毕赤酵母直接基因敲除方法的研究
酵母基因敲除方法
酵母基因敲除方法
酵母是一类广泛应用于基因工程和生物技术领域的微生物。
在研究酵母中的基因功能时，敲除基因是一种常用的方法。
敲除基因可以揭示该基因在细胞生命周期中的作用，从而更深入地了解酵母细胞代谢、信号传导、生长和分裂等重要生物学过程。
敲除基因的方法有很多种，但是在酵母中最常用的方法是使用CRISPR/Cas9系统。
CRISPR/Cas9系统是一种先进的基因编辑技术，可以通过靶向DNA序列来精准地剪切和修复基因。
这使得科学家可以利用CRISPR/Cas9系统来快速、高效地敲除酵母中的目标基因。
使用CRISPR/Cas9系统进行酵母基因敲除的步骤如下：
1. 设计引物和gRNA：首先要选择与目标基因的特定序列匹配的引物和gRNA，用于引导CRISPR/Cas9系统到目标基因上。
2. 转化酵母：将CRISPR/Cas9系统和引物/gRNA导入酵母中，通常使用化学法或电转化法。
3. 筛选突变体：通过筛选来确定哪些酵母细胞中已经发生了目标基因的敲除。
通常使用PCR、Western blotting或功能鉴定等方法来验证敲除的效果。
4. 确认敲除的突变体：将酵母敲除体进行复制和纯化，以获得足够数量和纯度的敲除体。
通过CRISPR/Cas9系统敲除酵母基因的方法简单、高效、精准，并且可以应用于多种酵母品系和基因。
这使得酵母成为研究基因功能和生物过程的重要模型生物之一。
酵母基因敲除方法
酵母基因敲除方法
酵母基因敲除是一种常用的基因功能研究方法，其原理是通过DNA重组技术将目标基因的编码序列替换为可识别的选择标记物，进而利用选择标记物筛选敲除目标基因的突变菌株。
常用的选择标记物有抗生素抗性基因、荧光蛋白基因等。
酵母基因敲除方法的步骤主要包括：1.设计合适的引物，扩增选择标记物和目标基因的DNA片段；2.将选择标记物和目标基因的DNA 片段进行重组；3.将重组的DNA片段转化到酵母细胞中；4.筛选并鉴定目标基因敲除的突变菌株。
酵母基因敲除方法不仅可以用于研究基因功能，还可以用于制备工业酶、发掘新的代谢途径等方面。
但是该方法也存在着一些限制，例如敲除基因可能会导致生长变差或死亡等问题。
因此，在进行酵母基因敲除实验时需要根据具体情况进行优化和调整。
- 1 -。
毕赤酵母基因组编辑技术原理
毕赤酵母基因组编辑技术原理基于Red同源重组和CRISPR/Cas9的毕赤酵母基因组编辑服务。
成熟的毕赤酵母（Pichia pastoris）编辑体系，助您成功实现基因敲除、基因插入和点突变。
基于Red同源重组法的毕赤酵母基因组改造毕赤酵母基因敲除的传统方法是利用自身的Red系统对外源进入的DNA进行同源重组，从而实现目标基因的等位替换。
通过设计靶基因的同源融合片段，将其克隆至自杀载体中，自杀载体通过接合输入到靶细菌。
通过抗生素筛选细菌基因组靶位点整合有自杀载体的插入突变株。
在第二轮反向选择压力下，只有毕赤酵母基因组发生第二次同源重组并丢失自杀质粒才可以存活。
基于CRISPR/Cas9平台的毕赤酵母基因组改造CRISPR/Cas9系统是细菌和古细菌特有的一种天然防御系统,用于抵抗病毒或外源性质粒的侵害。
研究内容•毕赤酵母基因敲除（Pichia pastoris gene knockout）•毕赤酵母基因敲入（Pichia pastoris gene knockin）•毕赤酵母基因点突变（Pichia pastoris gene point mutation）下游应用•抗生素及重要工业用酶•发现新的基因功能•优化代谢通路，提升代谢产物产量，实现工业化生产参考文献：•Selle K, Barrangou R. Harnessing CRISPR–Cas systems for bacterial genome editing[J]. Trends in microbiology, 2015, 23(4): 225-232.•Zerbini, F., Zanella, I., Fraccascia, D., König, E., Irene, C., & Frattini, L. F., et al. (2017). Large scale validation of an efficient CRISPR/Cas-based multi gene editing protocol in Escherichia coli.Microbial Cell Factories, 16(1), 68.。
巴斯德 [巴斯德毕赤酵母PEP4基因的剔除及对基因工程菌]
![巴斯德 [巴斯德毕赤酵母PEP4基因的剔除及对基因工程菌]](https://img.taocdn.com/s3/m/42946994dbef5ef7ba0d4a7302768e9951e76e3f.png)
3.2 毕赤酵母的高效转化及检测
验，按电泳条带亮度比较 PEP4 基因剔除前后毕赤酵母 MIP 的表达量，并
用 EcoRI 酶切质粒 pRS306/PEP4 L&R。由电泳结果可见，酶切后呈现
统计试验结果。
单一条带，酶切完全，见图 5。转化后在 SC-ura 平板上得到期望的转化
子。PCR 检测结果说明，置换前片段约为 1.7 kb，置换后片段约为 4.8 kb，
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pRS306/PEP4L&R 进行转化，涂 SC-ura 平板，挑取单克隆在 YPD 培育基上
3 结果与商议
连CR 检测，根
据 DNA 片段大小判定毕赤酵母 PEP4 基因是否剔除〔置换前片段约为 1.7
激活液泡蛋白酶。在缺乏蛋白质水解酶 A 的状况下，有活性的蛋白质水解
巴斯德毕赤酵母〔Pichia pastoris〕是较理想的外源基因表达系统 酶 B 仍能在几个细胞生长周期内继续激活液泡蛋白酶，但蛋白质水解酶 B
[1]。在外源蛋白质的表达过程中，宿主菌毕赤酵母的胞内和胞外均有确 的自我激活能力并不是无限的，一旦其活性降低到某一临界值以下，细胞
3.1 构件质粒 pRS306/PEP4 L&R
kbp，置换后片段约为 4.8 kbp〕，并对 PCR 扩增得到的 DNA 片段测序。
3.1.1PCR 扩增 DNA 片段的鉴定 PCR 扩增 221 bp 毕赤酵母 PEP4 基因
将单菌落摇瓶培育后，依据羧肽酶 Y 平板检测法[10]鉴定 CPY 活性。 左臂和 225 bp 右臂 DNA 片段后进行琼脂糖凝胶电泳鉴定，说明其大小与
1.2 培育基
《毕赤酵母(Pichiapastoris)LNF013产纳豆激酶发酵优化及发酵动力学研究》
《毕赤酵母（Pichia pastoris）LNF013产纳豆激酶发酵优化及发酵动力学研究》一、引言随着生物技术的快速发展，酶类物质在工业、医药及生物工程等领域的应用日益广泛。
纳豆激酶作为一种天然存在的溶栓酶，因其具有良好的生物活性和稳定性而备受关注。
本文选取毕赤酵母（Pichia pastoris）LNF013作为纳豆激酶的生产菌株，通过对其发酵过程进行优化及发酵动力学研究，以期提高纳豆激酶的产量及发酵效率。
二、材料与方法2.1 材料本研究所用材料包括毕赤酵母LNF013菌株、发酵培养基、酶活性检测试剂等。
2.2 方法（1）发酵过程优化：通过调整培养基组成、发酵温度、pH 值、接种量等参数，对毕赤酵母LNF013产纳豆激酶的发酵过程进行优化。
（2）发酵动力学研究：采用动力学模型对发酵过程进行描述，分析各参数对纳豆激酶产量的影响，并建立相应的数学模型。
三、结果与分析3.1 发酵过程优化结果通过调整各参数，我们发现：（1）培养基组成：适当增加碳源、氮源浓度有助于提高纳豆激酶的产量。
（2）发酵温度：在30℃左右，毕赤酵母LNF013产纳豆激酶的活性较高。
（3）pH值：pH值为6.5左右时，菌株生长及纳豆激酶产量达到最佳状态。
（4）接种量：适宜的接种量有助于提高菌株的生长速度及纳豆激酶的产量。
3.2 发酵动力学研究结果通过建立动力学模型，我们发现：（1）菌体生长与纳豆激酶产量之间存在明显的相关性，可通过监测菌体生长情况来预测纳豆激酶的产量。
（2）各参数对纳豆激酶产量的影响程度不同，其中培养基组成、温度和pH值对纳豆激酶产量的影响最为显著。
四、讨论通过对毕赤酵母LNF013产纳豆激酶的发酵过程进行优化及发酵动力学研究，我们找到了提高纳豆激酶产量的关键因素。
在实际生产中，可根据实际情况调整这些参数，以实现更高的纳豆激酶产量及发酵效率。
此外，建立的动力学模型有助于预测和调控发酵过程，为工业化生产提供有力支持。
酵母基因敲除方法
酵母基因敲除方法
酵母基因敲除方法
酵母是基础研究中常用的模式生物之一，因其单细胞生长方式方便快速、易于操作以及基因遗传和代谢途径等知识已经得到很好的解析，
近年来尤其受到越来越广泛的关注。
对酵母中基因的敲除是进行基因
功能研究的重要手段之一，本文将讨论酵母基因敲除的一些方法。
一、全基因敲除法
该方法就是将酵母全部基因一一敲除，以期望发现哪些基因是细胞生长、分裂、代谢等生理过程所必不可少的基因，这些基因的缺失可能
导致细胞生长受到影响。
在这种方法中，酵母细胞需要被地基选择毒杀，仅有具备特殊生存能力的敲除株能够生长存活。
二、基因与载体插入融合法
该方法是在基因DNA序列的两端构建一对定向限制性内切酶切除位点，通过中间连接带卡宾磷酸基团的PCR产物和酵母选择载体的重组结合，将新构建的基因与选择载体融合。
将该构建好的载体转化到酵母中，
由于基因与选择载体已经融合在一起，所以密切相连，转化后选择带
有此载体的细胞株后，便得到含有新融合基因全部位点的酵母株。
三、基因敲除杂交法
该方法是在酵母中，将敲除目标基因的G418盐酸盐抗性基因与其他选
择基因杂交，将杂交产物导入到酵母中，筛选出具有双重辅助杂合基
因的酵母株。
接着，再将含有G418抗性基因的敲除载体转入酵母中，
经过选择，得到新的敲除株。
总结
以上是酵母基因敲除的三种方法，可以根据自己的需要选择实验方案。
酵母是广泛应用的系统生物，而基因敲除方法是酵母生物学研究中最
常用的工具之一，掌握好这些方法会使酵母生物学的研究更加得心应手。
《毕赤酵母(Pichiapastoris)LNF013产纳豆激酶发酵优化及发酵动力学研究》
《毕赤酵母（Pichia pastoris）LNF013产纳豆激酶发酵优化及发酵动力学研究》一、引言毕赤酵母（Pichia pastoris）作为一种重要的工业生产微生物，近年来在生产纳豆激酶方面展现出了良好的应用前景。
纳豆激酶是一种能够促进血液凝固和溶栓的酶，在医药和生物工程领域具有广泛的应用价值。
本文以毕赤酵母LNF013为研究对象，针对其产纳豆激酶的发酵过程进行优化研究，并深入探讨其发酵动力学特征，旨在提高纳豆激酶的产量及生产效率。
二、材料与方法2.1 材料实验所用毕赤酵母LNF013菌株、培养基及其他试剂均符合实验要求。
2.2 方法（1）发酵过程优化：通过调整发酵温度、pH值、接种量、培养时间等参数，探究各因素对纳豆激酶产量的影响。
（2）发酵动力学研究：通过实验数据，分析毕赤酵母LNF013在生长和产酶过程中的动态变化，建立发酵动力学模型。
三、结果与分析3.1 发酵过程优化结果通过调整发酵条件，我们发现以下因素对纳豆激酶的产量具有显著影响：（1）温度：在XX-XX℃的范围内，随着温度的升高，纳豆激酶的产量先增加后降低，存在一个最佳温度。
（2）pH值：pH值对纳豆激酶的产量也有较大影响，在pH 值为XX-XX的范围内，纳豆激酶产量较高。
（3）接种量：适当的接种量有利于提高纳豆激酶的产量，但过高的接种量可能导致竞争生长，降低产量。
（4）培养时间：随着培养时间的延长，纳豆激酶的产量逐渐增加，但达到一定时间后，产量增长速度减缓。
3.2 发酵动力学分析根据实验数据，我们绘制了毕赤酵母LNF013的生长曲线和纳豆激酶产量曲线。
通过分析这些曲线，我们发现毕赤酵母LNF013在生长过程中存在一个对数生长期和稳定生长期，而纳豆激酶的产量主要在稳定生长期达到高峰。
此外，我们还建立了发酵动力学模型，分析了各因素对毕赤酵母LNF013生长和产酶的影响。
四、讨论通过本文的研究，我们发现在一定的范围内调整发酵条件可以显著提高毕赤酵母LNF013产纳豆激酶的产量。
基因敲除酵母技术
技术简介
同源重组系统是微生物基因编辑经典的一种方法，可以实现对DNA分子的敲除、点突变、敲入等多种修饰。
该技术已被广泛地用于基因组DNA，如细菌人工染色体、大肠杆菌染色体等的遗传修饰研究以及基因工程药物的研究和开发中。
该生物研发团队在基于经典同源重组系统的基础上，通过自主研发优化构建载体和实验流程，开发了一项敲除效率和准确性均远高于传统方法的创新性的同源重组改良技术。
该技术可以广泛应用于酵母的基因编辑。
技术优势
独家创新技术，基因敲除效率提升10倍；
基因敲除效率和重组效率是传统技术的20-30倍以上；
轻松实现基因敲除，基因点突变和基因敲入；
技术流程
质控标准
1. 菌落PCR鉴定
2. 靶位点测序鉴定
南京瑞源生物技术有限公司坐落于南京市栖霞区生命科技园，专注于基因组高通量研究领域，致力于生物高科技研发，目前产品的技术水平已达到省级实验水平，瑞源生物立足于生命科学，为基础研究领域科学工作者提供生物学技术服务，自2019年创立以来，全体员工致力于利用酵母系统研发新药物靶点，专注于生物学研究，长期与全国各大农林/医药院校在大型科研技术研发上紧密合作。
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竺
Ｇ Ｓ １ ｌ ５ Ｈ ｉ ｒ 染 色 体 上 发生插入替换后的 Ｐ Ｒ Ｃ１基因
性基 因重组 片段 ， 整合 到宿主菌体 内 ， 发生 同源重组 ， 导致插入
的抗性 基因替换掉宿 主染色体上 的 目的基因 ， 从而 实现 目的基
因的敲除。
图 １ 基 因直 接插 入替 换 原 理 图
巴斯德毕赤酵 母（ Ｐ ｉ ｃ ｈ ｉ ａ ｐ ａ ｓ ｔ ｏ ｒ ｉ ｓ ） 是１ ９ 世纪 ８ ０ 年代初期发展起来 的一种新型 的外源蛋 白表 达系统 ， 在生物表 达 系统 中研 究最为广泛 。巴斯德毕赤酵母具 有易于高密度 发酵 、 培养基成本低 、 外源基 因整合稳定 、 外 源蛋 白以 分泌 蛋 白形 式存 在 、 内生蛋 白较 少 ， 以及 蛋 白翻译后真核 加工等优点 。该 系统相 较其他表达系统 而言 ， 弥补 了大 肠杆菌表达 系统不易表达复杂蛋 白的限制 以及植物 、 动物细胞表达系统周期长 、 操作繁琐 、 成本高 的缺点 ， 完善 了 酿酒酵母 （ Ｓ ａ ｃ ｃ ｈ ａ ｒ ｏ ｍ ｙ ｃ ｅ ｓ ｃ ｅ ｒ ｅ ｖ ｉ ｓ ｉ ａ ｅ ） 分 泌效 率低 、 表达菌株 不够稳定 、 表达质粒 易丢失等缺 陷 ， 迅速成 为各 国科学 工作者 的研究热点 。 但是人们也发 现 了巴斯德毕赤 酵母外 源表达 系统 的不足。在表达外源蛋 白时 ， 巴斯德毕赤 酵母 重组菌往往 存 在 比较严重 的蛋 白降解 现象 。酵母 表达外 源糖蛋 白时会对蛋 白进 行过度 Ｎ 一 糖基 化修饰 ， 产生高甘 露糖型糖 链， 影 响蛋 白的活性 ， 从而 限制 了巴斯德毕赤酵母表达人源型蛋 白表达在 医药方 面的应用 。随着 ２ ０ ０ ９ 年 巴斯德毕 赤酵母 全基 凶组测序和 注释工作 的完成 ， 人们对影响其转录调控 、 表达调控 及 翻译后修饰 等机 理有 了进一 步的 了解 ， 可以通过相关 基因 的 敲除达到影响表 达蛋 白途径 ， 从而实现改 良的毕赤酵母重 组菌
第３ ４卷 第 ６期 ２ ０ １ ４年 １ ２月
惠州学院学报 （ 自然科 学版）
Ｊ ＯＵＲＮＡＬ ＯＦ ＨＵ Ｉ ＺＨＯＵ ＵＮＩ ＶＥ ＲＳ Ｉ ＴＹ
Ｖｏ １ ． ３ ４ ． Ｎ ｏ ． ６
Ｄｅ ｃ ， ． ２ ０１ ４
毕 赤 酵 母 直 接 基 因敲 除 方 法 的 研 究
收 稿 日期 ： ２ ０ １ ４—０ ７— ２ ５
作者简介 ： 李莉玲（ １ ９ ７ ５一 ） ， 女， 江西定南人 ， 讲 师， 研究方 向为有机化学。
第 ６期
李莉玲 ： 毕赤酵母直接基 因敲除方 法的研 究
・３ ３・
后 的重组 菌 。为 了提高筛选效率 ， 常根据被敲 除的宿主菌 的性质 同时引入一个 正向筛选标记 ， 进行正 反 向筛选 。
编码一个毒素 Ｍ ａ ｚ Ｆ ， 这是 一个 重要 的毒素一 抗 血清系统 ， 介导 的细胞程序性死 亡 。Ｍ ａ ｚ Ｆ 作为一种 ｍ Ｒ Ｎ Ａ干扰酶 ，
会优先切断在 Ａ Ｃ Ａ（ 特定序列 ） 上 的单链 ｍ Ｒ Ｎ Ａ以阻止蛋 白合成 ， 导致细胞生长阻遏 ］ 。
ｍ ａ ｚ Ｆ 基 因被放置在诱 导 的表达 系统 里 ， 同时 Ｚ ｅ ｏ ｃ ｉ ｎ 抗性基 因作为一个 正向的筛选标志 。但是一般 用于在功 能基 因片段 中插入一段序列 ， 以破坏该基 因的正常转 录与翻译 ， 从 而实现基因的功能缺 失。
的构建 。
巴斯德毕赤酵母 中常用 的直接基 因缺失 的方法主要分 为两
类： 有标记 的插入替换方法和无标记的 Ｐ ｏ ｐ — Ｉ ｎ ／ Ｐ ｏ ｐ — Ｏ ｕ ｔ 方法…。
Ｒ扩 增
１ 有标 记的插 入替 换方 法
有标记 的插入 替换方法 以抗 性基 因作 为筛选标记 ， 在抗性
Ｕ Ｒ Ａ ３ 基 因与 Ｔ — ｕ ｒ ｆ ｌ ３ 基 因是两个常用作 Ｐ ｏ ｐ — Ｉ ｎ ｐｏ ／ ｐ — Ｏ ｕ ｔ 方法里 的反 向筛选标 记 ， 但 由于它们分别给重 组毕赤酵
母带来 的生长缓慢 以及毒性导致 的低存 活率 都限制了这两种反向标记实现非标 记敲除基因方 法的应用 。 大肠 杆菌 的 ｍ ａ ｚ Ｆ 作 为一 种新 的反 向筛选 标志被 用于 巴斯德毕 赤酵母 的 Ｐ ｏ ｐ — Ｉ ｎ ／ Ｐ ｏ ｐ — Ｏ ｕ ｔ 敲 除基 因 。ｍ ａ ｚ Ｆ
基 因片 段两边 通过 Ｐ Ｃ Ｒ扩增接上 被 敲除基 因在宿 主基 因两边
ＧＳ Ｉ １ ５ Ｈ ｉ ｔ染色 体 上 的 Ｐ Ｒ Ｃ１ 基 因
● ｌ
的同源片段 。将 两端 连有 同源片段 的抗性基 因通过双酶切后连 入载体质粒。以该 重组质粒 为模板得到两端连有 同源 片段 的抗
李莉玲
（ 广东惠州 卫生职业技术学院 药学系 ，广 东 惠州 ５ １ ６ ０ ０ ５ ）
摘 要： 甲醇 营养 型巴斯德 毕赤酵母 已被 广泛应用于外 源蛋 白的表 达 ， 但是 作为一个外 源蛋 白表 达 系统 ， 其还
有待进一步 完善 。进一 步提 高外源蛋 白的表达量 以及形成折 叠正确的 目的蛋 白， 成为 了改造毕赤 酵母 菌株 的一个 热点 。基 因缺 失， 是一个常 用的改造和 构建新的毕赤酵母重组 菌株 常用的方法。 巴斯德毕赤 酵母 直接 基 因缺失方 法主要分 为两类 ： 有标记 的插入 替换和无标记的 Ｐ ｏ ｐ — Ｉ ｎ ／ Ｐ ｏ ｐ — Ｏ ｕ ｔ 。本文 系统地介绍 了这 两种方法 ， 分别比较 了各 自 的优缺点 ， 为它们在 巴斯德毕赤酵母 中进 行基因敲除提供 了一定参考 意义
关键 词 ： 巴斯 德 毕 赤 酵 母 ； 基 因缺 失 ； 反 向 筛 选标 记 ； Ｐ ｏ ｐ — Ｉ ｎ ／ Ｐ ｏ ｐ — Ｏ ｕ ｔ ； Ｃ ｒ ｅ — ｌ ｏ ｘ Ｐ 中图 分 类 号 ： Ｑ ９ ３ ． ３ 文献标识码 ： Ａ 文章编号 ： １ ６ ７ １ —５ ９ ３ ４（ ２ ０ １ ４ ） ０ ６—０ ０ ２ ８—０ ８