巴斯德毕赤酵母表达外源蛋白的研究进展

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毕赤酵母中高效引导外源蛋白分泌的信号肽的研究

毕赤酵母中高效引导外源蛋白分泌的信号肽的探究毕赤酵母被广泛应用于外源蛋白的表达和分泌，但其分泌机制依旧存在瓶颈。

信号肽作为外源蛋白分泌的关键信号，可以增进蛋白的正确折叠和定位。

本探究合成了多个信号肽并测试了其诱导外源蛋白分泌的效果。

结果显示，其中一个信号肽在毕赤酵母中具有高效的引导外源蛋白分泌的作用，并可提高外源蛋白的表达量。

这一探究为毕赤酵母外源蛋白分泌的机制探究和工业应用提供了新思路。

关键词：毕赤酵母、信号肽、外源蛋白分泌、表达、折叠定位正文：引言毕赤酵母是一种广泛应用于外源蛋白表达和分泌的真菌，其工业用途广泛，包括生产酶、生物肥料、食品添加剂等。

外源蛋白的表达和分泌是毕赤酵母应用的基础，因此其分泌机制的探究具有重要的理论和应用价值。

信号肽被认为是蛋白在细胞内穿过细胞膜从而被分泌到细胞外所必需的关键信号。

近年来，通过信号肽的调控已经在多种真菌中实现了外源蛋白的高效表达和分泌。

因此，寻找高效的信号肽，探究其引导外源蛋白分泌的机制，具有重要的应用前景。

材料和方法合成了11种可能具有对毕赤酵母分泌效果的信号肽，并转化到毕赤酵母中。

以GFP作为模型蛋白，不同信号肽在GFP表达和分泌过程中的诱导效果进行比较。

同时，测定了其中一个信号肽对外源蛋白表达量和分泌量的影响，并通过Western blot分析外源蛋白的分泌效果和分泌途径分析来探究信号肽的作用机制。

结果在11种信号肽中，有一个信号肽（称为SgPEP1）能够显著增加GFP的分泌效率，同时提高了外源蛋白的表达量。

Western blot和分泌途径分析显示，SgPEP1作用于胞内和胞外蛋白的定位和折叠，增进蛋白正确地进入胞外。

谈论本探究中发现的SgPEP1信号肽在毕赤酵母外源蛋白表达和分泌中具有高效的引导作用，这为改善毕赤酵母的表达和分泌效率提供了新思路。

在信号肽的机理探究中，需要进一步探究其在外源蛋白折叠中的作用方向和机制，以便更好地控制蛋白的定向和拓扑。

毕赤酵母实验操作手册

毕赤酵母表达实验手册大肠杆菌表达系统最突出的优点是工艺简单、产量高、生产成本低。

然而，许多蛋白质在翻译的修饰加工，如磷酸化、糖基化、酰胺化及蛋白酶水解等过程才能转化成活性形式。

大肠杆菌缺少适合用于表达结构复杂的蛋白质。

另外，蛋白质的活性还依赖于形成正确的二硫键并折叠成高级结表达的蛋白质往往不能进行正确的折叠，是以包含体状态存在。

包含体的形成虽然简化了产物的纯的活性，为了得到有活性的蛋白，就需要进行变性溶解及复性等操作，这一过程比较繁琐，同时增与大肠杆菌相比，酵母是低等真核生物，具有细胞生长快，易于培养，遗传操作简单等原核生物的生物时表达的蛋白质进行正确加工，修饰，合理的空间折叠等功能，非常有利于真核基因的表达，菌系统缺乏蛋白翻泽后加工、修饰的不足。

因此酵母表达系统受到越来越多的重视和利用。

大肠杆菌是用得最多、研究最成熟的基因工程表达系统，当前已商业化的基因工程产品大多是通过其主要优点是成本低、产量高、易于操作。

但大肠杆菌是原核生物，不具有真核生物的基因表达调加工修饰能力，其产物往住形成没有活性的包涵体，需要经过变性、复性等处理，才能应用。

近年程菌表达外源蛋白日益引起重视，主更是因为酵母是单细胞真核生物，不但具有大肠杆菌易操作、化生产的特点，还具有真核生物表达系统基因表达调控和蛋白修饰功能，避免了产物活性低，包涵间题［1］。

与大肠杆菌相比，酵母是单细胞真核生物，具有比较完备的基因表达调控机制和对表达产物的们对酿酒酵母（Saccharomyces.Cerevisiae）分子遗传学方面的认识最早，酿酒酵母也最先作为外宿主．1981年酿酒酵母表达了第一个外源基因一干扰素基因，随后又有一系列外源基因在该系统得素和胰岛素已大量生产并在人群中广泛应用，但很大部分表达由实验室扩展到工业规模时，培养基数的选择压力消失，质粒变得不稳定，拷贝数下降，而大多数外源基因的高效表达需要高拷贝数的量下降。

同时，实验室用培养基复杂而昂贵，采用工业规模能够接受的培养基时，往往导致产量的酵母的局限，人们发展了以甲基营养型酵母（methylotrophic yeast）为代表的第二代酵母表达系甲基营养型酵母包括：Pichia、Candida等．以Pichia.pastoris（毕赤巴斯德酵母）为宿主的外源来发展最为迅速，应用也最为广泛，已利用此系统表达了一系列有重要生物学活性的蛋自质。

毕赤酵母表达研究进展

利用强效可调控启动子AOX，已高效表达了HBsAg、TNF、EGF、破伤风毒素C片段、基因1工程抗体等多种外源基因［11、12、13］，证实该系统为高效、实用、简便，以提高表达量并保持产物生物学活性为突出特征的外源基因表达系统，而且非常适宜扩大为工业规模［14］11. 彭毅，杨希才，康良仪。

影响甲醇酵母外源蛋白表达的因素。

生物技术通报2000，4：33-3612. 11 3 Cregg JM . Tschopp JF Stillman C, et al .High-level expression and efficient assembly of hepatitis B surface antigen in the methylotrophic yeast pichia.pastoris Bio/Technology,1987,5:479-48513. Sreekrishma K , Nelles L ，Potenz R，et al .High-level expression ,purification ,and characterization of recombinant human tumor necrosis factor synthesized and characterization in the methylotrophic yeast pichia .pastoris ,Biochemistry ,1989,28:4117-412514. Siegel RS , Buckholz RG, Thill GP , et al .Production of epider growth factor in methylotrophic yeast cells, International Patent Application ,1990 ,Publication No:WO90/10697毕赤酵母是甲醇营养型酵母，可利用甲醇作为其唯一碳源。

毕赤酵母表达经验总结

毕赤酵母表达经验总结甲醇酵母表达系统有不少优点，其中以Invitrogen公司的Pichia酵母表达系统最为人熟知，并广泛应用于外源蛋白的表达。

虽然说酵母表达操作简单表达量高，但是在实际操作中，并不是每个外源基因都能顺利得到高表达的。

不少人在操作中会遇到这样那样的问题，生物通编者特地收集了部分用户在使用EasySelect Pichia Expression System这个被誉为最简单的毕赤酵母表达的经典试剂盒过程中的心得体会。

其中Xiang Yang是来自美国乔治城大学（Georgetown University）Lombardi癌症中心（Lombardi Cancer Center），部分用户来自国内。

甲基酵母部分优点与其他真核表达系统比较与原核表达系统比较1.属于真核表达系统，具有一定的蛋白质翻译后加工，有利于真核蛋白的表达优点-+2.AOX强效启动子，外源基因产物表达量高，可以达到每升数克表达产物的水平++++3.酵母培养、转化、高密度发酵等操作接近原核生物，远较真核系统简单，非常适合大规模工业化生产。

+++=4.可以诱导表达，也可以分泌表达，便于产物纯化。

=+5.可以甲醇代替IPTG作为诱导物，部分甲醇酵母更可以甲醇等工业产物替代葡萄糖作为碳源，生产成本低+++++ 表示优胜于；- 表示不如；= 表示差不多EasySelect Pichia Expression System产品性能：优点——使用简单，表达量高，His-tag便于纯化缺点——酵母表达蛋白有时会出现蛋白切割问题全面产品报告及心得体会：巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）是一种能高效表达重组蛋白的酵母品种，一方面由于其是属于真核生物，因此表达出来的蛋白可以进行糖基化修饰，另一方面毕赤酵母生长速度快，可以将表达的蛋白分泌到培养基中，方便蛋白纯化。

毕赤酵母表达载体pPICZ在多克隆位点（MCR）3'端带有his-tag和c-myc epitopes，这些tag有利于常规检测和纯化，而且在MCR5'端引入了alpha factor（α-factor）用以增加表达，并且在表达后α-factor 可以自动被切除。

毕赤酵母表达系统研究进展

毕赤酵母表达系统研究进展马银鹏;王玉文;党阿丽;孔祥辉;张介驰【摘要】毕赤酵母是外源蛋白表达的一种重要宿主.毕赤酵母表达系统既具有原核表达系统操作简单、价格低廉、生产率高的优点,又具有真核表达系统能对表达后的蛋白折叠、糖基化和形成二硫键等翻译后进行加工和修饰的功能,因此毕赤酵母表达系统具有广泛的应用前景和重要的研究价值.本研究对毕赤酵母表达系统的特点、组成、影响外源基因高效表达的影响因素等进行总结.【期刊名称】《黑龙江科学》【年(卷),期】2013(004)009【总页数】5页(P27-31)【关键词】毕赤酵母;表达系统;外源蛋白;甲醇【作者】马银鹏;王玉文;党阿丽;孔祥辉;张介驰【作者单位】黑龙江省科学院微生物研究所,哈尔滨150010;黑龙江省科学院微生物研究所,哈尔滨150010;黑龙江省科学院微生物研究所,哈尔滨150010;黑龙江省科学院微生物研究所,哈尔滨150010;黑龙江省科学院高技术研究院,哈尔滨150020;黑龙江省科学院微生物研究所,哈尔滨150010;黑龙江省科学院高技术研究院,哈尔滨150020【正文语种】中文【中图分类】Q815大肠杆菌(Escherichia coli)表达系统由于其具有遗传背景和生化特性清楚、成本低廉、操作简便、生产效率高等优点最早被采用作为外源基因表达系统。

但大肠杆菌表达系统缺少真核生物的蛋白翻译后进行加工和修饰的功能，表达的蛋白大部分以包含体形式存在，且需要经过复杂的复性才能恢复构象和活性以及背景杂蛋白较多[1］，为克服这些缺点，人们于1979年开发了酵母表达系统。

酵母是单细胞低等真核生物，既具有原核生物细胞生长速度快、容易培养、操作简单等优点，又具有真核生物表达时对蛋白质的加工和修饰等功能。

因此相对于原核表达系统表达出的不具有活性的蛋白，酵母表达出的蛋白是具有生物学活性的，而且酵母表达系统比其他真核表达系统如昆虫、哺乳动物组织等表达系统快速、简便、成本低[2］。

毕赤酵母蛋白表达系统研究进展

1 P． pastoris 表达系统的特点
P． pastoris 是甲醇营养型酵母中的一种，可以在含有甲醇的培养基上快速生长。与其他蛋白表达系
收稿日期： 2010-11-02 基金项目：福建省科技厅资助项目（ 2009N0032），福建省教育厅资助项目（ JA08041）作者简介：杨梅，女，博士，教授，研究方向：生物化学与分子生物学； E-mail： myang@ fjnu． edu． cn
3 外源蛋白的表达及其影响因素
目前，毕赤酵母蛋白表达系统在国内外应用都很广泛，已成功表达许多外源蛋白。但由于毕赤酵母本身仅分泌少量蛋白，因此外源蛋白占培养基中总蛋白的绝大多数。有些外源蛋白的表达量可达到 g / L 以上水平，如 Hao 等［27］成功表达的重组人复合 α-干扰素（ cIFN）的表达量达到 1． 24 g / L； Huang 等［28］表达的截短的 1，3-1，4-β-D-葡聚糖酶的表达量为 3 g /L。虽然许多外源蛋白都可以在毕赤酵母中高效表达，但仍然有些蛋白表达量相对较低或不表达，在同一表达系统中表达不同的外源蛋白，其表达量千差万别，外源蛋白的表达受多方面因素的影响。 3． 1 外源基因自身的内在特性
母属（ Candida）和汉逊酵母属（ Hansenula）等。毕赤酵母（ P． pastoris）作为甲醇酵母的一种，是单细胞低等真核生物，已发展成为广泛应用的表达宿主。与其他表达系统相比，毕赤酵母具有不可比拟的优势，其既有原核生物繁殖快、易于培养、培养基廉价和试验过程简单可行等特点，又具有强有力的启动子，还可以对外源蛋白进行加工折叠和翻译后修饰，具备了典型的真核生物表达体系的特点。毕赤酵母表达系统已发展成为一个较为理想的蛋白表达系统，被国内外广泛应用于生产外源蛋白。目前，已有 500 多种外源蛋白在该表达系统中获得表达［4］。

毕赤酵母表达系统研究进展

中图分类号：Ｑ８１５文献标志码：Ａ文章编号：１６７４－８６４６（２０１３）０９－－００２７－０５
ＡｄｖａｎｃｅｓｏｆＰｉｃｈｉａｐａｓｔｓｙｓｔｅｍ
第４卷第９期
２０１３年９月
黑龙江科学
ＨＥＩＬ０ＮＧＪＩＡＮＧＳＣＩＥＮＣＥ
Ｖ０Ｉ．４Ｎｏ．９
Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ．２０１３
毕赤酵母表达系统研究进展
马银鹏，王玉文，党阿丽，孔祥辉，张介驰＇
ＭＡＹｉｎ — ｐｅｎｇ，ＷＡＮＧＹｕ — ｗｅｎ，ＤＡＮＧＡ．１ｉ，ＫＯＮＧＸｉａｎｇ．ｈｕｉ ’ ，ＺＨＡＮＧＪｉｅ — ｃｈｉ＇
（１．Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｈｅｉｌｏｎｇ］ｉａｎｇＡｃａｄｅｍｙｏｆＳｃｉｅｎｃｅｓ，Ｈａｒｂｉｎ１５００１０，Ｃｈｉｎａ；２．ＩｓｔｎｉｔｕｔｅｆＡｏｄｖａｎｃｅｄＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＨｅｉｌｏｎｇｉｆａｎｇＡｃａｄｅｍｙｆＳｏｃｉｅｎｃｅｓ，Ｈａｒｂｉｎ１５００２０，Ｃｈｉｎａ）
（１．黑龙江省科学院微生物研究所，哈尔滨１５００１０；２．黑龙江省科学院高技术研究院，哈尔滨１５００２０）

毕赤酵母表达实验手册

毕赤酵母表达实验手册大肠杆菌表达系统最突出的优点是工艺简单、产量高、生产成本低。

然而，许多蛋白质在翻译后，需经过翻译后的修饰加工，如磷酸化、糖基化、酰胺化及蛋白酶水解等过程才能转化成活性形式。

大肠杆菌缺少上述加工机制，不适合用于表达结构复杂的蛋白质。

另外，蛋白质的活性还依赖于形成正确的二硫键并折叠成高级结构，在大肠杆菌中表达的蛋白质往往不能进行正确的折叠，是以包含体状态存在。

包含体的形成虽然简化了产物的纯化，但不利于产物的活性，为了得到有活性的蛋白，就需要进行变性溶解及复性等操作，这一过程比较繁琐，同时增加了成本。

大肠杆菌是用得最多、研究最成熟的基因工程表达系统，当前已商业化的基因工程产品大多是通过大肠杆菌表达的，其主要优点是成本低、产量高、易于操作。

但大肠杆菌是原核生物，不具有真核生物的基因表达调控机制和蛋白质的加工修饰能力，其产物往住形成没有活性的包涵体，需要经过变性、复性等处理，才能应用。

近年来，以酵母作为工程菌表达外源蛋白日益引起重视，原因是与大肠杆菌相比，酵母是低等真核生物，除了具有细胞生长快，易于培养，遗传操作简单等原核生物的特点外，又具有真核生物时表达的蛋白质进行正确加工，修饰，合理的空间折叠等功能，非常有利于真核基因的表达，能有效克服大肠杆菌系统缺乏蛋白翻泽后加工、修饰的不足。

因此酵母表达系统受到越来越多的重视和利用。

［1］。

与大肠杆菌相比，作为单细胞真核生物的酵母菌具有比较完备的基因表达调控机制和对表达产物的加工修饰能力。

酿酒酵母（）在分子遗传学方面被人们的认识最早，也是最先作为外源基因表达的酵母宿主。

1981年酿酒酵母表达了第一个外源基因一干扰素基因（参考文献？），随后又有一系列外源基因在该系统得到表达（参考文献？）。

干扰素和胰岛素已大量生产并被广泛应用（大量生产是用什么方法生产的？是用酿酒酵母吗？），当利用酿酒酵母制备时，实验室的结果很令人鼓舞，但由实验室扩展到工业规模时，其产量迅速下降。

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达系统。具有比哺乳动物细胞易于进行遗传操这主要归功于毕赤酵母具有的其他表达系统不可
比拟的优点：具有目前最强，调控机理最严格的启动子一醇氧化酶ＡＸＯ１基因启动子，格调控外严
缺乏转录后加工修饰的缺陷，弥补酿酒酵母缺乏
系统的起源、物学特性、合蛋白的表达以及影响蛋白表达量的因素。生融
关键词毕赤酵母；物学特性；白表达生蛋
中图分类号Ｔ９６Ｑ２文献标识码Ａ文章编号１０７２（０７００７００５－０１２０）６— ０２— ５
ＡｄａｃｎｔｅＲｅｅｒｈｏｒｉｎＰｒｔｉｐｒｓｉｎｏｃｉｓｏｖｎｅｉｈｓａｃｆＦｏｅｇｏｅｎＥｘｅｓｏｆＰｉｈａｐａｔｒ
ＬＧｉｇＯＮＪｎ，ＤＵＬ－ｉｉｎｘ
物的转录后调控机制，如蛋白酶加工、叠、硫折二
ｔｉａｅ，ｔｅａｖｎｃｎｏｉｉｈｓｐｐｒｈｄａｅｉｒｇｎ，ｂｏｏｉａｈｒｃｅｉｔｃ，ｆｓｏｒｔｉｘｒｓｉｎｏｈｅｓｓｅａｎｈｅａｓｃａｅｉｌｇｃｌｃａａｔｒｓｉｓｕｉｎｐｏｅｎｅｐｅｓｏｆｔｙｔｍｄｔｓｏｉｔｄ
密度发酵，源蛋白表达量高；在过氧化物酶外存
工，赤酵母表达系统在国内外已经引起了高毕度重视，２０到０５年止，经有５０多种蛋白在该已０系统中进行了表达。
体，表达的蛋白贮存其中，免受蛋白酶降解，可减
巴斯德毕赤酵母表达系统经过二十几年的发
斯德毕赤酵母在过去的２０ａ年中已经发展成为
一
展，已基本成为可以生产多种融合蛋白的高效表
作、长迅速的特点，以克服大肠杆菌表达系统生可
种高效的表达各种外源融合蛋白的表达系统，
ｉａｃａｔｒｏｘｒｓｉｎａｅｒｖｅｄａｄｓｍｍａｉｅｍｐｔｆｃｏｓｆｒｅｐｅｓｏｒｅｉｗｅｎｕｒｚｄ．
ＫｅｙｗｏｄｓＰｉｈａｐａｔｒｓ；Ｂｉｌｇｃｌｃａａｔｒｓｉｓ；Ｐｒｔｉｘｒｓｉｎｒｃｉｓｏｉｏｏｉａｈｒｃｅｉｔｃｏｅｎｅｐｅｓｏ
（ａｉｎｌｅｔｆｒｌｕａｅｅｃａｄＢｅｄｎｎｍｌｎｔｕｎｍａｃｎｅ（ＡＳ，ｅｉ００４Ｃｉ）ＮｔａｎｅｏＭｏｅｌｒＧｎｔｓｎｒｉｇｏｉａｓｔｔｏｉｌｉｃＣＡ）Ｂｌｎ１０９，ｈｎｏＣｒｃｉｅｆＡＩｉｅｆＡＳｅｊｇａ
少对细胞的毒害作用；密度发酵培养，甲醇诱高在导下连续发酵培养表达水平稳定，于大规模培易
养；营养要求不高，对培养基成本低廉。
１毕赤酵母的生物学特性
巴斯德毕赤酵母（ｉｉｐｓｒ）一种单细Ｐｃａａｔｉ是ｈｏｓ
强启动子、泌效率低、分表达菌株不够稳定以及表达质粒易丢失的缺点，以生产可溶的、可具有正确折叠的重组蛋白，且可以对蛋白进行转录后加并
源蛋白的表达；源基因随染色体复制进行整合外型表达，稳定性高；体生长速度快，于进行高菌易
ＡｂｓｒｃＰｉｈｉａｔｒｓｅｐｒｓｉｎｓｓｅｉｅｅｔｙｄｅｅｏｐｄｓｓｅｔａｔｃａｐ￣ｏｉｘｅｓｏｙｔｍｓａｒｃｎｖｌｅｙｔｍｔｆｉｉｎｌｘｒｓｏｅｇｒｔｉｌｏｅｆｃｅｔｙｅｐｅｓｆｒｉｎｐｏｅｎ．Ｉｎ
龙晶，立新杜
１０９）００４
（国农业科学院北京畜牧兽医研究所国家畜禽分子育种中心，京中北
摘
要
毕赤酵母表达系统是近年来发展起来的一种高效表达外源基因的表达系统。综述了毕赤酵母表达
维普资讯
７２
微生物学毒志２０年１月第２卷第６０７１７期ＪＵＮＬＯＩＲＢＯＯＹＮｖ２０ｏ２ｏ６ＯＲＡＦＭＣＯＩＬＧｏ．０７Ｖ１７Ｎ．．
巴斯德毕赤酵母表达外源蛋白的研究进展
２融合蛋白的表达
毕赤酵母表达系统广泛地应用于各种不同融合蛋白的生产，多在ＣｒｇｉｏａｄＣｅｇ的文许ｅｅｈｎｎｒ表
胞微生物，于进行遗传操作和培养，易具有真核生