L_异亮氨酸型配体交换固定相对DL_氨基酸的拆分研究
L_异亮氨酸聚合物手性配体交换固定相的制备及对DL_氨基酸的拆分
研究论文L 2异亮氨酸聚合物手性配体交换固定相的制备及对DL 2氨基酸的拆分马桂娟a 龚波林a,b 3 阎 超b(a 宁夏大学能源化工重点实验室 银川750021;b 上海通微分析技术有限公司 上海201203)摘 要 单分散亲水交联聚甲基丙烯酸环氧丙酯2甲基丙烯酸乙二醇双酯树脂(P G MA /E D MA )和手性配体L 2异亮氨酸反应,再与铜离子进行配位,得到一种新型的L 2异亮氨酸聚合物键合高效手性配体交换固定相。
在流动相为012mol/L Na Ac +011mmol/L Cu (Ac )2水溶液和检测波长为254n m 条件下,固定相拆分了12种DL 2氨基酸对映体,分离因子在1123～2133之间。
详细考察了流动相pH 、流速及柱温等色谱条件对DL 2氨基酸对映体拆分的影响,并探讨了拆分过程热力学。
结果表明,以单分散亲水性聚合物为基质的新型手性配体交换色谱固定相制备简单、操作方便、成本低廉,柱性能稳定。
在配体交换模式下,固定相对12种DL 2氨基酸对映体进行了良好的拆分。
关键词 手性配体交换色谱固定相,单分散树脂,L 2异亮氨酸,DL 2氨基酸,对映体分离中图分类号:O658 文献标识码:A 文章编号:100020518(2009)022*******2008201219收稿,2008204209修回科技部国际合作重点项目(2006DF A33690)、教育部新世纪优秀人才支持计划(NCET 20420986)和上海市博士后科研基金(06R214202)资助项目通讯联系人:龚波林,博士,教授;E 2mail:gongbl@nxu .edu .cn;研究方向:色谱固定相的制备及应用在DL 2氨基酸对映体的色谱拆分方法中,高效配体交换色谱法(ligand 2exchange chr omat ography,LEC )具有样品毋需衍生,对映体选择性高,且色谱柱再生容易等优点,是最佳的色谱拆分方法之一[1～3]。
生物转化和手性拆分技术制备D_氨基酸研究进展_于平
２００５年第４０卷第９期生物学通报３由于植物抗盐性及抗盐机理的复杂性，使植物通过常规育种方法培育抗盐品种进展缓慢。
到目前为止，尚未分离到结构研究清楚、农业上可直接利用的抗盐基因。
中国拥有４００余种盐生植物，占世界盐生植物总数的１／４。
目前利用野生盐生植物资源，提取其总体ＤＮＡ，利用花粉管通道引入法育种已获得一些突破。
今后应加强抗盐机理研究，发掘利用抗盐植物资源，在进行引种和驯化的同时，建立基因库，用基因工程手段培育出具有实际应用价值的抗盐新品种。
参考文献１廖红，严小龙．高级植物营养学．北京：科学出版社，２００３．２李小燕等．植物的盐胁迫生理．西北师范大学学报（自然科学版）．２００４，３（４０）：１０６—１０９．３马雅琴等．植物耐盐相关基因克隆的研究进展．植物遗传资源学报．２００４，５（１）：８１—８６．４陶晶等．植物盐胁迫研究进展．吉林林业科技，２００３，５（３２）：１—５．５高永生．植物盐适应性调节机制的研究进展．草业学报，２（１２）：１—６．（ＢＦ）众所周知自然界中存在２０种基本氨基酸，除甘氨酸外都有２种互成镜像的对映体Ｄ型和Ｌ型，历来认为生命物质只存在Ｌ型氨基酸，并曾将Ｌ型冠以“天然”，而Ｄ型就成了“非天然”。
与Ｌ－氨基酸相比，Ｄ－氨基酸种类少，只占自然界已发现的３００多种氨基酸的１０％左右，但其价格十分昂贵。
随着分析方法的发展，人们相继在海洋动物、陆生动物、脊椎和无脊椎动物、种子植物和人体中发现了各种Ｄ－氨基酸之后，Ｄ－氨基酸才引起人们的高度重视，并意识到它们在医药、农药和食品等的重要组成中起着重要作用。
人体的一些疾病与体内Ｄ－氨基酸的含量有关，诸如白内障晶体浑浊、早老年痴呆症以及某些肾脏疾病的病人，其体内某些组织中Ｄ－氨基酸含量均高于正常人，Ｄ－氨基酸还会阻断一些重要生物物质的合成，从而抑制了动物的生长。
Ｄ－氨基酸对研究某些疾病和衰老机制十分重要，此外Ｄ－氨基酸已被用于!－内酰胺类抗生素和生理活性肽的生物合成。
硅胶键合手性配体交换固定相键合量对α-氨基酸拆分的影响
收稿日期：!""#$#"$%"作者简介：祝馨怡，女，#&’(年生，博士研究生，)$*+,-：./0-.!0+122342*3通讯联系人：陈立仁，男，研究员，博士生导师，电话：（"&%#）5!’6’&7，传真：（"&%#）5!’’"553基金项目：中国科学院重点基金资助项目（批准号：89&6$:#$!"6）3硅胶键合手性配体交换色谱固定相键合量对!!氨基酸拆分的影响祝馨怡，韩小茜，齐邦峰，李永民，蒋生祥，陈立仁（中国科学院兰州化学物理研究所，甘肃兰州’%""""）摘要：合成了两种不同键合量的;$脯氨酸硅胶键合手性配体交换固定相，装柱后利用配体交换色谱法分离了一系列的!$氨基酸。
实验结果表明键合量不同的固定相对!$氨基酸的拆分能力差别较大。
关键词：配体交换色谱；;$脯氨酸；手性固定相；对映体分离；键合量；!$氨基酸中图分类号：<(65文献标识码：=文章编号：#"""$5’#%（!""!）"%$"!!%$"7"##$%&’#&($)’*+,*-./’0*&1’#2(,3456,-4*+"7%(4*-$2(3’/4&’-3!48(,%9&4&,’*43:;(41$1’*&($"*4*&,’1$8434&,’*’#./,*’.%,+1>?@A ,B $0,，?=CA ,+2$D ,+B ，E F G +B H $I J B H ，;F92B H$*,B ，K F =C L:1J B H $/,+B H，M ?)C;,$N J B （!"#$%&’(#)*+*’*,&-.%,/+0"12%3)+0)，4%,.%+#,),50"6,/3&-70+,#0,)，!"#$%&’89::::，.%+#"）.<1&34%&：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’3+1：-,H +B V J /41+B H J 41N 2*+Q 2H N +O 10；;$O N 2-,B J ；41,N +-P Q +Q ,2B +N 0O 1+P J ；J B +B Q ,2P J O +N +Q ,2B ；U 2B V ,B H +*2T B Q ；!$+*,B 2+4,V 配体交换色谱法（;)M ）是目前拆分!$氨基酸的最简便有效的方法，与传统的分离方法相比，它具有快速高效、分离成本低、选择性高、操作简便、无需柱前衍生等优势［#］。
手性氨基酸的制备及生物活性研究进展
手性氨基酸的合成及生物活性研究进展专业：物理化学学号：M110393 姓名：秦锦摘要：综述了近年来手性氨基酸的制备方法及其生物活性，包括化学拆分法、不对称合成法、结晶法、微生物法、酶法、配位萃取法、膜拆分法以及色谱法等制备方法，还介绍了手性氨基酸作为手性药物的生物活性作用，并对其研究的前景进行了展望。
关键词：手性,氨基酸,制备,拆分,生物活性随着人们对手性氨基酸的深入研究，发现有些物质的D－(－)－异构体和L －(＋)－异构体在生物体中的活性差异很大。
对这一问题的探讨，有助于了解生命过程中药物作用的化学基础与生物基础。
本文综述了近年来手性氨基酸的制备方法及其生物活性作用，并展望了其研究的前景。
1 手性氨基酸化合物的制备方法1.1 化学拆分法DL-对羟基苯甘氨酸可用化学拆分剂进行拆分，常用的拆分剂有溴化樟脑磺酸a－苯基乙胺，酒石酸，脱氢枞胺等。
Yamada S．等用溴化樟脑磺酸(d－BCS)作为拆分剂，对DL-对羟基苯甘氧酸进行拆分，D－对羟基苯甘氨酸的收率可达92％。
但此法反应步骤长、收率低，关键是选择使用周期长、回收容易的拆分剂。
严兆明等应用嗜热菌蛋白酶通过酶促由DL-苯丙氨酸－I－C与Z－L－广丙氨酸合成Z－L-Ala－L－Phe－OMe(1－C)二肽，藉此达到消旋苯丙氨酸的拆分，然后将二肽用嗜热菌蛋白酶在N－甲基吗啉缓冲溶液中进行酶促水解反应，从而获得L－苯丙氨酸。
Umemura等开发了由麦芽假丝酵母不对称降解DL-丙氨酸生产制备D－丙氨酸的实用工艺。
最适降解条件为3O摄氏度、pH6.0、通风量1.0vvm和振荡(1200r ／min)。
此工艺在200g／L DL-丙氨酸规模下，L－丙氨酸在40h内完全降解，剩余的D－丙氨酸可很容易地从反应混合液中分离出来，最终可得99．0％的化学纯和99．9％旋光纯度的D－丙氨酸90g。
Yokoaeki等以醛为原料，经Bucherer反应合成DL-5－取代乙内酰脲，然后用恶臭假单胞菌的二氢嘧啶酶催化选择性水解为N－氨甲酰D－氨基酸，再经化学法或酶法脱氨甲酰基得D－氨基酸，拆分DL-5－对羟基苯乙内酰胺生产D－对羟基苯甘酸，由30 g／L DL-5氨－对羟基苯乙内酰胺生产D－对羟基苯甘氨酸，收率达92％。
发酵液中L-异亮氨酸提取工艺研究
ｌｍ ｎ 活性 炭 添加量 为 ２ 脱 色温度 为 ６ ℃ 、 色时间 为 ２ ｒｉ、 色 时的最佳 ｐ 为 ４７ 在此 工 艺条 Ｏ ｉ、 ％、 ０ 脱 ５ ｎ脱 ａ Ｈ ．。
件 下 ， 一 亮氨酸提 取 收率 为 ９ ． ， Ｌ 异 ４３ 产品 纯度 高达 ９ ．％ 。 ％ ６５ 关键 词 ： 一 亮氨 酸 Ｌ 异 分 离提 取 工 艺 活性 炭 脱 色
了初 步研 究。 别考察 了蛋 白去 除温 度及 时 间、 分 活性 炭 用量 、 色时 间、 色温度 、 脱 脱 发酵 液 ｐ 值 对 Ｌ 异 Ｈ 一
亮氨 酸 分 离提 取 效 果 的 影 响 。 最 终确 定 了提 取 的 工 艺条 件 ． 即蛋 白去 除 温度 及 时 间 分 别 为 ９ ℃和 ０
１ ％ ００
酸 ， 导致 食 欲不 振 、 质 下 降 、 将 体 贫血 及 其 它功 能 障碍 。因此 ， 其用 量逐 年增 长【， １１ ， 。目前 ， ２ ３ 在工业 生
产上 主要应 用发 酵法 生产 Ｌ 异亮 氨 酸 。 一 生产 上 分 离提 取 氨基 酸 的方法 有 很 多种 ， 如 离 子交换 法 、膜分 离技 术等 。本 文采 用加 热除 蛋 白 、 电点 有机 溶剂 法从 发 酵液 中提 取 Ｌ 异亮 氨 等 一 酸 。确立 了最 适蛋 白去 除温 度及 时 间 、活性 炭 用 量 、 色 时间 、 色温 度 、 酵液 ｐ 脱 脱 发 Ｈ值 对 Ｌ 异 亮 一 氨 酸分离 提取 的影 响 。
的发 酵液 ，分别在 ６ ℃、０ 、０ ９ ℃、Ｏ ￣下 Ｏ ７ ℃ ８ ℃、Ｏ Ｉ０Ｃ 加热 ｌ ｍｉ Ｏ ｎ除蛋 白， 比较结 果如 表 １ 所示
表 １ 加 热 温 度 对 去 除 蛋 白量 的 影 响
单分散树脂键合手性配体交换色谱固定相拆分DL-氨基酸
ｂ ｓ ｇ０ １ｍｏ ａ ｃｗｉ ． ｙｕ ｉ ． ＶＬ Ｎ Ａ ｔ ０ １ｍｍｏ ｕ Ａ ） ｏｕｉｎ ａ ｂｌ ｐ ａ ｅａ ｄ ｄ ｔｃｉｎａ ｎ ｈ ＶＬ Ｃ （ ｃ ２ ｌｔ ｓｍｏ ｉ ｈ ｓ ｎ ｅｅ ｔ ｔ ｓ ｏ ｅ ｏ
２ ４ ｎ ． Ｔｈｅ ｅ ｕ ｉ ｎ ｏｒ ｅ ｆＤ—ｓ ｍ ｅ ｆ ｒ —ｓ ｍ ｅ ａ ｂｓ ｒ ｄ ｆ ｒａ ｌｔ ． ｍ ｉ ｃ ｄ ５ ｍ ｌ ｔｏ ｄ ｒ ｏ ｉ ｏ ｒｂｅ ｏ ｅ Ｌｉｏ ｒｗ ｓ ｏ ｅ ｖｅ ｌ ｈｅ ＤＬ ａ ｎｏ ａ ｉ ｓ ｏ ｒ ｓ ｌ ｅ ｘｃ ｐ — ｒ ｉ ｅ ｏ ｖ ｄ ｅ ｅ ｔ ＤＬ ｐ ｏｌ ｎｅ． Ｆｏｒ ＤＬ ｐｒ ｉ ｈｅ ｅ ｕ ｉ ｎ ｏ ｄ ｒ Ｗ ａ ｆｅ ｅ ｒ — ｏｌ ｎｅ ｔ ｌ ｔｏ ｒ ｅ ｓ ｄｉｆ ｒ ｎｔ ｆｏｍ ｈ ｔ ｒ — ｔ ｅ ｏ ｈｅ ｓ ｂｅ
对 Ｄ 一 基 酸 对 映 体 拆 分 的 影 响 。 结 果 表 明 ， 固定 相 在 配体 交 换 色 谱模 式下 可 对 多 对 Ｄ 一 基 酸 进行 良好 的 拆分 。 Ｌ氨 该 Ｌ氨
关 键 词 ： 性 配体 交换 色 谱 固定 相 ； 分 散 树 脂 ；一 氨 酸 ； Ｌ氨 基 酸 ； 映 体 分 离 手 单 Ｌ脯 Ｄ一 对
中 图分 类 号 ： ６ ８ ０ ５ 文献标识码 ： Ａ 文 章 编 号 ：０ ０ ８ １ （ ０ ７ ０ —７ ３０ １ ０ — ３ ２ ０ ） ５０ ２ —５ ７ 栏 目类 别 ： 究 论 文 研
Ｌｉ ａｎｄ Ｅｘｃ ｎｇ ｇ ｈａ ｅ Ｃｈｒ ｏｍ ａｔ ｒ ｏｇ ａｐｈｉ ｐａ ａｔ ｏｎ ｃ Ｓｅ ｒ ｉ ｏｆ ＤＬ— Ａｍ ｉ ｎｏ Ａ ｃ ｄｓ Ｂａｓ ｏｎｏｄｉ ｐｅ ｓ ｉ ｅｄ ｏｎ Ｍ ｓ ｒ ｅ Ｒｅｓ ｎ— ｉ Ｂｏｎｄ ｅｄ Ｃｈｉ ａ ａｔ ｏｎａ ｙ ｒ ｌ Ｓｔ ｉ ｒ Ｐｈａ ｅ ｓ
_氨基酸在L_脯氨酸手性配体交换色谱固定相上的分离
第22卷第4期分析测试学报Vol.22No.42003年7月FENXI CES HI XUEBAO(J ou rn al of In stru mental An al y si s)J ul.2003_氨基酸在L_脯氨酸手性配体交换色谱固定相上的分离祝馨怡,蔡迎春,陈立仁,柳春辉,李永民(中国科学院兰州化学物理研究所色谱中心,甘肃兰州730000)摘要:合成了L_脯氨酸硅胶键合手性配体交换色谱固定相,并用于 _氨基酸的直接光学分离,详细考察了流动相p H值、金属离子浓度、流速、柱温以及进样量等因素对分离效果的影响,从而进一步优化了色谱分离条件。
关键词: _氨基酸;L_脯氨酸;手性固定相;对映体分离;配体交换色谱中图分类号:O657.72;O629.71文献标识码:A文章编号:1004-4957(2003)04-0017-04配体交换色谱法(LEC)是目前分离 _氨基酸最简便有效的方法之一[1]。
根据手性配体是存在于固定相中或者是流动相中,配体交换色谱法可分为:手性固定相(CSPs)配体交换色谱法和手性流动相(CMPs)配体交换色谱法。
其中CSPs配体交换色谱法根据载体的不同,主要分为以聚合物为载体和以硅胶为载体两类。
Davankov等[2]首先将L_脯氨酸键合到苯乙烯二乙烯苯树脂上,形成铜离子配合物,用配体交换色谱法(LEC)分离氨基酸的对映体。
其后许多聚合物被用作手性配体交换色谱固定相(LEC_CSP)的载体,如交联聚丙烯酰胺[3]、交联聚丙烯酸酯[4]和交联聚乙酰胺[5,6]。
但以聚合物为载体的手性固定相机械强度较硅胶差,难以满足高效液相色谱的需求。
适用于HPLC的硅胶键合LEC_CSP是由G bitz[7,8]等发展起来的,与聚合物为载体的手性固定相相比,它具有耐压高效等优势,但交换容量要低于前者。
手性配体交换色谱法分离 _氨基酸受多方面因素的影响,如:流动相pH值、金属离子浓度、流速、柱温以及进样量等。
13_异亮氨酸
第十三章异亮氨酸、亮氨酸与缬氨酸发酵第一节分支链氨基酸的生物合成途径和代谢调节机制在L型异亮氨酸（Ile）、亮氨酸（Leu）和缬氨酸（Val）的分子中，都具有由甲基侧链形成的分枝结构（见表13-1），故称上述三种氨基酸为分枝链氨基酸（branched chain amino acids）。
分枝链氨基酸是合成蛋白质的素材，可以作为生物体的能源，也作为生物体成分的前体。
但是，高等动物不能合成这三种氨基酸，故Ile、Leu、Val称为必需氨基酸。
目前，分枝链氨基酸主要用作氨基酸输液的原料。
表13-1 分枝链氨基酸的结构名称结构式分子式分子量异亮氨酸（Ile）C6H13O2N 131.18亮氨酸（Leu）C6H13O2N 131.18缬氨酸（Val）C5H11O2N 117.15Ile分子内有两个不对称碳原子，因而，Ile存在着D、L、D别、L别四种光异构体（表13-2）。
很难用化学合成法，或用化学合成法与酶法相组合的方法，廉价制造纯度高的L型Ile。
Leu与Val分别只有两个光学异构体，能够用化工合成、酶法分割的方法，较廉价地制造。
要廉价生产高纯度的L型Ile，只有采用发酵法，因此，Ile发酵就成了分枝链氨基酸发酵的中心问题。
然而，从自然界中，只找到了分泌Leu或Val的菌株，却找不到分泌Ile的菌株。
直到20世纪60年代后半期，随着氨基酸生物合成系反馈调节机制的全部搞清，可以通过选育目的氨基酸代谢拮抗物抗性株的方法，从遗传上解除原菌株的反馈调节机制，从而可以利用这种抗性菌株，由糖直接发酵生产Ile（Leu或Val）。
表13-2 Ile的四种光学异构体L-Ile D-Ile D-别Ile L-别Ile 1960年，经过用粗糙链孢霉、大肠杆菌的营养缺陷型突变株，及用放射性同位素标记的前体，进行研究的结果，确定了Ile、Leu及Val的生物合成途径（图13-1）。
出于V aI和Leu的所有碳原子，都来自于丙酮酸，所以，V al及Leu亦称丙酮酸族氨基酸。
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2005年3月March 2005色谱C h inese J ou rna l of C h rom a tog raphyVo l .23N o.2172～175收稿日期:2004207228作者简介:黄晓佳,男,博士,主要从事新型分离介质制备研究,Tel:(0592)2186477,E 2mail:hxj@yanan .x mu .edu .cn .L 2异亮氨酸型配体交换固定相对DL 2氨基酸的拆分研究黄晓佳1, 王秋泉1, 王俊德2, 黄本立1(1.厦门大学化学系现代分析科学教育部重点实验室,福建厦门361005;2.中国科学院大连化学物理研究所,辽宁大连116023)摘要:用自制的新型L 2异亮氨酸配体交换固定相在配体交换模式下对11种DL 2氨基酸进行了拆分研究,详细考察了流动相中铜离子浓度、甲醇含量、流速及温度对拆分效果的影响,并探讨了可能的拆分机理。
研究结果表明:流动相中高浓度的铜离子不利于DL 2氨基酸的拆分;增加流动相中甲醇的含量,降低流动相流速以及提高色谱柱温度均可改善拆分效果。
关键词:手性配体交换色谱;手性固定相;L 2异亮氨酸;DL 2氨基酸;对映体分离中图分类号:O 658 文献标识码:A 文章编号:100028713(2005)022*******S tu d y o f E n a n t iom e r ic S ep a ra t io n o f DL 2Am in o A c id s o nL 2Is o le u c in e 2T yp e C h ira l 2L iga n d 2E x ch a n ge S ta t io n a ry P h a s eHUAN G X iao jia 1,WAN G Q iuquan 1,WAN G J unde 2,HUAN G B en li1(1.The Key L a bora tory of A n a ly tica l Scien ce of M in is try of Edu ca tion,D ep a r tm en t of Chem is try,X iam en U n ivers i ty,X iam en 361005,Ch in a;2.D a lia n In s ti tu te of Chem ica l Phys ics,The Ch in ese A ca dem y of Scien ces,D a lia n 116023,Ch in a )A b s t ra c t:Som e unde riva tized DL 2am ino ac id enan tiom e rs w e re sep a ra ted on L 2iso leuc ine 2typ e ch ira l 2ligand 2exchange s ta tiona ry p hase (E I L E ).The effec ts of con ten ts of copp e r ion andm e thano l in m ob ile p hase,tem p e ra tu re of co lum n and flow ra te of e luen t on the effic iency and reso lu tion of DL 2am ino ac ids w e re inves tiga ted in de ta il .The resu lts show ed tha t C u (Ⅱ)ion p layed an i m p o rtan t ro le in the sep a ra tion.W hen the re w as no C u (Ⅱ)ion in m ob ile p hase,theDL 2am ino ac ids cou ld no t be enan tio 2sep a ra ted,w h ile the con ten t of C u (Ⅱ)inc reased from013m m o l/L to 112m m o l/L,the effic iency of reso lu tion and re ten tion ti m e dec reased.The in 2c reases of the con ten t of m e thano l and co lum n tem pe ra tu re a re in favo r of the reso lu tion fo r m os t of DL 2am ino ac ids.The flow ra te a lso affec ted the reso lu tion resu lts.G ood resu lts cou ld be ob ta ined in reduc ing flow ra te bu t it p ro longs the re ten tion ti m e.The m echan ism s ofd iffe ren t ch ira l sep a ra tion resu lts on the new s ta tiona ry p hase unde r d iffe ren t cond itions w e rea lso inves tiga ted.Ke y w o rd s:ch ira l 2ligand 2exchange ch rom a tog rap hy;ch ira l s ta tiona ry p hase;L 2iso leuc ine;DL 2am ino ac ids;enan tiom e ric sep a ra tion DL 2氨基酸的分离是生命科学研究的基础,在蛋白质多肽的研究、有机化学中的不对称合成以及医药、食品、卫生等领域的研究中都具有重要意义。
目前,配体交换色谱(L EC )法已成为拆分未衍生化DL 2氨基酸的最简便有效的方法[1,2]。
配体交换色谱法可分为手性固定相配体交换色谱法和手性流动相配体交换色谱法[3]。
相比之下,手性固定相配体交换色谱法具有使用方便、分离样品种类多的优势,因而受到人们的关注。
在众多的手性配体交换固定相中,所用的手性选择剂大多具有刚性环状结构,如脯氨酸、羟脯氨酸[4～6]、(S )21,2,3,42四氢232异喹啉羧酸[7,8]等,但这些固定相对DL 2氨基酸的分离时间较长,且需在50℃的高温下进行分离,这对色谱柱的使用寿命有很大的影响。
我们曾报道了以分子中不具有刚性环状结构的L 2异亮氨酸为手性选择剂,通过β2(3,42环氧环己基)乙基三甲氧基硅烷键合到硅胶上制得L 2异亮氨酸型手性配体交换固定相(E I L E ),并在配体交换模式下实现了对11种DL 2氨基酸的快速拆分[9]。
本工作进一步考察了流动相中铜离子浓度、甲醇含量及流动相的流速、色谱柱的 第2期黄晓佳等:L2异亮氨酸型配体交换固定相对DL2氨基酸的拆分研究温度对拆分效果的影响,并探讨了可能的拆分机理。
1 实验部分1.1 试剂与仪器 Krom as il25μm硅球(瑞典Eka N obe l公司,孔径10nm,比表面积340m2/g),β2(3,42环氧环己基)乙基三甲氧基硅烷(β2EC TS)(纯度98%,F luck公司),C uSO4・5H2O(分析纯,沈阳试剂三厂),甲醇(色谱纯,山东禹城化工厂),水(二次蒸馏,0145μm微孔滤膜过滤)。
实验中所用的DL2氨基酸均购自美国S igm a公司,其他试剂皆为分析纯。
高效液相色谱(H PLC)系统由日本岛津公司的LC210AD泵和SPD210A多波长紫外分光检测器、R heodyne7125进样阀及江申色谱工作站JS23000组成。
柱温由循环水浴控制(4S K15A2A,J ap an)。
1.2 E IL E固定相的制备 E I L E固定相的制备及表征见文献[9],最后的配体交换固定相结构式如图1所示。
2 结果与讨论2.1 流动相中C u(Ⅱ)浓度的影响 流动相中C u(Ⅱ)浓度对DL2氨基酸的手性分离有较大的影响,其结果如表1所列。
从表1中数据可见,流动相中没有C u(Ⅱ)时,D型和L型同时在较短时间内被洗脱而没有得到拆分;而当流动相中有一定浓度的C u(Ⅱ)存在时,DL2氨基酸得到了分离,这说明所制备的E I L E固定相是在配体交换模式下对DL2氨基酸进行手性拆分的。
当C u(Ⅱ)浓度从013m m o l/L升高到1.2m m o l/L时,DL2氨基酸保留时间变短,同时拆分效果变差(DL2Phe除外),在C u(Ⅱ)浓度为1.2m m o l/L时,一些DL2氨基酸没有得到拆分。
这是因为当流动相中C u(Ⅱ)浓度增加时,待拆分的DL2氨基酸进入色谱柱后,先与流动相中的C u(Ⅱ)形成配合物而难以进入固定相进行配体交换,因此保留时间变短,拆分效果下降。
图1 E IL E的结构示意图F ig.1 T h e s t ru c tu re o f L2is o le u c in e2typ e ch ira l2liga n d2e x ch a n ge s ta t io n a ry p h a s e(E IL E)表1 铜离子浓度对DL2氨基酸拆分的影响T a b le1 E ffe c t o f C u(Ⅱ)co n ce n t ra t io n s s ep a ra t io n o n e n a n t iom e r ic s ep a ra t io n o f DL2am in o a c id sSam p le c(Cu(Ⅱ))=0k LαR Sc(Cu(Ⅱ))=0.3mm o l/Lk LαR Sc(Cu(Ⅱ))=0.6mm o l/Lk LαR Sc(Cu(Ⅱ))=0.9mm o l/Lk LαR Sc(Cu(Ⅱ))=1.2mm o l/Lk LαR SDL2M e t0.42101.181.320.880.781 0 0.621 0 0.481 0 DL2Se r0.12100.681.521.060.651.521.060.531.490.790.511.470.56 DL2Th r0.13101.121.421.160.881.390.870.55100.4710DL2Phe0.48102.841.881.471.671.871.731.542.202.261.502.792.75 DL2T ry1.16107.341.611.537.691.721.536.741.681.376.461.631.23 DL2Ile0.24101.101.760.870.851.380.420.57100.4910DL2A sn0.21100.871.440.950.741.430.720.581.370.600.3910DL2Va l0.18100.781.671.050.741.580.930.621.460.850.3910DL2A sp0.38100.771.200.850.691.120.710.50100.1110DL2O ri30.28100.641.290.960.561.290.890.491.280.870.441.200.51 DL2H is0.24102.722.632.541.972.321.981.592.181.031.371.540.78 Cond itions:m ob ile p hase,0105m o l/L KH2PO4con ta in ing d iffe ren t concen tra tions of CuSO4;flow ra te,017mL/m in;co lum n tem2 p e ra tu re,20℃;de tec tion w ave length,223nm.3O ri:o rith ine m onohyd roch lo ride.2.2 流动相中甲醇含量的影响 流动相中甲醇含量对E I L E固定相拆分DL2氨基酸能力的影响如表2所示。