K88菌毛基因的克隆及ST表位序列在菌毛基因上的融合

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大肠杆菌K88ac菌毛操纵子fae全基因的克隆、表达及生物学活性初步研究

ｇｎｌｓｅｘｒｓｉｎＭｅｈｄ：Ｔｅｅｅｃｕｔｒｅｐｅｓ．ｓｏｔｏｓｈ
ｉｉｎｖｔ ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ ｏｓｕｙｔｅｂｏｃｉｔｏｏｉａｔｆｒｅｆｏｆｒｅｉｔ。ａｄｔｔｄｈｉａｔｉｆｒｃｍｂｎｎｍｂａｒｍ触ｍｂａ。ｏｒｖｙｅｉｉ
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ｏｅｏｅｅｃｓｒｆｍｅｔｔｉｅｉＥｃｅｉｉｃｌ（ＴＣ）Ｋ８ｃｐｒｇｎｌｔｒｎｅｏｇｎｃｓｈｒｈａｏＥＥｎｕｅｓｏｏｒｘｃｉ８ａ
系黏附和黏附抑制实验结果表明重组ＥＰ茵和野生菌株一样具有较强的黏附猪小肠上皮细胞系的能力，且提纯重组茵毛而
制备出的鼠抗血清能有效抑制上述重组茵或野生菌株对猪小肠上皮细胞系的黏附结合。
Ｋ８ｍｂａｏｅｏｇｎｃｕｔｒｒｍｐｉｅｙｌｎ－Ｃｕｉｇｔｅｇｎｍｉ８ｆｒｐｒｎｅｅｌｓｓｗｅｅａｌｄｂｏｇＰＲｓｈｅｏｃＤＮＡｅｌｔｓｏ８ｃＥｃｌＣ８９２ｉｉｅｉｆｎｔｍｐａｅｆＫ８ａ．ｏｉ３０
［键词】肠产毒性大肠杆菌；８关Ｋ８茵毛ｉ结构基因；隆；达；物活性克表生

细菌信号传导调控元件的合成生物学研究进展

细菌信号传导调控元件的合成生物学研究进展作者简介芦银华,中国科学院上海生命科学研究院植物生理生态研究所副研究员,硕士生导师.主要从事链霉菌的代谢调控机制研究Tel02l一54924l78E—mail:yhlu@sibslieCD通讯作者简介姜卫红,中国科学院上海生命科学研究院植物生理生态研究所研究员,博士生导师.长期从事细菌代谢调控机制研究,主要研究内容:产溶剂梭菌的代谢调控及代谢工程;链霉菌次级代谢的分子调控;基于细菌信号传导调控系统的合成生物学研究.1997年八选中国科学院"百人计划",2001年获国家杰出青年基金资助.TclO2l一54924l72E—mail:whjiang@sibsaccn细菌信号传导调控元件的合成生物学研究进展芦银华姜卫红(中国科学院上海生科院植物生理生态研究所合成生物学重点实验室,上海.200032)dO103j6≤{,{sr,16,403{9201{030()合成生物学的一个重要目标是设计,改造微生物(主要指细菌),使其能够自主执行复杂任务,如合成重要生物基产品(药物,生物燃料等),疾病治疗以及环境修复等,造福人类社会.要完成这些任务,细菌必须依赖其信号传导系统,根据环境变化作出正确及时的应答.在长期进化过程中,细菌产生了众多不同的信号传导系统,给我们提供了大量宝贵的信号传导调控元件.通过对这些调控元件的合成生物学设计,改造,我们可以给细菌装备全新的信号传导系统.从而使其能够在工业生物技术及生物医学等应用中执行设定任务.短短几年,关于细菌信号传导调控元件的合成生物学研究已取得了长足的进步,本文56图片摘自skerke带.应答调控蛋白(RR生物产业技术2011.03(5月) /,效应输出将就细菌中主要的信号传导系统.如双组分系统,群体感应系统,变构转录因子以及Riboswitch在合成生物学基础与应用研究中的进展情况作一综述.1双组分系统双组分系统(two—componentsystem,TCS)普遍存在于原核生物中,是细菌中占主导的信号传导系统.典型的TCS主要由两部分组成.即组氨酸激酶(histidinekinase.HK)和应答调节蛋白(response regulator.RR)(图1).绝大多数HK为跨膜蛋白主要由三个功能模块组成即信号感应域(sensordomain),二聚体化及磷酸转移结构域(DHp)和催化与ATP结合结构域(CA).RR位于细胞质内用于传递和编译HK上传来的信号.RR一般由2个模块组成,即位于氮末端含有高度保守Asp残基的信号接受域(receiverdomain)和碳末端效应结构域(effectordomain,一般具有DNA结合活性).HK与RR以磷酸化方式进行信号传导.鉴于HK与RR的模块化构造,为大家通过合成生物学手段设计构建新的TCS或改造细菌现有TCS使其行使特定功能提供了方便.并且潜力巨大.目前,主要有3种策略用于TCS的【细菌信号传导调控元件的l合成生物学研究进展合成生物学改造,包括TCS重接(TCS rewiring),TCS的人工重构以及TCS输入信号的改造.下面就应用实例对这些策略分别进行介绍.1.1TCS重接(TCSrewiring)TCS重接主要针对细菌中固有的,已经存在的TCS信号传导系统进行重接, 使其可以感受新的输入信号和产生新的生物学功能.目前,主要有以下2种设计思路.11.1功能模块的替换将一种HK的功能模块替换成另一种HK的相应模块构建嵌合HK,从而实现TCS信号传导通路的重接.这种HK可以感受第一种HK的信号产生第二种HK的生物学功能.这方面的研究主要集中在大肠杆菌中.Inouye等首次应用这种设计理念.将大肠杆菌中的HK Tar的天冬氨酸感应模块(225aa,为跨膜结构域)与EnvZ的DHp和CAf共229aa)进行融合,构建了嵌合HKTar- EnvZ.这种HK能够在感知L一天冬氨酸浓度升高的情况下,产生EnvZ的生物学效应,即调节渗透压.至此,在大肠杆菌中已构建了许多这种类型的嵌合HK, 包括Trg—EnvZ.,NarX.Tar.,NarX. NarQ.等.在枯草杆菌中也有嵌合HK构建的报道如McpB—McpC..不过,这些TCSrewiring主要局限在同一细菌中.而较少涉及不同细菌或不同物种之间的TCS信号传导途径重接.2005年,美国加利福尼亚大学旧金山分校(UCSF)的C.V oigt课题组通过开创性地将来源于不同细菌的TCS[分别为蓝藻细菌(Synechocystis)的HKCph]与大肠杆菌的TCSEnvZ/OmpR]进行了ompClacZpromoter本图摘自Levskaya等.bTCS信号通路重接.完成了大肠杆菌成像系统(生物照相机)的设计(图2).首先,将来自于蓝藻细菌HKCphl(也称为光敏色素的脱辅基蛋白)的光信号接受模块与大肠杆菌EnvZ的DHp与CA模块进行优化交联,构建了嵌合激酶Cph8一EnvZ(感光系统).由于大肠杆菌没有感光蛋白,无法对光照作出应答因此,他们将来源于蓝藻细菌的藻胆青素(PCB,为光敏色素的生色团.可以接受光照刺激)合成基因(hol和pcyA)导人大肠杆菌,使之能够接受光照刺激(光感应器)(注:PCB与Cphl共价结合,在红光作用下.PCB可以导致Cphl二聚体化,阻止Cphl显示激酶活性).同时,为了使感光系统产生"可视化"效果.①参考文献StockAM,VLRobinson,PNGoudreauTwo-componentsignaltransductionAnnuRev Biochem,2000,69:183—215②参考文献SkerkerJM,etalRewiringthespecificity oftwo—componentsignaltransductionsystems Cell,2008,133(6):1043?1054③参考文献KielC,EYus,LSerrano,Engineering signaltransductionpathwaysCell,2010,140(1): 33—47④参考文献UtsumlReta1Activationofbacterialporingeneexpressionbyachimericsignal transducerinresponsetoaspartateScience,1989,245(4923):1246—1249w,v,I2011.03(5月).I生物产业技术57 @参考文献WardSM,etalANarX—Tarchimera mediatesrepellentchemotaxistonitrateand nitriteMolMicrobiol,2002,44(3):709—719⑩参考文献LevskayaA,etalSyntheticbiology engineeringEscherichiacoiltoseelightNature2005438(7067):441—442①参考文献AntunesMS,eta/Engineeringkey componentsinasyntheticeukaryoticsignal transductionpathwayMolSystBiol,2009,5:27058研究者引入了lacZ基因.将OmpR调控的目的基因ompC的启动子与lacZ基因融合,使lacZ的表达依赖于OmpR并受光调控(成像器).当有外界红光照射情况下,感光蛋白接受光照刺激,EnvZ的自磷酸化活性被抑制,从而OmpR不能被磷酸化激活,ompC启动子关闭,造成lacZ基因无法表达,此区域菌苔形成的底片保持原色:相反.无光照的区域,EnvZ的自磷酸化及OmpR的磷酸化顺利进行,从而开启ompC启动子,使IacZ基因顺利表达编码的半乳糖苷酶催化培养基中的S—Gal生成一种黑色沉淀物,此区域为黑色[图2(b)].这种微生物成像系统可以产生分辨率高达100M像素/平方英寸的二维图像.这项工作显示出利用细菌信号传导系统进行合成生物学研究具有巨大的潜力.I.}2I)}lp模块中决定ltK-R附目互作用特异性的氨基酸的替换TCS信号传导的特异性.即HK—RR相互作用的特异性是由参与HKDHp模块和RR信号接受模块相互作用的某些氨基酸或序列决定的.因此,通过将HKDHp上的特定氨基酸或序列突变成另一种HK的相应氨基酸或序列即可实现信号传导途径的重接.Skerker等将大肠杆菌的EnvZDHp中决定HK—RR相互作用特异性的氨基酸或序列分别替换为RstB,CpxA,PhoR,AtoS及PhoQ的相应氦基酸或序列突变后的EnvZ丧失磷酸化OmpR(与EnvZ配对的RR)的能力,而分别获得了与磷酸化RstB,CpxA,PhoR,AtoS以及PhoQ匹配RR的活性.这为进行TCS信号通路的改造提供了新的策略.生物产业技术l2011.03(5月) 1.2TG$的人工重构通过TCS的人工重构可以构建全新的,本身不存在的TCS信号传导通路,从而避免与内源信号传导系统的cross—talk,最大限度地提高信号传导的效率.主要通过2种方式实现TCS信号通路的人工重构:(1)将来源于不同细菌或物种的TCS功能模块进行改造,重构,根据需要从头合成TCS信号通路.Anttmes等.运用这种策略在模式生物一一拟南芥中构建了一个新的TCS信号途径将来源于拟南芥的组氨酸激酶与经改造的大肠杆菌RR PhoB(PhoB—VP64)进行了整合.重构的TCS通路可以在细胞激动素(cytokinin)的刺激下,激活PhoB—VP64,从而启动下游基因的转录表达.这种跨物种(从细菌到植物)信号传导蛋白的移植成功为策略(2)的顺利实施奠定了基础.(2)将一种物种的TCS传导途径整个的移植入另一种物种中,并保持正常生物学功能,这种方法原则上可以完全避免cross—talk.但这方面的研究还处于摸索阶段.目前,本实验室正在尝试将大肠杆菌的TCS移植入链霉菌中进行异源表达通过特定信号的刺激,实现链霉菌中重要抗生素的可控高效表达.1.3TCS输入信号的改变由于TCS信号传导系统可以及时对环境变化作出快速的应答并实现对细菌代谢的动态控制.这预示可以通过改造优化细菌的TCS传导通路(如改变TCS输入信号),使改造后的TCS能够根据细菌自身代谢水平调整代谢流的分布.目前这种策略已被应用于设计新的信号传导通路.并可以提高工程细菌中重要生物基产品的产量.Farmer和Liao等.首次应用这种策略对大肠杆菌工程菌株的TCS信号～_llJ一蟹一锄m吖卅Ⅲ一∞一豇mp一帅堕～一蒸～l墓～～一…阶一vb蛐一nn甜一nO2篓⑦一删Ⅲ枷胤l二～㈨№～一雾l细菌信号传导调控元件的f合成生物学研究进展传导系统进行改造,显着提高了工程菌株番茄红素的产量及生产率.他们在实验中将大肠杆菌中本来感受氦代谢信号的HK NtrⅡ敲除,从而使其匹配的RRNtrI可以感应乙酰磷酸浓度的变化(乙酰磷酸水平的升高预示碳代谢流的过剩).为了实现将代谢流导向生成番茄红素人工合成途径他们将合成途径中的2个限速酶基因(pps和idi)置于NtrI调控靶基因的启动子(glnAp2)控制下.通过以上改造,当细菌生长到一定阶段,碳代谢流过剩并产生高浓度的乙酰磷酸激活NtrI使番茄红素合成途径中的pps和idi基因转录显着上调,从而将过剩代谢流导向番茄红素合成方向.结果显示,通过这种改造使工程菌的番茄红素产量提高了18倍.另外,Liao课题组研究人员运用相似的策略. 在大肠杆菌TCSNtrlI/NtrI的基础上构建了类似于群体感应系统的细胞一细胞联络系统.,信号为醋酸分子其可以自由进出细胞膜以及邻近的细胞.通过缺失大肠杆菌的pta基因,使醋酸分子的浓度与细菌生长密度成正相关.在细胞内,醋酸分子由Ack酶转变成乙酰磷酸,因此.乙酰磷酸浓度的高低可以反映醋酸分子的浓度高低.在NtrII缺失的情况下,乙酰磷酸作为NtrI的磷供体,在细菌浓度达到一定阈值的时候激活NtrI,从而启动置于其靶基因glnA启动子及增强子之下的报告系统GFP的表达.2群体感应系统群体感应(quorumsensing)是细菌根据细胞密度变化进行基因表达调控的一种生理行为.细菌在生长过程中释放一种被称为自体诱导物(autoinducer)的信号分子,它随着细胞密度增加而增加.当这种信号分子累积到一定阈值时.细菌会改变特定基因的转录表达.细菌的很多生理行为均与群体感应系统有关,如生物发光,致病性以及生物膜形成等.革兰氏阳性菌和阴性菌中的群体感应系统截然不同.在革兰氏阴性茵中,主要有2种组分参与即Luxl和LuxR[以费氏弧菌(Vibrioffscheti)为例,大多数革兰氏阴性菌都具有LuxI/R 类蛋白】.LuxI为自体诱导物合成酶,能够合成信号分子N一酰基高丝氨酸内酯(AHLs);LuxR是细胞质内的应答调控蛋白为AHLs的感应因子.具有DNA转录激活元件.AHLs的浓度会随着细胞密度的增加而累积,当这种信号分子浓度达到临界阈值时就与LuxR结合从而激活下游基因的转录.而革兰氏阳性菌是利用修饰后的寡肽类物质作为信号分子,其信号识别系统为TCS. TCS的组氨酸激酶识别信号分子后会启动自身磷酸化和磷酸转移过程,激活RR参与基因的转录调控..目前,关于群体感应系统的研究主要集中在革兰氏阴性细菌的LuxI/R系统该系统现已广泛应用于合成生物学基础和应用研究,下面举2个例子予以简单介绍.关于LuxI/R合成生物学的基础研究,目前主要是用于构建各种具有特定功能的基因线路.如Y ou等.在大肠杆菌中构建了利用费氏弧茵来源的LtLxI/R调控细胞凋亡来控制细胞群体数量的基因线路.他们在基因线路设计中将细胞凋亡基因ccdB置于LuxR结合的P.启动子控制下.在环境中的信号分子AHL浓度达到或超过特定阈值时,LuxR与AHL结合,启动ccdB基因的转录,从而引起程序性死亡(图3).通过这个基因线路的设计,可以很好地@参考文献FarmerWR,JCLiaoImprovinglycopene productioninEscherichiacolibyengineering metaboliccontrolNatBiotechnol,2000,18(5):533—537@参考文献BulterT,etalDes12n0fartificia1cel1. cellcommunicationusinggeneandmetabolic networksProcNatlAcadSciUSA,2004,10lr81:2299?2304@参考文献Y ouL,etalProgrammedpopulationcontrol bycellcellcommunicationandregulatedkillingNature,2004,428(6985):868—871.ca2011.03(5月).生物产业技术59 ⑩参考文献AndersonJC,etalEnvironmentallY controlledinvasionofcancercellsbyengineered bacteriaJMolBiol2006,355f4)6I9—627⑩参考文献Kaplan,S,eta1Diversetwo—dimensional inputfunctionscontrolbacterialsugargenesMol Cel1.200829f61:786—792⑩参考文献HastyJ,McMi11enD,Co11insJJ EngineeredgenecireuitsNature.2002420(6912):224—230⑩参考文献GardnerTSCantorCR,Co11lnsJJ Constructionofagenetictoggleswitchin EscherichiacoliNature,2000,403(6767):339—342 ⑩参考文献ElowitzMB,LeiblerSAsynthetic oscillatorynetvmrkoftranscriptionalregulators Nature,2000,403(6767):335—338实现对细胞群体密度的人工调控.除了上面基础研究的例子,LuxI/R也可应用于疾病治疗方面,如J.Anderson等.通过将来自假结核耶尔森氏茵(Y ersinia pseudotuberculosis)的my基因(编码侵袭素)和费氏弧菌的LuxI/R系统,甲酸脱氢酶基因启动子等功能模块组合导入大肠杆菌中,使其能够选择性地在高细胞密度,缺氧微环境下具有侵入包括肝癌,骨肉瘤等多种瘤细胞的能力.如果能在该大肠杆菌中引入杀死癌细胞物质的合成途径将有希望治愈癌症.3变构转录因子变构转录因子(allostericIranscfiptional;2sAHL:??--.?:ll④l…①其中的Luxl/R来源于与细胞凋亡)生物产业技术I2011.03(5月) factors)是细菌中研究最广泛最彻底的信号感应调控因子,主要感受来自于细胞内的小分子信号.当这类调控因子结合信号后,会诱导蛋白质局部的构象变化,从而改变它们结合DNA的特异性,实现对目标基因的转录调控.变构转录因子经常调控与特定营养源的转运或降解相关的转运子及酶类的表达.LacI,MalT和AraC均属于此类转录因子,它们分别调控参与乳糖,麦芽糖及阿拉伯糖利用的操纵子.其中LacI研究的最为清楚,建立了乳糖操纵子模型,并已被广泛应用于分子生物学实验中.主要用于大肠杆菌中异源蛋白质的高效诱导表达.现在.Lac!已被应用于模拟逻辑功能的合成生物学设计和基础研究如与其它调控因子结合应用,构建了多个遗传线路.包括逻辑门(1ogicgates)的"与"门,"或"门,双稳态开关(bistableswitches)以及基因振荡器(oscillators)..这些遗传线路的构建成功为下一步构建更加复杂的遗传网络,以及借鉴各种逻辑运算和控制机制来研究和开发复杂生物系统奠定了良好的基础.4Riboswitch随着RNA生物学以及核酸工程的快速发展,激发了合成生物学家们将RNA 分子作为功能模块用于构建新功能的信号传导途径的兴趣,同时也为我们通过合成生物学手段改造细菌信号传导途径用于设计新功能的细胞工厂提供了新的工具.这里我们重点介绍目前的研究热点——Roswitch.Riboswitch是感应结合小分子信号,参与调控基因表达及细胞代谢的～一;～1^Ⅻ曩■■■%■■藜■◇童一吩艟一细菌信号传导调控元件的合成生物学研究进展RNA分子,其广泛分布于革兰氏阴性菌和阳性茵的代谢相关基因中在真菌和植物中也有发现..Riboswitch一般位于mRNAs的5非编码区具有适配体位点(aptamer).一旦适配体与小分子信号(如代谢产物等)结合会改变RNA三维结构,在转录终止翻译起始以及mRNA稳定性等水平上开启或阻止目标蛋白的合成,实现"开关"的功能～..例如,枯草杆菌(Bacillussubtilis)和其他革兰氏阳性细菌的glmSmRNA中含有一种Riboswitch(是一种核酶).在glmS基因参与合成的代谢产物(葡萄糖胺一6一磷酸)浓度升高的情况下,会切割glmS的转录本阻止glmS的进一步转录表达..同样.大肠杆菌的thiMmRNA中含有一种Riboswitch,在细胞内焦磷酸硫胺素浓度升高的情况下,可以抑制硫胺素生物合成过程中的一种蛋白激酶的翻译起始一.由于Riboswitch直接将重要代谢产物的浓度与转录后调控偶联在一起,从而使生物体可以对细胞内环境的改变作出快速应答.相比于转录水平的调控, Riboswitch调节基因表达不需要任何蛋白因子作为中介,因此,这种转录后调控机制具有更加快速的特点.基于Riboswitch的这种调控特点,研究者已经设计合成了许多可以行使特定功能的Riboswitch,用于研究基因功能开发新型药物以及用于基因治疗和降解环境污染物等..这里重点介绍一个最新的研究成果,应用人工合成的Riboswitch使大肠杆菌具有发现,跟踪并降解除草剂atrazine的能力.在该研究中.Sinha等.通过体外SELEX技术及体内试验(如LacZ报告系统)从RNA分子随机库(小于40nt)中筛选到可以特异感应,结合除草剂atrazine的Riboswitch适配体库,并将该适配体库设计在E.colicheZ基因(控制大肠杆菌的运动)的5一UTR上游,通过筛选获得能够感应atrazine剂量变化的人工Riboswitch.随着atrazine浓度的提高,该Riboswitch可以促进cheZ的翻译表达.从而使大肠杆菌的运动能力得到相应提高.同时.他们在该E.coli中引入了来源于Pseudomonas sp.ADP的用于降解atrazine的代谢酶基因atzA,从而使这种大肠杆菌不仅具有atrazine依赖的运动能力.而且还具备除草剂的降解能力.这一研究成果具有很大的应用潜力,为实现通过微生物跟踪并降解环境中的污染物奠定了良好的基础.5结语④参考文献IsaacsFJ,DwyerDJ,CollinsJJRNA syntheticbiology.NatBiotechnol,200624(5): 545—554④参考文献SerganovA,Pate1DJRibozymes, riboswitchesandbeyond:regulationofgene expressionwithoutproteinsNatRevGenet,2007,8(1O):776—790@参考文献WinklerWC,etalControlofgene expressionbyanaturalmetabolite-responsiveribozymeNature,2004,428(698U):281—286@参考文献SerganovA,etalStructuralbasisforgene regulationbyathiaminepyrophosphate-sensing riboswitchNature,2006,441(7097):1167—1171本文介绍的细菌信号传导系@参考文献统,既有蛋白质类的信号传导系.'mvJ统,如双组分系统,群体感应系统以ChemBio1,2010,6(6):464—470 及变构转录因子等,又有核酸类的Riboswitch.通过合成生物学的设计改造.已被广泛应用于基因线路的构建及工业生物技术,为最终实现构建人工细胞或细胞工厂奠定了良好的基础.不过,由于我们对细菌中的各类信号传导系统的复杂性及其调控机制的认识还远未达到完善的程度尤其是不同信号传导系统之间cross—talk的广泛存在,给信号传导调控元件的合成生物学基础及应用研究带来诸多困难,因此,设计构建完全可控,可预测的信号传导系统之路还很长.任重而道远■反馈服务编码W30122011.03(5月).I_笙物产啦攒术61。

ETECK99、K88菌毛蛋白抗原表位多肽的设计合成及免疫反应

中图分类号：￥８５２．６１文献标志码：Ａ文章编号：１００ｌ一８５８１（２０１３）０３— ００８８— ０５

ＤｅｓｉｇｎＳｙｎｔｈｅｓｉｓａｎｄＩｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌＲｅａｃｉｏｔｎｏｆＥｐｉｔｏｐｅＰｅｐｔｉｄｅｓｏｆＥＴＥＣＫ８８ａｎｄＫ９９ＦｉｍｂｒｉａｌＰｒｏｔｅｉｎ
技术、ＤＮＡＳｔａｒＰｒｏｔｅａｎ蛋白分析软件及网络共享软件对ＥＴＥＣＫ８８、Ｋ９９茵毛蛋白抗原性相关的参数进行预测分析，从而设计ＥＴＥＣＫ８８、Ｋ９９茵毛蛋白的抗原表位多肽；采用腹腔注射的方式将合成的抗原表位多肽免疫小鼠，用ＥＬＩＳＡ法检测血清
Ａｂｓｔｒａｃｔ：ＩｎｏｒｄｅｒｔｏｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｔｈｅｅｐｉｔｏｐｅｓｏｆＥＴＥＣＫ８８ｎｄａＫ９９ｉｆｍｂｒｉｌａｐｒｏｔｅｉｎ，ｗｅｄｅｓｉｇｎｅｄａｎｄｓｙｎｈｅｔｓｉｚｅｄｔｈｅｅｐｉｔｏｐｅ
ｐｅｐｔｉｄｅｓｏｆＥＴＥＣＫ８８ａｎｄＫ９９ｉｆｍｂｒｉｌａｐｒｏｔｅｉｎｂｙｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃａｌａｎｄｓｔｒｕｃｔｕｒｌａａｎｌｙａｓｉｓｓｏｆｔｗａｒｅ．ＴｈｅｅｐｉｔｏｐｅｐｅｐｔｉｄｅｓｏｆＥＴＥＣ

杜氏盐藻鞭毛内运输蛋白IFT88基因的克隆及功能分析

目录４．３讨论…………………………………………………………………………………………………４０４．４结ｊ沧…………………………………………………………………………………………………４ｌ参考文献………………………………………………………………４２综述……………………………………………………………………………………………４３致谢…………………………………………………………………………………一５４个人简历、在主要学术成果及参加会议．……………………………５５第二章杜氏盐藻ＩＦＴ８８基因全长的克隆第二章杜氏盐藻ＩＦＴ８８基因全长的克隆２．１ＹＲＡＣＥ扩增杜氏盐藻ＩＦＴ８８基因３喧嵩ｃＤＮＡ２．１．１材料与方法２．１．１．１材料Ａ主要仪器设备ＨＰＧ．４００型光照培养箱ＢＣＭ．１０００Ａ型超净工作台ＤＹＹ－８Ｃ型电泳仪紫外透射反射分析仪ＧＮＰ．９０８０型隔水式恒温培养箱ＳＳ．３２５灭菌锅ＡＢｌ０４．Ｓ型电子天平凝胶成像系统台式高速低温离心机低温高速离心机ＰＣＲ仪ＹＳｌ００型普通光学显微镜Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ５４５１Ｄ型台式离心机ＢＲ４型台式离心机ＨｅＭＯＳ＾，紫外分光光度仪．８０℃冰箱ＳＩＭ．Ｆ１２４型雪花制冰机ＤＫ．８Ｄ型电热恒温水槽９０．１型恒温磁力搅拌器ＣＨＡ．Ｓ型恒温振荡器哈尔滨市东联电子技术开发有限公司苏净集团苏州安泰空气技术有限公司北京市六一仪器厂上海康华生化仪器制造厂上海精宏实验设备有限公司ＴＯＭＹ公司ＭｅｔｔｌｅｒＴｏｌｅｄｏ公司ＳＹＮＧＥＮＥ公司ＨＥＲＡＥＵＳ公司ＢＥＣＫＭＡＮ公司ＢＩＯＭＥＴＲＡ公司Ｎｉｋｏｎ公司Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ公司Ｊｏｕａｎ公司ＴｈｅｒｍｏＥｌｅｃｔｒｏｎＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎＴｈｅｒｍｏ公司ＳＡＮＹ０公司上海精密实验设备有限公司上海沪西分析仪器厂有限公司常州国华电器有限公司３第二章杜氏盐藻ＩＦＴ８８基因全长的克隆７２℃１０ｍｉｎ４℃终止反应ＰＣＲ反应结束后，取５“ｌ的ＰＣＲ反应液进行琼脂糖凝胶电泳，没有得到目的扩增产物，继续进行ＩｎｎｅｒＰＣＲ反应，或ＰＣＲ扩增产物用于以后实验，一２０℃保存。

转基因产品中常见外源基因的克隆与转化-食品科学网

97※基础研究食品科学转基因产品中常见外源基因的克隆与转化邵碧英，陈文炳，杨婕，江树勋，李寿崧(福建出入境检验检疫局，福建福州 350001)摘要：设计带不同酶切位点的引物，分别用PCR 扩增植物内源rbcL 基因和2种转基因产品中常见的外源基因－CP4-EPSPS 基因和BAR 基因，并分别与pGEM-T Easy Vector 连接，克隆到大肠杆菌DH5α中。

提取克隆菌落的质粒，并进行酶切鉴定和序列测定。

对3个基因的克隆质粒进行相应的双酶切，回收酶切产物，先后转化到受体载体p C A M B W 中。

最后获得的重组质粒的酶切和P C R 鉴定结果表明3个基因已被成功转化到受体载体中。

关键词：转基因产品；外源基因；克隆；转化Cloning and Transforming of the Universal Exogenous Genes in Genitically Modified ProductsSHAO Bi-ying ，CHEN Wen-bing ，Yang Jie ，JIANG Shu-xun ，LI Shou-song(Fujian Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Fuzhou 350001, China)Abstract ：The primers with different enzyme sites were designed, and the plant endogenous rbcL gene and two kinds of universal exogenous CP4-EPSPS gene and BAR gene in genetically modified products were expanded by PCR respectively. The PCR products were ligated with pGEM-T Easy Vector, then cloned into E.coli strain DH5α. The clone plasmids of the 3 genes were extracted, then analysed with restriction enzyme and sequenced respectively. The enzymed products of the 3 clone plasmids cut by two corresponding restriction enzyme were recovered, and transformed into the received carrier pCAMBW one after the other. The restriction enzyme analysising and PCR detection results of the recombinant plasmid obtained finally showed that the 3 genes were transformed successfully into the received carrier.Key words ：genetically modified product ；exogenous gene ；clone ；transform中图分类号：Q812 文献标识码：A 文章编号：1002-6630(2006)11-0097-04收稿日期：2006-08-09基金项目：国家质量监督检验检疫总局科技项目(2005IK006)作者简介：邵碧英(1973-)，女，高级工程师，博士，主要从事转基因产品和动物产品的分子检测与科研。

产肠毒素大肠杆菌K88ab／K88ad菌毛操纵子fae全基因的克隆、表达及生物学活性的初步研究

ＹＵＬｅｉ，－，ＷＵＪｕａｎ一，ＺＨＵＪｕｎ，ＺＨＵＧｕｏ — ｑｉａｎｇ（１．ＣｏｌｌｅｇｅｏｆＶｅｔｅｒｉｎａｒｙＭｅｄｉｃｉｎｅ，ＹａｎｇｚｈｏｕＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｙａｎｇｚｈｏｕ２２５００９，Ｃｈｉｎａ；２．ＣｏｌｌｅｇｅｏｆＶｅｔｅｒｉｎａｒｙＭｅｄｉｃｉｎｅ，ＮａｎｊｉｎｇＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＵｎｉｖｅｓｉｒｙ，ｔＮａｎｊｉｎｇ２１００９５，Ｃｈｉｎａ；３．ＮａｎｊｉｎｇＴｉａｎｂａｎｇＢｉｏ — ＩｎｄｕｓｔｒｙＣｏｍｐａｎｙＬｉｍｉｔｅｄ，Ｎａｎｊｉｎｇ２１１１０２，Ｃｈｉｎａ）
其分别克隆于表达质粒ｐＢＲ３２２中构建ｐＢＲ－Ｋ８８ａｂ和ｐＢＲ．Ｋ８８ａｄ重组质粒，并将其分别转化至不合任何菌毛的Ｅ．ｃｏｌｉＳＥ５０００株中。该重组菌能够分别与鼠抗Ｋ８８茵毛阳性血清和抗Ｋ８８菌毛单克隆抗体（ＭＡｂ）产生凝集反应：
ＣｌｏｎｉｎｇａｎｄｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＫ８８ａｂ／Ｋ８８ａｄｆｉｍｂｒｉａｌｏｐｅｒｏｎｓｆｒＯｍ

携带大肠杆菌融合基因K88ac-STII的减毒鼠伤寒沙门疫苗菌的构建与鉴定

收稿日期223基金项目教育部春晖计划科研合作项目(Z 226555)作者简介杨冬梅(82),女,硕士生,从事病原分子生物学研究。

通讯作者陈创夫,男,教授,博士生导师,从事病原分子生物学研究。

第25卷　第3期2007年6月石河子大学学报(自然科学版)Journal of Shihezi University (Natural S cience )V ol.25　N o.3Jun.2007文章编号:100727383(2007)0320312204携带大肠杆菌融合基因K 88ac 2STII 的减毒鼠伤寒沙门疫苗菌的构建与鉴定杨冬梅,陈创夫,王鹏雁,任　艳(新疆地方与民族高发病实验室,新疆石河子832003)摘要:为构建表达大肠杆菌菌毛蛋白K 88ac 和热稳定肠毒素STII 的无抗性减毒鼠伤寒沙门氏菌疫苗株,采用缺失腺苷酸环化酶基因(Δcya )、环腺苷酸受体蛋白基因(Δcrp )以及天冬氨酸β2半醛脱氢酶基因(Δasd )的鼠伤寒沙门菌(X 4550)作为宿主,将编码K 88ac 2ST II 的融合基因插入Asd +组成型表达载体p Y A3334中,通过2次转化引入宿主菌,成功构建了表达K 88ac 2STII 融合基因平衡致死的减毒鼠伤寒沙门重组菌株S.typh imurium X 4550(p Y A3334K 88ac 2STII ),为防治仔猪腹泻提供了口服活菌疫苗候选株。

关键词:大肠杆菌;融合基因;不耐热肠毒素;鼠伤寒沙门氏菌;重组中图分类号:S85216 文献标识码:A 仔猪腹泻病是多年来困扰我国养猪业的问题之一,主要由于缺少有效的免疫预防手段。

随着几十年的深入研究,发现在我国和广大发展中国家产肠毒素性大肠杆菌(Enter otoxi n escher ichia coli ,ETEC )是引起婴幼儿及幼畜急性腹泻的主要病因。

ETEC 的致病过程包括细菌依赖其表面的定居因子,在肠道内定居、繁殖并释放细菌毒素引起细胞坏死和肠道紊乱,进而急性腹泻[1]。

中科院遗传所研究成果

目
录
一．实验室概况 ............................................................................................................................. 1 二．科研工作进展和成果 ............................................................................................................. 6 高等植物表观遗传学研究（曹晓风课题组） ......................................................................... 6 植物比较基因组学研究（陈明生课题组） ........................................................................... 11 植物对非生物胁迫应答调控的分子机制（陈受宜课题组） ............................................... 14 植物分子细胞遗传（程祝宽课题组） ................................................................................... 18 植物基因表达调控（储成才课题组） ................................................................................... 23 基因表达调控和植物生物技术（方荣祥课题组） ............................................................... 28 RNA 沉默和植物抗病机制（郭惠珊课题组） ...................................................................... 38 植物转录调控网络研究（焦雨铃课题组） ........................................................................... 43 茉莉酸的生理功能及作用机理研究（李传友课题组） ....................................................... 46 水稻理想株型基因的克隆与功能研究（李家洋课题组） ................................................... 50 植物对病原微生物的识别及信号转导（邱金龙课题组） ................................................... 53 植物天然产物代谢（王国栋课题组） ................................................................................... 56 生物信息学和系统生物学（王秀杰课题组） ....................................................................... 59 与植物重要农艺性状相关基因的结构和功能研究（夏桂先课题组） ............................... 62 植物胁迫信号传导的分子机制（谢旗课题组） ................................................................... 66 北方粳稻耐逆性的分子设计和新品种选育（姚善国课题组） ........................................... 70 乙烯信号传递与植物胁迫和生长发育反应（张劲松课题组） ........................................... 73 植物细胞壁形成及其生物学功能研究（周奕华课题组） ................................................... 77 水稻分化发育和抗病性的功能基因组研究（朱立煌课题组） ........................................... 82 植物遗传工程研究（朱祯课题组） ....................................................................................... 88 细胞分裂素信号转导和植物细胞的程序性死亡（左建儒课题组） ................................... 92 承担课题及当年经费到位情况 ............................................................................................... 95 三．人员情况 ............................................................................................................................. 119 四．学术交流 ............................................................................................................................. 129 五．运行管理 ............................................................................................................................. 141 六．2010 年学术年会纪要 ........................................................................................................ 145

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６６ｋ，．ｂ与预期相符。核苷酸序列分析证明，ｆｅｆｅ所得ａＣ～ａＨ序列正确。ＰＲ筛选和测序验证证明，Ｃ构建了Ｋ８８菌毛一耐热肠度素ＳＩＴＩ
的融合基因。［结论］验成功获得了重组质粒ｐＲｆ－Ｔ试Ｂ－ｅＳ。ａ关键词肠毒素大肠杆菌；８ｋ８菌毛；ＳＴ表位表位中图分类号Ｓ８文献标识码Ａ１８文章编号Ｏ１ — ６１２０）１０９９０５７６１（８２ — ８４ — ３０
ｆｅｎｔｓｃｏｔ细ＩｎｃＩ［ｅｌＰＲａｄｒｔｃｏｚｉｉｓｏｍｎｔｔｈｔｅｉｅｅｒｇｅｔａ６６ｂｉｒｏ — ｕｄｉｈＩｔｎｓｅｓｅｍＭｉｉｓｄＮｏ．ＲｓｔＣｓｉｎｎｎｄｅｆｎｅｏｓａｄｔｔｎｒｄｆｍｎｗｓ．ｋ ’ ｅｍａｕ］ｎｅｒｔｅｙｅｇｉｄｉｒｅａｈｓｔａｎｅｂａｔｌｍｄｐＲｆｕｌｆｅｓｕｎｎｌｉｄｍｎｔｔｅｃＴｌｓｏｆｅ－ｅＰＲｓｅｎｇｎｑｅｃａａｓｅｆｄｔｔ【ｉｎｐｓｉＢ－ｅＮｃｏｄｅｅｃａａｓｅｏｓａｄｔｏｇｎｓｆａｆＨ．Ｃｒｉｄｓｕｎｅｎｌｉｖｉａｔｎａａｅｉｑｅｙｓｒｅｈｌ￣ｅＣａｃｅｎａｅｙｓｒｅｈ１ｉｅＫ８ｐｉＴＩｕｉｎｗｓｏｓｃ．Ｃｎｌｉ］ＩｅｅｏｂａｔｌｍｄｐＲ￣一Ｔｗｓｕｃｓｌｎｔｃｄｉｈｓｘｅｍｎ．８ｆＳＩｆｏｇｅａｃｎｒｔ［ｏｃｓｎ，ｌｒｍｉｎｐｓｉＢ－Ｓａｓｅｆｌｃｓｔｎｔｐｒｅｔｌ — ｓｎｅｔｅｕｄｕｏ１ｃｎａｃｓｕｙｏｒｅｕｉｅｉ
ＩａｄＮｃｎｏＩＷｆｙｔｅｉｅａｄｆｓｄｉｔｅｓｐｅａｉｂｅｒｇｏｆ硒８ｐｌａｉｅｅｅ．ｎ ⅡｅｓｐｔｐｏｉｇｓｑｅｃｌｓｎｈｓｚｄｎｕｅｎｈｕｐｒｖｒｌｅｉｎｏＳａｉｌｎｔｎｇｎＡｄ１ＴｅｉｅｃｄｎｅｕｎｅＷａｙｔｅｉｅｎｇｏＳｓｎｈｓｚｄａｄ
胡建军，创夫，陈祝建波
（．１石河子大学农业生物技术重点实验室，新疆石河子８２０；．３０３２石河子大学动物科技学院，新疆石河子８２０）３０３
摘要［目的］了建立用于细胞表面展示的载体系统。［为方法］用ＰＲ技术，利ｃ以大肠杆菌质粒为模板扩增Ｋ８８菌毛操纵子的结构基因ｃ～，并克隆到ｐＲ２粒载体中。合成一段替换序列，茵毛抗原基因的超变区引入酶切位点４和Ｎｏ，Ｂ３２质在ＩｃＩ合成耐热肠度素ＳＩ表位编码序列，Ｔ１并引入菌毛抗原基因的超变区。［果］ＰＲ鉴定和限制性内切酶酶切证明，结经Ｃ重组质粒ｐＲｆ插入片断大小为Ｂ－ｅａ
Ｃｏｉｇｏ谬８ＰｌＧｅｅａｄＦｓｎｏＳｐｔｐｌｎｎｆｌｉｎｎｕｉｆＴＥｉｅ０）ｉｇＳｑｅｃｎＰｌＧｅｅｉｏｏｄｌｅｕｎｅｉｉｎｌｉＨＵＪａ－ｕｔａ（ｅａｏａｒｆｇｉｌａＢｏｅｈｏｏｙＳｉｅｉｎｖｒｔ，ｈｈｚ，ｉｉ￣８２０）ｉｎｊｎｅｌＫｙＩｂｒｔｙｏＡｒｕｔｌｉｃｎｎｇ，ｈｈｚＵｉｓｙＳｉｉＸｎａ３０３＿ｏｃｕｔｅｉｅｊｎＡｓａｔ『ｂｃｖ］Ｉｅｂｃｖａｔｍｅｔｑｉｍｎｔｌｈｇｔ－ｅｒｃｉｌｓｍ．ＭｔｄＰＲｗｓｓｏｍｌｙｈｂｔｃＯｊｔｅ，ｊｔｅｗｓｏｅｈｒｕｅｅｔｏｅａｉｉｈｃｌｕｆｅｄｐｙｓｔ［ｅｏ］Ｃａｕｅｐｆｔｒｅｉ１ｏｅｉｌｔｅｅｒｓｆｓｂｓｎｅｌｓａｓａｙｅｈｄｔａｉｅｓｔｍｌｅｅ［ｅ－ａＨｆ磁８ｐｌｏｅｎ，ｎｈｎｔｅｓｕｔｒｌｅｅｗｓｃｎｄｉｔｔｅｖｃｏＢ３２，ｌｓｑｅｃｏｔｎｎｌｃｏｉｓｔｕｎａＣｆｅｏｍｃｇｉｐｍａｄｔｅｔｃａｇｎａｌｅｎｅｔｐＲ２．１ｅｕｎｅｃｎｉｉｇｍｓ＇ｔｎｓｅｌｈｒｕｏｏｈｒＩｅａａｉｔｉ
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安徽农业科学，ｏｒａｏｔｈｉＪｕｎｌｆｍｕ
．ｃ．０８３（１：９９—８５Ｓｉ２０，６２１８４９１
责任编辑
刘月娟
责任校对
马君叶
Ｋ８８菌毛基因的克隆及ＳＴ表位序列在菌毛基因上的融合
ＫｅｙＷＯｄＥｎｅｏｉｅｉ．ｏｉ磁８Ｐｌ：ｐｔｐｌＳｔｍｔｘｇｎｃＥｃｌ：ｉｉＳｅｉｅＴｏ
肠毒素大肠杆菌（ｎｍｏｇｎ．ｏ，ＥｔｔｉｉＥｃｉ简称ＥＥ）引ｅｘｅｃｌＴＣ是起婴幼儿和新生仔猪腹泻的主要病原体之一，致病性取决其于在宿主小肠上皮细胞的定居能力和产生肠毒素的能力＿。１Ｊ