谱曲线。
准确度高
依据化学反应, 使用玻璃仪器
仪器分析：微量组分(<1%), Er 1%～5% 灵敏度高 依据物理或物理化学性质, 需要特殊的仪器
吸光光度分析法是以物质对光的选择 性吸收为基础的分析方法。根据物质 所吸收光的波长范围不同，吸光光度 分析法又有紫外、可见及红外分光光 度法。本章重点讨论可见光光度法 （又称分光光度法，简称光度法）。
第十章 吸光光度法S
2、化学因素——溶液本身的化学反应引起的 偏离
溶液中的吸光物质常因解离、缔合、形成新化 合物或互变异构等化学变化而改变其浓度，因而 导致偏离朗伯—比尔定律。 A 解离：大部分有机酸碱的酸式、碱式对光有不同 的吸收性质，溶液的酸度不同，酸 ( 碱 ) 解离程度 不同，导致酸式与碱式的比例改变，使溶液的吸 光度发生改变。 B 络合：显色剂与金属离子生成的是多级络合物， 且各级络合物对光的吸收性质不同，例如在Fe(Ⅲ) 与 SCN- 的 络 合 物 中 ， Fe(SCN)3 颜 色 最 深 ， Fe(SCN)2+ 颜色最浅，故 SCN- 浓度越大，溶液颜 色越深，即吸光度越大。
2、K的讨论 Ⅰ吸收系数a 当浓度c用g· L-1，液层厚度b用cm为单位 表示，则K用另一符号a来表示。 a称为 吸收系数，单位为 L· g-l· cm-1，它表示质 量浓度为l g· L-1，液层厚度为lcm时溶液 的吸光度。
A abc
Ⅱ摩尔吸收系数molar absorptivity 当浓度c用mol· L-1，液层厚度b用cm为单位 表示，则 K 用另一符号 κ 来表示。 κ 称为摩 尔吸收系数，单位为 L· mol-l· cm-1 ，它表示 物质的量浓度为l mol· L-1，液层厚度为lcm 时溶液的吸光度。最大吸收处的摩尔吸收 系数κmax
光谱名称 x射 线 远紫外光 近紫外光 可 见光 近红外光 中红外光 远红外光 微 波 无线电波 波长范围 10-1~l0 nm 10~200 nm 200~400 nm 400~750 nm 0.75~2.5 μm 2.5~5.0 μm 5.0~1000 μm 0.1~100 cm 1~1000 m 表 6-1 电磁波谱范围表 跃迁类型 辐 射 源 K 和 L 层电子 x 射线管 中层电子 氢、氘、氙灯 价电子 氢、氘、氙灯 价电子 钨灯 分子振动 碳化硅热棒 分子振动 碳化硅热棒 分子转动和振动 碳化硅热棒 分子转动 电磁波发生器 分析方法 x 射线光谱法 真空紫外光度法 紫外光度法 比色及可见光度法 近红外光度法 中红外光度法 远红外光度法 微波光谱法 核磁共振光谱法
第30讲 第十章 吸光光度法
第四节
吸光光度法分析条件的选择
一、显色反应及其条件的选择 （一）显色反应和显色剂 1.显色反应 将试样中被测组分转变成有色化合物的反应。 将试样中被测组分转变成有色化合物的反应。 显色反应： 显色反应：络合反应和氧化还原反应 选择显色反应应注意的 : (1) 选择性要好 (2)灵敏度要高 (3)对比度要大 (4)有色化合物的组成要恒定,化学性质要稳定 有色化合物的组成要恒定, (5)显色反应的条件要易于控制。 显色反应的条件要易于控制。
第一节 物质对光的选择性吸收
一、光的基本性质 波长、频率与速度之间的关系为： 波长、频率与速度之间的关系为： E=hν =hc/ λ 普朗克常数，其值为6 63× h：普朗克常数，其值为6.63×10-34J·s 二、物质对光的选择性吸收 1.固体物质 如果物质对各种波长的光完全吸 则呈现黑色 如果完全反射，则呈现白色 黑色； 白色； 收，则呈现黑色；如果完全反射，则呈现白色； 如果对各种波长的光吸收程度差不多，则呈现灰 如果对各种波长的光吸收程度差不多，则呈现灰 如果物质选择性地吸收某些波长的光，那么， 色；如果物质选择性地吸收某些波长的光，那么， 这种物质的颜色就由它所反射或透过光的颜色来 决定。 决定。
2. 桑德尔灵敏度（μg·cm-2） 桑德尔灵敏度（ 定义：当光度仪器的检测极限为A=0.001 A=0.001时 定义：当光度仪器的检测极限为A=0.001时， 单位截面积光程内所能检出的吸光物质的最低 质量。 质量。
1 6 S= × bcM ×10 1000 3 = bcM ×10 = 0.001
3．介质不均匀性引起的偏离 （二）化学因素 1．溶液浓度过高引起的偏离 当溶液浓度较高时， 当溶液浓度较高时 ， 吸光物质的分子或离子 间的平均距离减小， 间的平均距离减小，从而改变物质对光的吸收能 力。浓度增加，相互作用增强，导致在高浓度范 浓度增加，相互作用增强， 围内摩尔吸收系数不恒定而使吸光度与浓度之间 的线性关系被破坏。 的线性关系被破坏。 2. 化学变化所引起的偏离 溶液中吸光物质常因解离、缔合、 溶液中吸光物质常因解离、缔合、形成新的化 合物或在光照射下发生互变异构等， 合物或在光照射下发生互变异构等，从而破坏了 平衡浓度与分析浓度之间的正比关系。 平衡浓度与分析浓度之间的正比关系。
第十章吸光光度法
722型可见分光光度计
特点：能在可见光谱区域内对物质作定性定量分析。采用光栅单色器、具有波长精度高，单色性好等优点。采用3 位LED数字显示，T.A.C直读。波长范围：330－800nm波长精确度：±2nm
752型紫外可见分光光度计
特点：采用全息闪耀光栅单色器，具有波长精度高，单色性好，杂散光低等优点。能自动切换钨卤灯和氘灯。采用3 位LED数字显示，具有T.A.C直读能。技术指标:波长范围：200－800nm稳定性：暗电流漂移0.5％(τ)3min
电磁波
波长范围
跃迁类型
分析措施
X-射线
10-1-10nm
K、L层电子
X射线光谱法
远紫外光
10-200nm
中层电子
真空紫外光度法
近紫外光
200-400nm
价电子
紫外光度法
可见光
400-750nm
比色及可见光度法
近红外光
0.75-2.5m
分子振动
红外光谱法
中红外光
2.5-50m
第一节、吸光光度法概述
原则系列法旳优点是仪器简朴，操作简便，而且可在复合光下进行测定.其缺陷是配制原则色阶比较费时，因为某些有色x
二、光电比色法与分光光度法
(一)、基本原理和特点1、原则曲线法光度法与目视法比较，其优点是:用光电池替代肉眼进行测量，消除了肉眼旳主观误差，提升了分析成果旳精确度.
第二节、吸光光度法旳基本原理
一、互补色光白光：复合光复合光 单色光 单色器单色光1 ＋ 单色光2 白光 互补色光
白 光
二、物质旳颜色和对光旳选择吸收
(1)、光吸收程度最大处旳波长，称为最大吸收波长，常用λmax表达.(2)、光吸收曲线与物质特征有关，这些特征客作为物质定性鉴定旳根据.(3)、构成量度不同旳同种物质旳溶液，在一定波优点吸光度随溶液旳构成量度增长而增大，这个特征可作为物质定量分析旳根据.
特点：能在可见光谱区域内对物质作定性定量分析。采用光栅单色器、具有波长精度高，单色性好等优点。采用3 位LED数字显示，T.A.C直读。波长范围：330－800nm波长精确度：±2nm
752型紫外可见分光光度计
特点：采用全息闪耀光栅单色器，具有波长精度高，单色性好，杂散光低等优点。能自动切换钨卤灯和氘灯。采用3 位LED数字显示，具有T.A.C直读能。技术指标:波长范围：200－800nm稳定性：暗电流漂移0.5％(τ)3min
电磁波
波长范围
跃迁类型
分析措施
X-射线
10-1-10nm
K、L层电子
X射线光谱法
远紫外光
10-200nm
中层电子
真空紫外光度法
近紫外光
200-400nm
价电子
紫外光度法
可见光
400-750nm
比色及可见光度法
近红外光
0.75-2.5m
分子振动
红外光谱法
中红外光
2.5-50m
第一节、吸光光度法概述
原则系列法旳优点是仪器简朴，操作简便，而且可在复合光下进行测定.其缺陷是配制原则色阶比较费时，因为某些有色x
二、光电比色法与分光光度法
(一)、基本原理和特点1、原则曲线法光度法与目视法比较，其优点是:用光电池替代肉眼进行测量，消除了肉眼旳主观误差，提升了分析成果旳精确度.
第二节、吸光光度法旳基本原理
一、互补色光白光：复合光复合光 单色光 单色器单色光1 ＋ 单色光2 白光 互补色光
白 光
二、物质旳颜色和对光旳选择吸收
(1)、光吸收程度最大处旳波长，称为最大吸收波长，常用λmax表达.(2)、光吸收曲线与物质特征有关，这些特征客作为物质定性鉴定旳根据.(3)、构成量度不同旳同种物质旳溶液，在一定波优点吸光度随溶液旳构成量度增长而增大，这个特征可作为物质定量分析旳根据.
第10章 吸光光度法
价电子
分子振动 分子转动
钨灯
碳化硅热棒 电磁波发生器
比色及可见光度法
红外光度法 微波光谱法 核磁共振光谱法
2. 分子吸收光谱产生原理
吸收光谱是由物质对不同波长的光具有选择性吸收 作用而产生的。 由物质的价电子能级跃迁 （能量差在1~20eV）而 产生的吸收光谱，是紫外及可见分光光度法——本章 研究内容。 由物质的分子振动能级（能量差约0.05~l eV）和 转动能级（能量差小于0.05 eV）的跃迁而产生的吸收 光谱，为红外吸收光谱法——用于分子结构的研究。 说明：物质只有对特定波长(能量)的光才能有吸收。
△T为透光率读数的绝对误差，一般为± 0.01。
Er-T 关系图： Er ≤±4%时:
T: 15%~65 %
A: 0.2~0.8
T = 36.8 %，A = 0.434 时误差最小。
10.5 示差吸光光度法
1. 示差吸光光度法的原理 (高浓度) 常规法: 以试剂空白为参比
A bCx
示差法: 以浓度为 Cs 的标准溶液为参比 (Cs＜Cx)
3. 有色溶液对光的选择性吸收
① 单色光、复合光、互补光 单色光:具有同一波长的光
复合光:包含不同波长的光 互补光: 若两种不同颜色 的单色光按一定的强 度比例混合得到白光， 这两种单色光为互补 光。 绿
蓝绿
黄
绿蓝
橙
蓝 紫
红
② 有色溶液对光的吸收
吸收黄色光
复合光
完全透过
溶液的颜色与其吸收掉光的颜色为互补色。 有色溶液呈现不同颜色的原因: 物质的电子结构不同，价电子跃迁所需能量不同， 所吸收光的波长不同，因此溶液对光的选择性吸收， 使其呈现不同颜色。
a. 选择性好
吸光度
第10章 吸光光度法
10.1 概述 10.2 吸光光度法基本原理 10.3 分光光度计 10.4 显色反应及影响因素 10.5 常用的吸光光度法
10.1 概述
吸收光谱 发射光谱 散射光谱
分子光谱
原子光谱
吸光光度法：基于物质对光的选择性吸收。
10.2 吸光光度法基本原理
1 光谱产生的原因
目视比色法—比色管
光电比色法—光电比色计
光源、滤光片、比色池、硒光电池、检流计
分光光度法与分光光度计
722型分光光度计光学系统图
1.光源；2.滤光片；3,8聚光镜 4,7.狭缝；5.准直镜；6.光栅 9.比色池；10.光电管
10.4 显色反应及影响因素
1 显色反应 没有颜色的化合物，需要通过适当的反应定量 生成有色化合物再测定－－ 显色反应 要求： a. 选择性好 b. 灵敏度高 (ε>104) c. 化学性质稳定 d. 反应物和产物有明显的颜色差别 (l>60nm)
单色器 作用:产生单色光 常用的单色器：棱镜和光栅 样品池（比色皿） 厚度(光程): 0.5, 1, 2, 3, 5…cm 材质：玻璃比色皿－－可见光区 石英比色皿－－可见、紫外光区
检测器 作用：接收透射光，并将光信号转化为电信号 常用检测器： 光电管 光电倍增管 光二极管阵列
光电管分为红敏和紫敏，阴极表面涂银和氧 化铯为红敏，适用625－1000nm波长；阴极 表面涂锑和铯为紫敏，适用200－625nm波长
AsO3 H2
N N HO3S OH OH H2 O3 As N N SO3H
5 影响因素 a 溶液酸度（pH值及缓冲溶液）
影响显色剂的平衡浓度及颜色，改变Δl
10.1 概述 10.2 吸光光度法基本原理 10.3 分光光度计 10.4 显色反应及影响因素 10.5 常用的吸光光度法
10.1 概述
吸收光谱 发射光谱 散射光谱
分子光谱
原子光谱
吸光光度法：基于物质对光的选择性吸收。
10.2 吸光光度法基本原理
1 光谱产生的原因
目视比色法—比色管
光电比色法—光电比色计
光源、滤光片、比色池、硒光电池、检流计
分光光度法与分光光度计
722型分光光度计光学系统图
1.光源；2.滤光片；3,8聚光镜 4,7.狭缝；5.准直镜；6.光栅 9.比色池；10.光电管
10.4 显色反应及影响因素
1 显色反应 没有颜色的化合物，需要通过适当的反应定量 生成有色化合物再测定－－ 显色反应 要求： a. 选择性好 b. 灵敏度高 (ε>104) c. 化学性质稳定 d. 反应物和产物有明显的颜色差别 (l>60nm)
单色器 作用:产生单色光 常用的单色器：棱镜和光栅 样品池（比色皿） 厚度(光程): 0.5, 1, 2, 3, 5…cm 材质：玻璃比色皿－－可见光区 石英比色皿－－可见、紫外光区
检测器 作用：接收透射光，并将光信号转化为电信号 常用检测器： 光电管 光电倍增管 光二极管阵列
光电管分为红敏和紫敏，阴极表面涂银和氧 化铯为红敏，适用625－1000nm波长；阴极 表面涂锑和铯为紫敏，适用200－625nm波长
AsO3 H2
N N HO3S OH OH H2 O3 As N N SO3H
5 影响因素 a 溶液酸度（pH值及缓冲溶液）
影响显色剂的平衡浓度及颜色，改变Δl
吸光光度法习题
第十章吸光光度法一、单项选择题(共25题）10.1。
1 在光度分析中，以1cm的比色皿测量透光率为T，若比色皿的厚度增加一倍，透过率为（）A、T/2B、T2C、2T D10.1.2 相同质量Fe3+和Cd2+（Mr（Fe）=55。
85，Mr（Cd)=112.4）,各用一种显色剂在同样体积溶液中显色,用分光光度法测定，前者用2cm比色皿，后者用1cm比色皿，测得吸光度相同，则两种有色络合物的摩尔吸光系数ε为（）A、基本相同B、Fe3+为Cd2+两倍C、Cd2+为Fe3+两倍D、Cd2+为Fe3+四倍10。
1.3 以下说法错误的是（)A、摩尔吸光系数ε随浓度增大而增大B、吸光度A随浓度增大而增大C、透过率T随浓度增大而增大D、透过率T随比色皿加厚而减小10。
1。
4 Ni（NH3）42+络离子为绿色溶液,其吸收最大的光的颜色为( ）A、绿色B、红色C、紫色D、黄色10。
1。
5 以下说法错误的是（)A、吸光度A与浓度C成直线关系B、透光率随浓度的增加而减少C、当透过率为“0”时吸光度为∞D、选用透过率与浓度做工作曲线准确度高10。
1。
6 分光光度计检测器直接测定是( ）A、入射光的强度B、吸收光的强度C、透过光的强度D、散射光的强度10。
1.7 某金属离子M与试剂R形成一有色络合物MR，若溶液中M的浓度为1。
0⨯10-4mol/L,用1cm比色皿于波长525nm处测得吸光度A为0。
400，此络合物在525nm处的摩尔吸光系数ε为（）A、4。
0⨯10—3 L*mol—1*cm—1B、4.0⨯103 L＊mol—1＊cm-1C、4.0⨯10-4 L*mol—1*cm—1D、4.0⨯105 L*mol—1＊cm—110.1.8 测定纯金属钴中锰时，在酸性溶液中以KIO4氧化Mn2+成MnO4-光度测定，测定试样中锰时,其参比溶液为（)A、蒸馏水B、含KIO4的试样溶液C、KIO4溶液D、不含KIO4的试样溶液10。
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分光光度计
7
分光光度计
8
752紫外可见分光光度计
紫外-可见分光光度计UV-2450/2550
9
（1）光源
要求：足够的发光强度，各波段光强分布均匀、稳定，能在较宽的光谱 区内提供连续辐射。
可见区，用白炽灯光源。钨丝灯（6－12v）360－800nm 碘钨灯320－2500nm
（2）单色器
用来将光源发出的连续光谱分解为单色光 棱镜（光的折射原理）玻璃、石英
15
小结 一、公式
E h
hc
A= κ bc
I0 A lg lg T It S M k
二、光的色散与互补色光
16
同学们好！
上课了！大家安静！
1
10.3 光度分析的方法和仪器
1、目视比色法
定义：肉眼比较溶液颜色以确定物 质 含量 方法原理（右图） 优点：仪器简单，操作简便，灵敏度 高 缺点：准确度不高，标准系列不能久 存
标准系列
未知样品
2、吸光光度法
利用光电效应，测量透过光的强度， 以测定物质含量的方法 方法原理（下页图示）
双光束分光光度计 Jasco-UV/VIS UV-2450/2550 760CRT 单波长单光束分光光度计
0.575
光源
单色器
检测器
显示
吸收池
4
单波长双光束分光光度计
光束分裂器
光源 单色器
比值
吸收池
检测器
显示
分光光度计的基本部件：光源、单色器、吸收池、检测器、显示器
5
光源
单色器
样品室
检测器
显示
6
光栅（光的衍射和干涉原理）分辨率高，波长范围宽
滤光片（80年代，581－G光电比色计）
（3）吸收池（拿毛面）
玻璃－可见区；石英－紫外区
（4）检测器：将透过光转化为电信号进行测量
光电管、光电倍增管、硒光电池（72型、581-G）
（5）合光分解成单色光并可从中选出一
2
0.575
光源
单色器
吸收池
检测器
显示器
特点：①准确度较高 ②利用吸光度的加和性进行多组分同时测 定 ③测定范围广（可见、紫外） 3、分光光度计及其基本部件
分光光度计 测物质含量 紫外分光光度计 按波长分
红外分光光度计 －用于结构分析
3
可见分光光度计
按光束分
单光束分光光度计 722、721、723、752
13
4. 检测系统
将光强度转换成电流来进行测量。光电检测器。
要求：对测定波长范围内的光有快速、灵敏的响应，
产生的光电流应与照射于检测器上的光强度成正比。 (1)光电管
14
(2)光电二极管阵列
光照射
电容器 充电
再次充电 测量周期
电容器 放电
电容器再次充电的电量与每个二 极管检测到的光子数目成正比， 而光子数又与光强成正比。通过 测量整个波长范围内光强的变化 就可得到吸收光谱。
任意波长单色光的光学系统。
①入射狭缝：光源的光由此进入单色器；
②准光装置：透镜或
返射镜使入射光成为 平行光束； ③色散元件：将复合 光分解成单色光;棱镜
或光栅
11
光栅
12
3. 样品室
样品室放置各种 类型的吸收池（比色皿） 和相应的池架附件。吸 收池主要有石英池和玻 璃池两种。在紫外区须 采用石英池，可见区一 般用玻璃池。