抗人大细胞肺癌单抗用于肺癌检测的价值研究
常用抗体的应用范围及选用
常用抗体的应用范围及选用在临床活检工作中，对于各种肿瘤的正确判断，历来是外科病理学的核心问题。
因它关系到患者的治疗和预后的问题。
在免疫组化技术没开展以前，主要靠HE，特殊染色和组织化学来进行鉴别和诊断各种肿瘤，这些在当时虽然解决了不少的问题，但是对于较为复杂，较为多型性的肿瘤，就不能对其起源及所含的成分作出正确的判断。
随着免疫组化工作的开展，给许多以往有待于解释原因的病理诊断上带来了福音。
许多以往无法解释原因的病例，经现今免疫组化染色技术的处理后，能够对其起源，相关的抗原或抗体成份给予显示出来，为肿瘤的诊断提断了形态学的依据。
虽然如此，对于一些较为复杂的抗原，就要根据具体情况作具体分析。
在生物界里面某些细胞仅具有一个抗原的决定簇，这是极少见的，而常见的是具有数百个乃至数千个的抗原决定簇。
数量之多但又不是千篇一律，并非都在细胞的表面表达出来，加上细胞的排列有高有矮，有长有短，切片时有的被切到细胞膜，有的被拦腰斩断，因此在一张切片上看到的同一种抗原的表达也不一致，有的在细胞核，有的在细胞膜，也有的在细胞浆，这种现象是由于切片的原因所致。
但是，抗原的表达，在原来的表达上就有核、浆、膜之分。
有的抗原可在一个部位表达，有的抗原则可在两个部位表达，例如PCNA，它可以在细胞核表达，也可在细胞浆表达。
有的抗原，可表现为双向表达，如上皮(样)肿瘤间皮肿瘤和滑膜内瘤等，用角蛋白标记时，可有阳性表达，用波形蛋白标记时，也可有阳性表达。
对于上述的许多现象，在观察检测时，就要特别地小心，不断地积累经验，以便于更好地鉴别各种抗原的所在部位。
某些抗原不是在任何时候能表达出来的它们需要一定的时间和条件。
有人根据肿瘤细胞增生的能力将其分为三个阶段：1.进入细胞周期的增殖细胞，这包括G1、G2及M期的细胞。
2.暂时未进入细胞周期，但在某特定的时期和条件下，使其开始增殖的细胞(GO期)。
3.静止的永不再进入增殖周期的细胞，这些细胞己分化成熟，根据新陈代谢的规律，它们逐渐地进行消之阶段。
常用的肺癌肿瘤标志物
常用的肺癌肿瘤标志物肿瘤标志物对肺癌诊断的价值已经受到广泛的重视，目前尚未发现肺癌特异性抗原，用于检测的肺癌标志物均为肿瘤相关物质。
目前，比较有代表意义的肺癌肿瘤标志物主要可以分为以下几类［3-5］：①胚胎抗原：如癌胚抗原(carcinoembryonic antigen, CEA)；②糖蛋白类抗原：主要有糖类抗原19 9 (carbohydrate antigen 19 9，CA19 9)、糖类抗原125 (carbohydrate antigen 125，CA125) 、糖类抗原15 3 (carbohydrate antigen 15 3，CA15 3)、鳞状细胞抗原(squamous cell carcinoma antigen，SCC Ag) 等；③角蛋白类抗原：包括细胞角蛋白19片段抗原(cytokeratin fragment antigen 21 1, CYFRA21 1)、组织多肽特异性抗原(tissue polypeptide specific antigen，TPS)等。
④酶类抗原：主要包括同工酶类,如胃泌素释放肽前体(pro gastring peptide，ProGRP)、神经元烯醇化酶(neuron specific endolase，NSE)、乳酸脱氢酶(lactic dehydrogenase，LDH)、谷光苷肽转换酶(glutathione stransferase，GST)、基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)、肿瘤M2型丙酮酸激酶(Tumor M2 pyruvate kinase，TUM2 PK)等［6］。
1 胚胎抗原癌胚抗原(CEA) CEA是一种广谱的肿瘤标记物，是一种分子量为18 000的糖蛋白，现在已经广泛应用于临床。
CEA由Gold和Freedman［7］等于1965年从结肠癌和胚胎组织中提取出来的肿瘤相关抗原。
抗肺癌药物作用靶点的研究进展李晓园
抗肺癌药物作用靶点的研究进展李晓园1，2△※（综述），张士俊3，徐为人1，3（审校）（1．天津医科大学，天津300070；2．天津天士力研究院药理毒理研究所，天津300410；3．天津药物研究院，天津市新药设计与发现重点实验室，天津300193）中图分类号：R966；R734．2文献标识码：A文章编号：1006-2084（2013）02-0275-04 doi：10．3969/j．issn．1006-2084．2013．02．027摘要：肺癌是当今世界上发生率和病死率最高的恶性肿瘤。
近年来，肺癌分子靶向治疗凭借其特异性好、有效性强以及不良反应小等特点发展迅速，越来越受到人们的重视。
近年来肺癌研究较热的几个靶点包括B细胞淋巴瘤/白血病2、环氧合酶2、生存素、间质上皮转变因子及棘皮动物微管相关蛋白样4与间变性淋巴瘤激酶融合基因。
关键词：肺癌靶点；B细胞淋巴瘤/白血病2；环氧合酶2；生存素；间质上皮转变因子；棘皮动物微管相关蛋白样4与间变性淋巴瘤激酶融合基因Research Progress in the Targets of Lung Cancer Drugs LI Xiao-yuan1，2，ZHANG Shi-jun3，XU Wei-ren1，3．（1．Tianjin Medical University，Tianjin300070，China；2．Tasly Pharmacology and Toxicology Insti-tute of Tianjin City，Tianjin300410，China；3．Tianjin Key Lab of Molecular Design and Drug Discovery，Tianjin Institute of Pharmaceutical Research，Tianjin300193，China）Abstract：Lung cancer is one of the malignant tumors with the highest morbidity and mortality in the world nowadays．In recent years，researchers are paying more and more attention to the lung cancer molecu-lar target therapy，due to its specificity，high efficiency and little adverse effects．Here reviews the research progress about several hot targets of lung cancer，including Bcl-2，COX-2，survivin，c-Met and EML4-ALK．Key words：Target of lung cancer；Bcl-2；COX-2；Survivin；C-Met；EML4-ALK肺癌是全世界发生率最高的恶性肿瘤，其病死率亦居恶性肿瘤第1位。
肺癌相关的实验室检查
肺癌相关的实验室检查肺癌至今还未发现特异性的肿瘤标记物，但是一些肿瘤标记物可作为肺癌的辅助诊断手段，在部分病人于治疗后可作为监视肿瘤状况的指标，用于随访以早期发现肿瘤的复发和转移，常用的肿瘤标记物有：神经特异性烯醇化酶(NSE) 、癌胚抗原（CEA）、Ca~50、Ca~125等。
肺癌分子生物学研究在近年来发展甚快，包括癌基因、检癌基因等的检测，下表显示NSCLC和SCLC 中分子生物学异常的发生率。
肺癌的分子生物学异常发生率项目小细胞肺癌非小细胞肺癌微卫星不稳定0%~35% 0%~22%Ras点突变＜1% 15%~20%myc过度表达15%~30% 5%~10%p53 畸变0%~90% 0%~50%Rb失活0%~90% 15%~30%P16ink4a失活0%~10% 30%~70%PHIF失活0%~75% 50%~75%Bcl-2过度表达75%~95% 10%~35%端粒活性酶提高0%~100% 80%~85%常见的等位丢失3p,4p,4q,5q,8p,10q,13q,17p,22q3p,6q,8p,9p13p,17p,19q肿瘤标志物的分类和命名十分复杂，尚未统一，目前常用的肿瘤标志物分为蛋白质类、糖类、脂类、酶类、激素类、多胺类以及病毒类进行简述。
一、蛋白质类肿瘤标志物蛋白质肿瘤甲胎蛋白肝细胞性肝癌、胚胎细胞癌癌胚抗原消化道恶性肿瘤β2微球蛋白多发性骨髓瘤、淋巴系统肿瘤本周氏蛋白多发性骨髓瘤铁蛋白白血病、小儿畸胎瘤胰胚胎抗原胰腺癌血清蛋白肝癌、多发性骨髓瘤M 蛋白骨髓瘤、淋巴瘤细胞角蛋白19片段非小细胞肺癌血清肝癌特异性蛋白原发性或转移性肝癌癌胚抗原癌胚抗原(CEA)由Gold和Freedman于1965年从胎儿及结肠癌组织中发现，是一种分子量约为200 000的含多糖的蛋白复合物，其中45%为蛋白质。
胎儿胃肠道及某些组织细胞具有合成CEA的能力，通常在妊娠期的前6个月内CEA含量增高，出生后血清中含量已很低下。
LncRNA TMPO-AS1通过调节miR-204-3p影响肺癌细胞的增殖、凋亡和侵袭
邓俊亮等LncRNA TMPO-AS1通过调节miR-204-3p影响肺癌细胞的增殖、凋亡和侵袭第3期•319•doi：10.3969/j.issn.l000484X.2021.03.011LncRNA TMPO-AS1通过调节miR-204-3p影响肺癌细胞的增殖、凋亡和侵袭邓俊亮华美香①陈键腾（南方医科大学附属新会医院呼吸内科，江门529100）中图分类号R734.2文献标志码A文章编号1000-484X(2021)03-0319-07[摘要]目的:探究长链非编码RNA(lncRNA)TMPO-ASl通过调节miR-204-3p的表达对肺癌细胞增殖、凋亡和侵袭的影响。
方法:实时荧光定量PCR(qPCR)检测人肺癌细胞系A549、H1975、H1299和H1650和人正常支气管上皮细胞系HBE 中TMPO-AS1的表达水平。
采用脂质体转染技术沉默A549细胞中TMPO-AS1,qPCR检测TMPO-AS1和miR-204-3p的表达情况，荧光素酶报告实验检测TMPO-AS1和miR-204-3p的靶向关系，噻唑蓝比色法(MTT)、流式细胞术和Transwell实验分别检测沉默TMPO-AS1对A549细胞增殖、凋亡和侵袭能力的影响,Western blot检测A549细胞中PCNA、Ki鄄67、Cleaved Caspase-3、Cleaved Caspase-9.MMP-2和MMP-9的表达。
结果:人肺癌细胞系中TMPO-AS1的表达水平明显高于人正常支气管上皮细胞系(P<0.05)，且肺癌A549细胞中TMPO-AS1的基础表达量最高，选择A549细胞用于后续实验。
沉默TMPO-AS1可明显促进miR-204-3p的表达(P<0.05)，荧光素酶报告实验显示,TMPO-AS1能够降低miR-204-3p野生型细胞的相对荧光素酶活性(P< 0.05)o沉默TMPO-AS1能够明显抑制A549细胞增殖和侵袭能力(P<0.05),降低增殖相关蛋白PCNA.Ki-67及侵袭相关蛋白MMP-2、MMP-9的表达(P<0.05)；此外，沉默TMPO-AS1可促进A549细胞凋亡及Cleaved Caspase-3和Cleaved Caspase-9的表达(P<0.05)o结论:沉默TMPO-AS1能够通过靶向促进miR-204-3p的表达抑制肺癌细胞增殖和侵袭，并诱导细胞凋亡。
生物制品简介和研究进展-单抗
生物制品简介和研究进展-单抗生物制品是指利用生物技术手段生产的具有生物学活性的药物或产品。
其中，单克隆抗体（Monoclonal Antibodies，简称mAb）作为一种重要的生物制品，广泛应用于医疗领域，并取得了重要的研究进展。
单克隆抗体在医疗领域的应用日益广泛。
其最主要的应用是作为靶向药物，用于治疗恶性肿瘤、自身免疫性疾病和感染性疾病。
例如，纳武单抗作为一种抗肿瘤药物，已经在治疗结肠癌和肺癌等多种恶性肿瘤中被广泛应用。
单克隆抗体还可以通过修饰、改变Fc区结构等手段，提高其相对药物的效果或减少免疫反应，实现以个体化疗效为目标的治疗。
除了在治疗上的应用，单克隆抗体在诊断领域也有重要的作用。
通过与特定抗原结合，单克隆抗体可以用于体外检测，例如化学发光免疫分析、流式细胞仪、酶联免疫吸附试验等。
单克隆抗体还可以作为免疫组化染色试剂，用于病理学和分子诊断领域，帮助准确定位肿瘤细胞和诊断疾病。
在单克隆抗体的研究进展上，随着生物技术的不断发展，结构多样性的单克隆抗体不断涌现。
以往发现的鼠源单克隆抗体后来不断被人源化抗体所取代，人源化抗体通过对鼠源抗体的重链和轻链进行后续的mAb工程，成功在很大程度上减小了免疫学上和临床试验上的问题。
此外，新一代抗体药物不断涌现，如全人源单克隆抗体、双特异性抗体、肿瘤免疫检查点抑制剂等，这些抗体药物均具有更高的临床疗效。
总之，单克隆抗体作为一种重要的生物制品，广泛应用于医疗和诊断领域，并在研究上取得了重要的进展。
随着生物技术的不断发展和创新，相信单克隆抗体的应用前景将进一步扩大，并为人类健康做出更大的贡献。
单抗的临床应用
单抗的临床应用临床诊断自单抗问世以来，由于其特异性强、重复性好、操作简便易行，所以在大部分常规血清学检查中，取代了多克隆抗体而广泛应用于免疫学诊断。
体内微量成分和药物的测定放射免疫测定和酶标免疫测定法已被广泛应用，作为体内激素或药物等微量成分的测定。
用单抗取代传统的多抗，使感度、精度和重复性大为提高，例如转铁蛋白、肾素、甲状腺素(T 4)、三碘甲状腺素(T3)、干扰素、补体成分C3、cAMP、cGMP、生长素、绒毛膜促性腺激素(HCG)、促性腺激素(FSH)、胰岛素、IgG、IgE、地高辛、氨茶碱、苯巴比妥、氨基糖甙类抗生素、维生素B12等单抗。
癌症诊断甲胎蛋白(AFP)和癌胚抗原(CFA)在正常胎儿血清中大量存在，成人血中含量显著减少，而癌症患者则显著增加，被认为是癌症的标志。
甲胎蛋白(AFP)是用于肝癌和畸胎瘤诊断的癌标志抗原，分子中约含4%糖链，根据糖链的差别已能区别出来源于肝癌的AFP和来源于肝硬化的AFP，从而可以期待能细致区分不同AFP的糖链结构的单抗。
蛇毒鉴别毒蛇种类很多，其毒素的性质各不相同，应用相应的蛇毒单抗，便可迅速做出正确的诊断，从而采取相应的治疗。
传染病诊断流感、狂犬病、麻疹、疱疹、肝炎、流行性出血热等致病病毒，疟疾、血吸虫、锥虫等寄生虫和一些细菌等，用相应的单抗能正确地予以诊断，并能鉴别其抗原亚型。
如乙型肝炎病毒和流感病毒可以分成若干亚型，如果制成单抗就能鉴别出不同亚型，不仅对诊断有意义，而且在流行病学上也有重要意义。
体内定位诊断利用肿瘤单抗与其相应肿瘤抗原反应的特异性和放射性同位素可以进行体外探测等特点发展起来的放射免疫显像技术，是近年来开展对肿瘤及其转移灶或复发灶进行定位或定性诊断的无创伤性新技术。
其原理是从动物或组织培养中获得各种抗肿瘤抗体，采用合适的同位素标记后注入相应肿瘤患者体内，标记抗体可随血流到达肿瘤部位，与肿瘤抗原发生特异性结合。
放射性标记抗体随时间延长在相应肿瘤组织中的浓度越聚越高，以此了解肿瘤的大小、形状、位置、数量，还可帮助确定病变性质。
单抗用于肿瘤检测和治疗有前景
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第４３卷 第３期陕西师范大学学报（自然科学版）Ｖｏｌ．４３ Ｎｏ．３ ２０１５年５月Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｓｈａａｎｘｉ Ｎｏｒｍａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（Ｎａｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｅｄｉｔｉｏｎ）Ｍａｙ，２０１５ 文章编号：１６７２－４２９１（２０１５）０３－００６４－０４ ｄｏｉ：１０．１５９８３／ｊ．ｃｎｋｉ．ｊｓｎｕ．２０１５．０３．３３５收稿日期：２０１４－１０－２３基金项目：福建省自然科学基金资助项目（２０１２Ｊ０１４１１）；福建省教育厅科技项目（ＪＢ１１１７１）；莆田学院基金项目（２０１３００１）；莆田学院教改项目（ＪＧ２０１４２６）第一作者：张趁华，女，讲师，博士研究生，主要研究方向为细胞生物学。
Ｅ－ｍａｉｌ：ｚｃｈｃｘｊ＠１２６．ｃｏｍ抗人大细胞肺癌单抗用于肺癌检测的价值研究张趁华１，蔡家利２（１莆田学院基础医学部，福建莆田３５１１００；２重庆理工大学药学与生物工程学院，重庆４０００５４）摘 要：为探讨抗人大细胞肺癌单克隆抗体在临床免疫组化检测中的应用，制备了抗人大细胞肺癌单克隆抗体，纯化后鉴定其纯度，并应用于临床免疫组化检测大细胞肺癌。
结果显示，采用辛酸－硫酸铵法纯化小鼠腹水中的单抗效果较好。
免疫组化结果表明，制备的抗人大细胞肺癌单抗可特异性地鉴别人大细胞肺癌。
其可广泛应用于临床免疫组化检测中，为肺癌的早期诊断提供较可靠的辅助指标。
关键词：肺癌；单克隆抗体；免疫组化；诊断中图分类号：Ｒ７３４．２０２ 文献标志码：ＡＴｈｅ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎｔｉ－ｈｕｍａｎ ｌａｒｇｅ ｃｅｌｌ ｌｕｎｇ ｃａｎｃｅｒ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙｉｎ ｔｈｅ ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎＺＨＡＮＧ Ｃｈｅｎｈｕａ１，ＣＡＩ Ｊｉａｌｉ ２（１Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｐｕｔｉａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｐｕｔｉａｎ ３５１１００，Ｆｕｊｉａｎ，Ｃｈｉｎａ；２Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ ａｎｄ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｃｈｏｎｇｑｉｎｇ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｃｈｏｎｇｑｉｎｇ ４０００５４，Ｃｈｉｎａ）Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｏ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅ ｔｈｅ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎｔｉ－ｈｕｍａｎ ｌａｒｇｅ ｃｅｌｌ ｌｕｎｇ ｃａｎｃｅｒ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙｉｎ ｔｈｅ ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｃｌｉｎｉｃ，ｔｈｅ ａｎｔｉ－ｈｕｍａｎ ｌａｒｇｅ ｃｅｌｌ ｌｕｎｇ ｃａｎｃｅｒ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌａｎｔｉｂｏｄｙ ｗａｓ ｐｒｅｐａｒｅｄ ａｎｄ ｐｕｒｉｆｉｅｄ，ａｎｄ ｉｔｓ ｐｕｒｉｔｙ ｗａｓ ｍｅａｓｕｒｅｄ．Ｔｈｅｎ ｔｈｅ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙｗａｓ ｕｓｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｌｕｎｇ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｐａｒａｆｆｉｎ ｓｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅｌｕｎｇ ｃａｎｃｅｒ．Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｉｎｄｉｃａｔｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｃａｐｒｙｌｉｃ ａｃｉｄ－ａｍｍｏｎｉｕｍ ｓｕｌｐｈａｔｅ ｍｅｔｈｏｄ ｗａｓ ｓｕｉｔａｂｌｅｔｏ ｐｕｒｉｆｙ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｉｎ ａｓｃｉｔｅｓ．Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｏｆ ｔｈｅ ｌａｒｇｅ ｃｅｌｌ ｌｕｎｇ ｃａｎｃｅｒ ｃｏｕｌｄ ｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙ ｉｄｅｎｔｉｆｙ ｌａｒｇｅｃｅｌｌ ｌｕｎｇ ｃａｎｃｅｒ．Ｔｈｅ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｏｆ ａｎｔｉ－ｈｕｍａｎ ｌａｒｇｅ ｃｅｌｌ ｌｕｎｇ ｃａｎｃｅｒ ｍａｙ ｂｅ ｕｓｅｄ ｉｎｃｌｉｎｉｃａｌ ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ，ｗｈｉｃｈ ｃａｎ ｐｒｏｖｉｄｅｓ ａ ｒｅｌｉａｂｌｅ ａｕｘｉｌｉａｒｙ ｉｎｄｅｘ ｆｏｒ ｄｉａｇｏｎｉｓｉｓｏｆ ｅａｒｌｙ ｌｕｎｇ ｃａｎｃｅｒ．Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：ｌｕｎｇ ｃａｎｃｅｒ；ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ；ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｙ；ｄｉａｇｎｏｓｉｓ 单克隆抗体在生物学和医学研究领域具有很大的应用价值，可直接用于人类疾病的诊断、机体免疫机制的研究以及实验室科学研究等，尤其可为人类恶性肿瘤的免疫诊断提供较为可靠的辅助指标［１－２］。
在世界范围内肺癌的发病率和死亡率逐年上升，但肺癌的诊断技术并未十分完善，临床上常用的Ｘ线检查、支气管镜检查、ＥＣＴ检查等不仅耗时耗力，而且确诊率不高。
近些年免疫检测成为癌症 第３期张趁华等：抗人大细胞肺癌单抗用于肺癌检测的价值研究６５诊断的研究热点。
免疫组化检测以简易、快捷、通用、灵敏、重现性好、经济的特点在疾病免疫检测方法中占有重要的地位。
将肺癌单克隆抗体用于肺癌免疫组化检测中，将为肺癌的诊断提供较为可靠的辅助指标［３－４］。
目前，国内外临床诊断中还没有一种针对大细胞肺癌的有效诊断试剂，常用的血清ｐ５３抗体检测、癌胚抗原（ＣＥＡ）检测、神经元特异性烯醇化酶（ＮＳＥ）检测、细胞角蛋白片段（ＣＹＦＲＡ２１－１）检测等，特异性均不理想，本文所制备的抗大细胞肺癌单克隆抗体正好能解决这一问题。
其可广泛用于临床大细胞肺癌的检测诊断中。
１ 材料和方法１．１ 材料弗氏不完全佐剂（Ｆｒｅｕｎｄ′ｓ Ｉｎｃｏｍｐｌｅｔｅｄ Ａｄｊｕ－ｖａｎｔ，ＦＩＡ，北京鼎国生物技术有限公司），６～８周龄Ｂａｌｂ／Ｃ小鼠（重庆医科大学实验动物中心），羊抗鼠ＩｇＧ－ＨＲＰ（北京鼎国生物技术有限公司），其他试剂为国产分析纯，大细胞肺癌ＮＣＩＨ４６０细胞株、小细胞肺癌Ａ５４９细胞株和抗人大细胞肺癌单克隆抗体杂交瘤细胞株（重庆理工大学生物制药实验室保存），ＤＭＥＭ培养基（ＧｉＢＣＯ公司）。
１．２ 方法１．２．１ 大细胞肺癌ＮＣＩＨ４６０细胞株、小细胞肺癌Ａ５４９细胞株和抗大细胞肺癌单克隆抗体杂交瘤细胞株的培养 用含１０％小牛血清的ＤＭＥＭ培养基对大细胞肺癌ＮＣＩＨ４６０细胞株、小细胞肺癌Ａ５４９细胞株和抗大细胞肺癌单克隆抗体杂交瘤细胞株进行扩大培养，并在液氮中冻存数支［５－６］。
１．２．２ 抗人大细胞肺癌单克隆抗体的制备和纯化鉴定 用弗氏不完全佐剂免疫Ｂａｌｂ／Ｃ小鼠，３～５ｄ后，腹腔注射抗人大细胞肺癌杂交瘤细胞１～５×１０６个／只，接种细胞１０～１２ｄ后出现腹水，１２号针头插入腹腔引流收集小鼠腹水持续数日。
收集到的腹水采用辛酸－硫酸铵法纯化。
纯化方法如下：２ ５００ｒ／ｍｉｎ离心腹水弃杂质，加入等体积的０．０６ｍｏｌ／Ｌ，ｐＨ ４．０ＮａＡｃ－ＨＡｃ缓冲液，调ｐＨ至４．８；加入１／３３体积的辛酸，室温搅拌≥３０ｍｉｎ，４℃搅拌≥６０ｍｉｎ，逐滴加完，４℃澄清２ｈ；４℃，１５ ０００ｒ／ｍｉｎ离心３０ｍｉｎ，去除白蛋白和其他非ＩｇＧ蛋白，上清加入１／１０体积的１０×ＰＢＳ（０．０１ｍｏｌ／Ｌ，ｐＨ７．４），调ｐＨ至７．２；上清滴加等量饱和硫酸铵（ｐＨ ７．２～７．４）溶液，使硫酸铵的饱和度为５０％，继续搅拌１０～３０ｍｉｎ，静置３０ｍｉｎ；４℃，１０ ０００ｒ／ｍｉｎ离心３０ｍｉｎ，弃上清，将沉淀溶于１．２ｍＬ，０．０１ｍｏｌ／Ｌ，ｐＨ ７．４ＰＢＳ中；４℃，０．０１ｍｏｌ／Ｌ，ｐＨ ７．４ＰＢＳ透析过夜，其间换液３次，收集透析袋内液体，即为纯化后的腹水单抗，－２０℃冻存备用并取少量用于ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析纯化纯度［７－９］。
１．２．３ 抗大细胞肺癌单抗对培养的肺癌细胞的特异性检测（１）细胞爬片的制备：将处于对数生长期的大细胞肺癌ＮＣＩＨ４６０细胞和小细胞肺癌Ａ５４９细胞的浓度分别调至３×１０６个／ｍＬ，将细胞悬液滴至灭菌玻片上，以铺满玻片为准，放置５％ＣＯ２培养箱中培养３６～４８ｈ后，用丙酮固定细胞爬片２０ｍｉｎ后，放置于－２０℃备用。
（２）免疫组化法鉴定细胞爬片：采用间接免疫组化检测法。
在细胞爬片上滴加３％Ｈ２Ｏ２／甲醇溶液，室温，１０ｍｉｎ，用于祛除细胞内源性过氧化物酶；封闭液１％ＢＳＡ封闭细胞爬片，３７℃，２０ｍｉｎ；一抗为稀释度为１∶２００的抗大细胞肺癌单抗，３７℃，１ｈ；二抗为稀释度为１∶４００的ＨＲＰ－羊抗鼠ＩｇＧ，３７℃，３０ｍｉｎ；显色液ＤＡＢ显色１０～３０ｓ后，苏木素复染，显微镜下观察。
阳性对照为大细胞肺癌ＮＣＩＨ４６０细胞爬片，阴性对照为小细胞肺癌Ａ５４９细胞爬片［１０－１１］。
１．２．４ 抗大细胞肺癌单抗对临床样品的特异性检测（１）石蜡病理切片的预处理：大细胞肺癌石蜡病理切片和小细胞肺癌石蜡病理切片均购于重庆医科大学附属医院。
大细胞肺癌患者两例，入院时症状均表现为咳嗽，痰中带血，胸痛，呼吸困难，头面部及上臂水肿，颈部淋巴结肿大，病理标本一例为胸腔镜检查所获，一例为纤维支气管镜检查所获；小细胞肺癌患者一例，入院时症状表现为咳嗽，胸闷，气短，头晕，吞咽困难，病理标本为纤维支气管镜检查所获。
将石蜡病理切片放置于６５℃的恒温箱中进行烤片，２ｈ；二甲苯脱蜡，１５ｍｉｎ；无水乙醇、９５％乙醇、８５％乙醇梯度脱水，每次５ｍｉｎ；微波修复抗原后备用［１２－１４］。
（２）免疫组化法鉴定石蜡病理切片：采用间接免疫组化检测法，方法同１．２．４（２）。
阳性对照为大细胞肺癌石蜡病理切片，阴性对照为小细胞肺癌石蜡病理切片。
２ 结果２．１ 抗大细胞肺癌单克隆抗体纯化结果采用辛酸－硫酸铵法纯化抗大细胞肺癌小鼠单６６ 陕西师范大学学报（自然科学版）第４３卷抗腹水，如图１（ａ为中分子量蛋白Ｍａｒｋｅｒ，ｂ为未纯化的腹水，ｃ为纯化后的腹水）所示，小鼠腹水中的杂蛋白已基本除去，抗大细胞肺癌单克隆抗体其纯度可达到９０％以上。
图１ 抗人大细胞肺癌单克隆抗体纯化前后的ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析Ｆｉｇ．１ Ｔｈｅ ＳＤＳ－ＰＡＧＥ ｍｏｂｉｌｉｔｙ ｐａｔｔｅｒｎ ｏｆ ｌｕｎｇ ｃａｎｃｅｒｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｂｅｆｏｒ ａｎｄ ａｆｔｅｒ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎａ．中分子量蛋白Ｍａｒｋｅｒ；ｂ．未纯化的腹水；ｃ．纯化后的腹水。
２．２ 抗大细胞肺癌单抗对培养的肺癌细胞的特异性检测结果抗大细胞肺癌单抗应用于间接免疫组化检测法检测大细胞肺癌细胞爬片和小细胞肺癌细胞爬片，检测结果如图２、图３所示，抗大细胞肺癌单抗能特异性地识别出大细胞肺癌细胞，染色液苏木素将细图２ 大细胞肺癌ＮＣＩＨ４６０细胞爬片的免疫组化检测结果（×１００）Ｆｉｇ．２ Ｔｈｅ ｍｉｃｒｏｇｒａｐｈｓ ｏｆ ｔｈｅ ｂｉｇ ｃｅｌｌ ｌｕｎｇ ｃａｎｃｅｒ ＮＣＩＨ４６０ｃｅｌｌ ｂｙ ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（×１００）大细胞肺癌细胞细胞核染为蓝色，细胞内与单抗特异性结合的抗原蛋白被染为黄色。