骨质疏松小鼠骨组织中miR21及Smad7的表达及其与骨密度的相关性

·44·· 论著 ·骨质疏松小鼠骨组织中miR-21及Smad7的表达及其与骨密度的相关性邓纯博，刘林，肖正俊，阿良，李洪秋（沈阳医学院附属中心医院运动创伤骨科，沈阳 110024）摘要 目的探讨去势骨质疏松模型骨组织中miR-21及其调控蛋白Smad7的含量变化，及其与骨密度的相关性。

方法将30只12周龄WTC57BL/6J雌性小鼠双侧卵巢切除，建立骨质疏松模型，应用免疫组化检测切除卵巢后不同时间点（0周、1周、2周、4周、6周及8周）骨组织中Smad7的表达水平，实时PCR方法检测不同时间点骨组织中miR-21及靶基因Smad7的mRNA水平，检测不同时间点股骨远端骨密度。

结果免疫组化研究发现，骨质疏松小鼠骨组织中Smad7随着时间的延长，其表达逐渐增强。

实时PCR 检测结果显示，骨组织中miR-21随着卵巢切除的时间逐渐延长，其表达逐渐降低，而Smad7随着卵巢切除的时间逐渐延长，表达逐渐增强。

通过检测小鼠骨组织骨密度值并进行相关分析发现，随着时间的推移，小鼠的骨密度逐渐下降。

结论小鼠去势后，骨密度逐渐降低，miR-21表达与骨密度值呈正相关，而Smad7与骨密度值呈负相关。

关键词 微小RNA；骨质疏松；成骨分化； miR-21； Smad7；骨密度中图分类号 R589.5 文献标志码 A 文章编号 0258-4646 （2019） 01-0044-04网络出版地址 /kcms/detail/21.1227.R.20181228.1331.018.htmlDOI：10.12007/j.issn.0258‐4646.2019.01.009Expression of miR-21 and Smad7 in the Osseous Tissues of Osteoporotic Mice andIts Correlation with Bone Mineral DensityDENG Chunbo，LIU Lin，XIAO Zhengjun，A Liang，LI Hongqiu（Department of Orthopaedics and Sports Medicine Surgery，The Central Hospital of Shenyang Medical College，Shenyang 110024，China）Abstract Objective To investigate the changes in the expression levels of miR-21 and its regulatory proteins in bone tissues of osteo-porotic mouse model，and its correlation with bone mineral density. Methods Thirty ovariectomized （ovx） female mice were randomly divided into six groups according to different observation time （0 week，1 week，2 weeks，4 weeks，6 weeks，and 8 weeks，respectively） . Smad7 expression level in the tissues of the distal femur of these mice was immunohistochemically analyzed. Real time PCR was performed at different time points for detecting changes in the mRNA levels of miR-21 and Smad7 target genes in the bone tissue. Dual-energy X-ray absorptiometry （DXA） was used to measure the distal femoral bone density in mice of each group. Results Immunohistochemical study revealed that the expression of Smad7 in the bone tissue of osteoporostic mouse gradually increased over time. Real time PCR analysis showed that the expression of miR-21 gradually decreased，whereas the expression of Smad7 gradually increased. Over time，the bone den-sity of mice gradually decreased，indicating that miR-21 was positively correlated with bone density，whereas Smad7 was negatively cor-related with bone density. Conclusion Bone density of the osteoporotic mice gradually decreases. The expression of miR-21 is positively correlated with bone density，while that of Smad7 is negatively correlated with bone density.Keywords microRNA； osteoporosis； osteogenesis； miR-21； Smad7； bone mineral densitySmad7是转化生长因子 β / 骨形态发生蛋白 （transforming growth factor β/bone morphogenetic pro-tein，TGF-β/BMP）信号通路内源性负反馈调节因子［1］，Smad7与R-Smad蛋白结合干扰拮抗TGF-β信号，BMP与活化的TGF-βRI和Smad7有协同作用［2］。

Smad7也可以通过激活核因子κβ（NF-kappaB in-hibitor alpha，NF-κB）或信号传导子和转录活化子1 （signal transducer and activator of transcription 1，STAT1） 来抑制TGF-β信号［3］。

TGF-β/BMP信号在成骨分化及骨形成过程发挥着重要作用［4］，前期研究发现，miR-21在骨质疏松患者血浆中表达下降，miR-21可通过调节Smad7促进成骨细胞分化和矿化，因此深入研究miR-21及Smad7的作用机制是有必要的。

通过建立卵巢切除 （ovariectomized，OVX）鼠模型发现，miR-21可以促进成骨细胞分化，抑制miR-21基金项目：辽宁省自然科学基金 （217011705-301）；沈阳医学院科技基金 （20141032）作者简介：邓纯博 （1982-） ，男，主治医师，硕士.通信作者：李洪秋，E-mail：hongqiulee@收稿日期：2018-02-23网络出版时间：2018-12-29 14:39中国医科大学学报 第48卷 第1期 2019年1月Journal of China Medical University Vol.48 No.1 Jan. 2019·45·可减轻雌激素缺乏引起的骨质疏松症［6-7］。

研究［8-10］表明，Smad7蛋白表达改变常导致人类疾病。

但是，Smad7在骨质疏松中的具体作用目前没有报道。

Smad7能够抑制小鼠成骨细胞增殖、分化和矿化［11］，部分敲除Smad7基因可调控TGF-β/BMP信号通路进而影响小鼠体内骨形成及矿化［12］。

本研究建立鼠骨质疏松动物模型，检测miR-21/Smad7在骨组织内的表达及其与骨密度的关系，旨在揭示miR-21/Smad7在绝经后骨质疏松中的作用机制。

1材料与方法1.1 实验动物选取30只12周龄WTC57BL/6J雌性小鼠，体质量18~22 g，由中国医科大学附属盛京医院动物实验中心提供，分笼饲养，自由摄食饮水。

根据不同观察时间点，将30只小鼠随机分成6组：切除卵巢组、切除卵巢1周组、切除卵巢2周组、切除卵巢4周组、切除卵巢6周组和切除卵巢8周组，每组5只。

1.2 主要试剂及仪器戊巴比妥钠 （上海生工生物工程公司） ，TRIzol Reagent Invitrogen （美国Sigma公司） ，逆转录试剂盒 （日本TaKaRa公司） ，real-time PCR试剂盒 （日本TaKaRa公司） ，抗鼠Smad7抗体 （美国Abcom公司） ，兔抗小鼠二抗 （武汉博士德生物工程有限公司） ，Inveon micro-CT系统 （德国 Siemens AG公司） ，组织切片机 （德国Leica公司） ，荧光显微镜 （德国 Leica公司） ，二氧化碳恒温孵箱 （美国Forma公司） ，离心机 （日本Kubota公司） ，倒置相差显微镜及照相系统 （日本Olympas公司） ，分光光度仪 （德国 Eppendorf公司） ，双能X线骨密度仪 （美国Hologic公司） 。

1.3 实验方法1.3.1 OVX小鼠骨质疏松模型：所用小鼠经腹腔注射1%戊巴比妥钠 （0.1 mL/100 g） ，待小鼠完全麻醉后，取俯卧位手术。

在双侧第3腰椎背侧正中做一约0.5 cm切口，钝性分离，剪开腹膜后用组织镊探入切口，找到卵巢，将其从靠近输卵管端结扎，眼科剪剪除，随后将剩余组织还纳腹腔，缝合切口。

将30只小鼠按观察时间点分为：切除卵巢0周组、切除卵巢1周组、切除卵巢2周组、切除卵巢4周组、切除卵巢6周组和切除卵巢8周组。

1.3.2 取材：在OVX后不同观察时间点将行骨密度测定的小鼠颈椎脱臼处死，用手术剪从髋关节及膝关节离断分离双侧股骨，去除肌肉和筋膜。

每只小鼠的双侧股骨进行骨密度检测，将行骨密度的股骨随机取一侧股骨行免疫组化染色，另一侧股骨行miR-21和Smad-7 mRNA含量检测［5］。

1.4 主要观察指标1.4.1 小鼠骨密度测定：在OVX后不同观察时间点，使用双能X线骨密度仪并应用小动物骨密度测定软件，对小鼠双侧股骨远端行骨密度检测。