毕赤酵母发酵手册

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毕赤酵母手册

毕赤酵母表达实验手册作者：Jnuxz 来源：丁香园时间：2007-9-5大肠杆菌表达系统最突出的优点是工艺简单、产量高、周期短、生产成本低。

然而，许多蛋白质在翻译后，需经过翻译后的修饰加工，如磷酸化、糖基化、酰胺化及蛋白酶水解等过程才能转化成活性形式。

大肠杆菌缺少上述加工机制，不适合用于表达结构复杂的蛋白质。

另外，蛋白质的活性还依赖于形成正确的二硫键并折叠成高级结构，在大肠杆菌中表达的蛋白质往往不能进行正确的折叠，是以包含体状态存在。

包含体的形成虽然简化了产物的纯化，但不利于产物的活性，为了得到有活性的蛋白，就需要进行变性溶解及复性等操作，这一过程比较繁琐，同时增加了成本。

大肠杆菌是用得最多、研究最成熟的基因工程表达系统，当前已商业化的基因工程产品大多是通过大肠杆菌表达的，其主要优点是成本低、产量高、易于操作。

但大肠杆菌是原核生物，不具有真核生物的基因表达调控机制和蛋白质的加工修饰能力，其产物往住形成没有活性的包涵体，需要经过变性、复性等处理，才能应用。

近年来，以酵母作为工程菌表达外源蛋白日益引起重视，原因是与大肠杆菌相比，酵母是低等真核生物，除了具有细胞生长快，易于培养，遗传操作简单等原核生物的特点外，又具有真核生物时表达的蛋白质进行正确加工，修饰，合理的空间折叠等功能，非常有利于真核基因的表达，能有效克服大肠杆菌系统缺乏蛋白翻译后加工、修饰的不足。

因此酵母表达系统受到越来越多的重视和利用。

［1］。

同时与大肠杆菌相比，作为单细胞真核生物的酵母菌具有比较完备的基因表达调控机制和对表达产物的加工修饰能力。

酿酒酵母（Saccharomyces.Cerevisiae）在分子遗传学方面被人们的认识最早，也是最先作为外源基因表达的酵母宿主。

1981年酿酒酵母表达了第一个外源基因----干扰素基因［2］，随后又有一系列外源基因在该系统得到表达［3、4、5、6］。

干扰素和胰岛素虽然已经利用酿酒酵母大量生产并被广泛应用，当利用酿酒酵母制备时，实验室的结果很令人鼓舞，但由实验室扩展到工业规模时，其产量迅速下降。

毕赤酵母实验操作手册

毕赤酵母表达实验手册大肠杆菌表达系统最突出的优点是工艺简单、产量高、生产成本低。

然而，许多蛋白质在翻译的修饰加工，如磷酸化、糖基化、酰胺化及蛋白酶水解等过程才能转化成活性形式。

大肠杆菌缺少适合用于表达结构复杂的蛋白质。

另外，蛋白质的活性还依赖于形成正确的二硫键并折叠成高级结表达的蛋白质往往不能进行正确的折叠，是以包含体状态存在。

包含体的形成虽然简化了产物的纯的活性，为了得到有活性的蛋白，就需要进行变性溶解及复性等操作，这一过程比较繁琐，同时增与大肠杆菌相比，酵母是低等真核生物，具有细胞生长快，易于培养，遗传操作简单等原核生物的生物时表达的蛋白质进行正确加工，修饰，合理的空间折叠等功能，非常有利于真核基因的表达，菌系统缺乏蛋白翻泽后加工、修饰的不足。

因此酵母表达系统受到越来越多的重视和利用。

大肠杆菌是用得最多、研究最成熟的基因工程表达系统，当前已商业化的基因工程产品大多是通过其主要优点是成本低、产量高、易于操作。

但大肠杆菌是原核生物，不具有真核生物的基因表达调加工修饰能力，其产物往住形成没有活性的包涵体，需要经过变性、复性等处理，才能应用。

近年程菌表达外源蛋白日益引起重视，主更是因为酵母是单细胞真核生物，不但具有大肠杆菌易操作、化生产的特点，还具有真核生物表达系统基因表达调控和蛋白修饰功能，避免了产物活性低，包涵间题［1］。

与大肠杆菌相比，酵母是单细胞真核生物，具有比较完备的基因表达调控机制和对表达产物的们对酿酒酵母（Saccharomyces.Cerevisiae）分子遗传学方面的认识最早，酿酒酵母也最先作为外宿主．1981年酿酒酵母表达了第一个外源基因一干扰素基因，随后又有一系列外源基因在该系统得素和胰岛素已大量生产并在人群中广泛应用，但很大部分表达由实验室扩展到工业规模时，培养基数的选择压力消失，质粒变得不稳定，拷贝数下降，而大多数外源基因的高效表达需要高拷贝数的量下降。

同时，实验室用培养基复杂而昂贵，采用工业规模能够接受的培养基时，往往导致产量的酵母的局限，人们发展了以甲基营养型酵母（methylotrophic yeast）为代表的第二代酵母表达系甲基营养型酵母包括：Pichia、Candida等．以Pichia.pastoris（毕赤巴斯德酵母）为宿主的外源来发展最为迅速，应用也最为广泛，已利用此系统表达了一系列有重要生物学活性的蛋自质。

毕赤酵母发酵工艺手册

毕赤酵母发酵工艺手册1. 引言欢迎使用毕赤酵母发酵工艺手册。

本手册旨在介绍毕赤酵母发酵的基本原理、工艺步骤以及相关注意事项。

通过遵循本手册，您可以更好地理解和掌握毕赤酵母的发酵过程，从而在生产中取得更好的效果。

2. 毕赤酵母发酵基本原理- 毕赤酵母是一种常见的酵母菌，其发酵能力强，适用于多种发酵产品的生产。

- 发酵是指通过酵母菌对底物中的糖类进行代谢，产生酒精和二氧化碳的过程。

- 毕赤酵母在发酵过程中需要适宜的温度、pH值和营养物质等条件。

3. 毕赤酵母发酵工艺步骤1. 发酵前准备：- 准备好所需的发酵基质，包括糖类、氮源和维生素等。

- 对基质进行消毒处理，确保无害菌的存在。

2. 接种毕赤酵母：- 选择合适的毕赤酵母培养液进行接种，注意接种量的控制。

- 将毕赤酵母培养液均匀加入发酵基质中。

3. 发酵条件控制：- 控制发酵温度在合适的范围内，一般为25-30摄氏度。

- 监测发酵基质的pH值，保持在适宜的范围内。

- 提供足够的氧气供给，促进酵母的生长和代谢。

4. 发酵过程监测：- 定期对发酵过程中的温度、pH值和酵母数量等进行监测和记录。

- 根据监测结果及时调整发酵条件，确保发酵过程稳定进行。

5. 发酵结束：- 当发酵基质中的糖类被完全代谢，产物达到预期时，发酵过程结束。

- 将发酵产物经过处理和提取，得到最终的产品。

4. 注意事项- 在发酵过程中，应注意卫生和消毒，以防止杂菌的污染。

- 严格控制发酵条件，避免过高或过低的温度、pH值对发酵效果产生不利影响。

- 根据不同的发酵产品，可能需要调整发酵步骤和条件，建议根据具体要求进行调整。

- 在使用本工艺手册时，请参考其他文献和专业意见，确保准确性和可靠性。

以上是关于毕赤酵母发酵工艺手册的简要介绍。

希望本手册能对您在毕赤酵母的发酵工艺中提供帮助和指导。

如有任何问题，请随时与我们联系。

谢谢！。

毕赤酵母表达操作手册(PDF精译版)

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毕赤酵母多拷贝表达载体试剂盒用于在含多拷贝基因的毕赤酵母菌中表达并分离重组蛋白综述：基本特征：作为真核生物，毕赤酵母具有高等真核表达系统的许多优点：如蛋白加工、折叠、翻译后修饰等。

不仅如此，操作时与E.coli及酿酒酵母同样简单。

它比杆状病毒或哺乳动物组织培养等其它真核表达系统更快捷、简单、廉价，且表达水平更高。

同为酵母，毕赤酵母具有与酿酒酵母相似的分子及遗传操作优点，且它的外源蛋白表达水平是后者的十倍以至百倍。

这些使得毕赤酵母成为非常有用的蛋白表达系统。

与酿酒酵母相似技术：许多技术可以通用：互补转化基因置换基因破坏另外，在酿酒酵母中应用的术语也可用于毕赤酵母。

例如：HIS4基因都编码组氨酸脱氢酶；两者中基因产物有交叉互补；酿酒酵母中的一些野生型基因与毕赤酵母中的突变基因相互补，如HIS4、LEU2、ARG4、TR11、URA3等基因在毕赤酵母中都有各自相互补的突变基因。

毕赤酵母是甲醇营养型酵母：毕赤酵母是甲醇营养型酵母，可利用甲醇作为其唯一碳源。

甲醇代谢的第一步是：醇氧化酶利用氧分子将甲醇氧化为甲醛，还有过氧化氢。

为避免过氧化氢的毒性，甲醛代谢主要在一个特殊的细胞器－过氧化物酶体－里进行，使得有毒的副产物远离细胞其余组分。

比赤酵母发酵手册 Pichia fermentation

High Yield Protein Production from Pichia pastoris Yeast:A Protocol for Benchtop FermentationBy Julia Cino, PhDIntroductionOver the last several decades, geneticists have learned how to manipulate DNA to identify, excise, move and place genes into a variety of organisms that are quite different genetically from the source organism. A major use for many of these recombinant organisms is to produce proteins. Since many proteins are of immense commercial value, numerous studies have focused on finding ways to produce them inexpensively, easily and in a fully functional form.The production of a functional protein is intimately related to the cellular machinery of the organism producing the protein. E. coli has been the “factory” of choice for the expression of many proteins because its genome has been fully mapped and the organism is easy to handle; grows rapidly; requires an inexpensive, easy-to-prepare medium for growth; and secretes protein into the medium which facilitates recovery of the protein. However, E. coli is a prokaryote and lacks intracellular organelles, such as the endoplasmic reticulum and the golgi apparatus that are present in eukaryotes, which are responsible for modifications of the proteins being produced. Many eukaryotic proteins can be produced in E. coli but are produced in a nonfunctional, unfinished form, since glycosylation or post-translational modifications do notoccur. Therefore, researchers have recently turned to eukaryotic yeast and mammalian expression systems for protein production.Pichia Pastoris Expression SystemOne such eukaryotic yeast is the methanoltrophic Pichia pastoris. Pichia pastoris has been developed to be an outstanding host for the production of foreign proteins since its alcohol oxidase promoter was isolated and cloned; its transformation was first reported in 1985 [1,2]. Compared to other eukaryotic expression systems, Pichia offers many advantages, because it does not have the endotoxin problem associated with bacteria nor the viral contamination problem of proteins produced in animal cell culture. Furthermore, P. pastoris can utilize methanol as a carbon source in the absence of glucose. The P. pastoris expression system uses the methanol-induced alcohol oxidase (AOX1) promoter, which controls the gene that codes for the expression of alcohol oxidase, the enzyme which catalyzes the first step in the metabolism of methanol. This promoter has been characterized and incorporated into a series of P. pastoris expression vectors. Since the proteins produced in P. pastoris are typically folded correctly and secreted into the medium, the fermentation of genetically engineered P. pastoris provides an excellent alternative to E. coli expression systems. A number of proteins have been produced using this system, including tetanus toxin fragment, Bordatella pertussis pertactin, human serum albumin and lysozyme. (3 - 7).Minimizing Growth Limiting FactorsAnother advantage of Pichia pastoris is a prolific growth rate. Therefore, it would seem easy enough to culture it in a shake flask. This seeming advantage, however, can pose a host of problems, including pH control, oxygen limitation, nutrient limitation and temperature fluctuation. Researchers at New Brunswick Scientific (Edison, NJ) found that by switching from a shaker to a fermentor, protein production in Pichia could be increased by over 140% (3). The fermentor enables dissolved oxygen (DO) levels to be raised, not just by increasing agitation, but by increasing air flow, by supplementing the air s tream with pure oxygen, or by doing all three either in series or in parallel.Nutrient limitation can also be minimized, since fermentors can be run in fed-batch mode, where fresh media or growth limiting nutrients can be pumped into the vessel at a rate that is capable of replenishing the nutrients that are depleted. Shakers can only run in a batch mode, meaning that the growth of the cells is limited by the nutrients present in the medium at the time of inoculation. The fermentor’s fed-batch mode further enables methanol flow rates to be controlled to condition the cells to the presence of the methanol, as well as provide methanol at the proper rate to allow addition of just enough methanol for protein synthesis while preventing excess methanol addition which can cause toxicity.Researchers have found that optimum protein production in P. pastoris occurs at 30°C, and that all protein expression ceases at 32°C. However, high heat loads occur when P. pastoris is actively growing or expressing high levels of protein. In actively growing shake flask cultures, it is not uncommon for the temperature to increase 25°C if left uncontrolled. Therefore, it isimperative that all aspects of the fermentor, including temperature controller, heat exchanger, vessel and piping, must be designed to regulate temperature for optimum protein production. In addition to the fermentor’s internal controller, an external bioprocessing software (BioCommand®,New Brunswick Scientific) is routinely used to supervise the process, as well as to provide optimal nutrient feed rates, based on either the current status of the culture or to actuate pre-determined control scenarios.Fermentation ProtocolResearch was conducted in BioFlo® 3000 benchtop fermentors (New Brunswick Scientific) (Figure 1) with interchangeable, autoclavable vessels of 1.25 to 10 L working volume, as well as in a BioFlo 4500 fermentors with sterilizable-in-place vessels of 15 L and 20 L working volume, (New Brunswick Scientific). However, these procedures can be adapted to other size fermentors thereby making the protocols scalable. In the author’s laboratories, P. pastoris fermentations are run as multi-stage fed-batch processes with oxygen supplementation (Table 1). Here, oxygen is supplied automatically to meet the dissolved oxygen requirements for high-density cell growth.Method for a Typical CultureA frozen vial of 1 ml P. pastoris sample was inoculated into a 1 L shake flask with 150 mL Yeast Nitrogen Base (YNB)-glycerol medium. A variety of genetically engineered P. pastoris strains were used, many of which are slow growing on methanol (mut s) and engineered to produce proteins of interest. The culture was incubated at 30°C, 240 rpm, for 14 hours in anenvironmental incubator shaker (New Brunswick Scientific). The entire 150 mL volume of inoculum was transferred to a 3.3 L fermentor vessel (total volume) containing 1.5 L of basal salts medium (see media components, Table 2) plus 4.4 mL/L trace metal solution (4). The temperature was controlled at 30°C. The dissolved oxygen was set at 30% and pH is at 5.0. Ammonium hydroxide solution (30%) was used as the base solution to adjust the pH. After 20 hours of batch culture, the optical density (OD) reaches 42. The glycerol fed-batch process was then initiated. The feeding medium consisted of 50% glycerol and 12 mL/L of trace metal solution. The feed rate was 24 mL/L/h, which was adjusted automatically based on the DO reading. DO control was maintained by the proportional integral derivitive (PID) cascade controller, which changes the speed of agitation. Pure oxygen was automatically supplied to the fermentor to keep the DO level at the setpoint after the agitation speed reached the maximum allowable setpoint. After the growth phase, a half-hour carbon-source starvation period was established before the culture was switched to the production phase.The production phase (methanol feeding) was started after 43 hours of cell growth. The production feed medium consists of 100% methanol and 12 mL/L trace metal solution. Feeding rates were divided into three stages: 6 hr induction, 48 hr in a high-feed-rate stage and 44 hr in a low-feed-rate stage. The feeding rate of the induction stage was ramped from 1 to 10.9 mL/L/hr, which was controlled by the computer program. Feeding rates in the high and low rate stages were 15 and 2 mL/L/hr respectively. The total volume of feed was 2 L. During the fermentation, oxygen demand can be quite high and oxygen was added to the air stream automatically. (Figure 2)pH is usually adjusted to inhibit the activities of proteinases existing in the culture broth during the production phase. Furthermore, since a host strain that isprotease deficient was used, it was not necessary to change the pH level when culture was shifted from cell growth phase to production phase. It has been found that pH 5 is the optimal for cell metabolism and cell growth and that the oxygen consumption rate is higher at that pH. Using this protocol, optical densities of up to 630 can be obtained. Protein expression, of course, varies with the particular protein being expressed.Although not without problems related to its culture, P. pastoris culture protocols are scalable and have become a powerful tool for the production of commercially valuable proteins.More information on P. pastoris culture (expression vectors, protocols, etc.) can be obtained from Invitrogen, Inc., Carlsbad, CA and from Pichia Protocols published by Humana Press and edited by David R. Higgins and James M. CreggTIME STAGE MODE FEED SUBSTANCE* FEED RATE (Hrs) (ml/L/hr) 0-20Growth Batch None N.A.20-42.5Growth Fed-Batch50% Glycerol24**42.5-43Starvation Batch None N.A.43-49Induction Fed-Batch100% Methanol1-10.9***49-97Production Fed-Batch100% Methanol1597-141Production Fed-Batch100% Methanol2Table 1*All feed solutions contain 12 ml/L of a trace metals solution.**Feed rate adjusted based on dissolved oxygen levels via BioCommand®** *Linear ramp programmed via the “Time Profile” of BioCommand®Figure 1: BioFlo 3000 fermentor with supervisory control system.Figure 2: Pure oxygen supplementation profile of a P. pastoris culture showing the increasedoxygen requirement of the culture.Table 2:MEDIUM COMPONENTS AND FEED SOLUTIONSH3PO4 - 27 ml/LCaSO4. 2 H2O - 0.9 g/LK2SO4 - 18 g/LMgSO4. H2O -15 g/LKOH - 4.13 g/LTrace Metals Solution - 4.4 ml/LGlycerol - 40 g/LTrace Metals SolutionCupric sulfate . 5 H2O - 6.0 g/LSodium iodide - 0.08 g/LManganese sulfate . H2O - 3.0 g/LSodium molybdate - 0.2 g/LBoric acid - 0.02 g/LCobalt chloride - 0.5 g/LZinc chloride - 20 g/LFerrous sulfate . 7 H2O - 65.0 g/LBiotin - 0.2 g/LSulfuric acid - 5.0 mlWater - to 1.0 literFeed SolutionsGlycerol Feed Solution:50% glycerol with 12 ml/L trace metals solutionMethanol Feed Solution:100% glycerol with 12 ml/L trace metals solutionDr. Cino is Product Manager, New Brunswick Scientific, PO Box 4005, Edison, NJ 08818-4005. Phone 800-631-5417. Fax: 732-287-4222. Web: .E-mail: cino@. The author acknowledges Yinliang Chen, Jeffrey Krol, Victor Sterkin of New Brunswick ScientificReferences1. Cregg, J.M., J. F. Tschopp, C. Stillman, R. Siegel, M. Akong, W. S. Craig, R. G.Buckholz, L. R. Madden, P. A. Kellaris, G. R. Davis, B. L. Smiley, J. Cruze, R.Torregrossa, G. Velicelebi and G. P. Thill. 1987. High-level expression and efficient assembly of hepatitis B surface antigen in the methylotrophic yeast, Pichia pastoris. BIO /TECHNOLOGY, Vol 5, 479-4852. Brierley, R.A., C. Bussineau, R. Kosson, A. Melton and R. S. Siegel. 1992. inFermentation Development of Recombinant Pichia pastoris Expression the Heterologous Gene: Bovine Lysozyme, Annals New York Academy of Sciences, 350-3623. Chen, Y., Krol, J., Cino, J., Freedman, D., White, C., and Komives, E., 1996. ContinuousProduction of Thrombomodulin from a Pichia pastoris Fermentation . Journal Chem. Tech.Biotechnol. Vol. 67, 143-1484. Clare, J.J., F.B. Rayment, S.P. Ballantine, K. Sreekrishna and M.A.Romanos, 1991. High-level expression of tetanus toxin fragment C in Pichia pastoris strains containing multiple tandem integrations of the gene. BIO/TECHNOLOGY, Vol 9, 455-4605. Cregg, J.M., T.S. Vedvick and W.C. Raschke. 1993. Recent advances in the expressionof foreign genes in Pichia pastoris. BIO/TECHNOLOGY, Vol.11, 9056. Digan, M. E., S. V. Lair, R. A. Brierley, R. S. Siegel, M. E. Williams, S. B. Ellis, P. A.Kellaris, S. A. Provow, W. S. Craig, G. Velicelebi and M. M. Harpold. 1989.Continuous production of a novel lysozyme via secretion from the yeast, Pichia pastoris.Vol 7, 160-1647. Tschopp, J. F., G. Sverlow, R. Kosson, W. Craig and L. Grinna. 1987. High-levelsecretion of glycosylated invertase in the methylotrophic yeast, Pichia pastoris .BI0 /TECHNOLOGY, Vol 5, 1305Additional ReadingAgrawal, P., G. Koshy and M. Ramseier. 1989. An algorithm for operation a fed-batch fermentor at optimum specific-growth rate. Biotechnol. Bioeng., 33, 115-125Aiba, S., S. Nagai and Y. Nishizaqa. 1976. Fed-batch culture of Saccharomyces cerevisiae : a perspective of computer control to enhance the productivity in baker’s yeast cultivation. Biotechnol Bioeng., 18, 1001-1011Bentley, W. E. and D. S. Kompala. 1989. A novel structured kinetic modelingapproach for the analysis of plasmid instability in recombinant bacterial cultures. Biotechnol. Bioeng., 33, 49-61Komives, E. A. 1994. 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Optimization of a cultivation process for recombinant protein production by Escherichia coli. J. Biotechnol. 23, 271-289。

毕赤酵母发酵罐发酵

微生物发酵罐发酵（毕赤酵母）灭菌前：室温下校准PH电极，先校6.86零点再4.0斜率（若的发酵pH很长时间是酸性的（如酵母发酵）用6.86校正零点，4.0校正斜率；若你的发酵pH很长时间是碱性的（如某些细菌发酵）用6.86校正零点，9.18校正斜率）；室温下校准溶氧电极，1.0点在不接溶氧电极时候标定，100%点接上溶氧电极，放置在空气中较定；或2.0点在灭菌过程中，温度达到121度左右压力0.12mpa左右时候标定，100%在灭菌结束，降温至发酵温度并稳定，转速在发酵初始转速，通气量在发酵初始通气量时候标定灭菌：1.灭菌，先将各排气阀打开，将蒸汽引入夹套或蛇管进行预热，待罐温升至80~90℃，将排气阀逐渐关小。

接着将蒸汽从进气口、排料口、取样口直接通入罐中（如有冲视罐也同时进汽），使罐温上升到118~120℃，罐压维持在0.09~0.1Mpa（表压），并保持30min左右。

2.保温结束后，依次关闭各排汽、进汽阀门，待罐内压力低于空气压力后，向罐内通入无菌空气，在夹套或蛇管中通冷却水降温，使培养基的温度降到所需的温度，进行下一步的发酵和培养。

（注意压力：灭菌时，总蒸汽管道压力要求不低于0.3~0.35Mpa，使用压力不低于0.2Mpa。

）灭菌后:A.消耗甘油阶段1.灭菌后冷却30℃时：2.冷却至30℃时，开启搅拌(转速最大)和通气(0.1-1.0vvm),接通28%氨水(未稀释)调PH5.0;每升加4.35ml的无菌PTM1基础盐；3.从摇瓶中接种种子液，DO值为100%，开始培养后会消耗，导致DO值下降，通氧气以确保DO值超过20％，速率先为0.1vvm。

4. 发酵过夜甘油被完全消耗（18-24h），标志为DO值增加到100％。

【每天至少两次取样，测OD600，湿重，显微观察.将菌体和上清（离心后）在-80℃下保藏，用于后面的分析。

】5.这个阶段所期望达到的细胞产量为90-150g/L湿细胞。

毕赤酵母的摇瓶发酵方法[指南]

毕赤酵母的摇瓶发酵方法：一、摇瓶发酵方法:毕赤酵母摇瓶发酵方法分为两个阶段，1、酵母菌株生长阶段；2、脂肪酶诱导表达阶段。

1、酵母生长阶段。

准备试剂：1000ml BMGY培养基，1000ml BMMY培养基，10X的甲醇，摇瓶1L（灭菌），温控摇床，50ml离心管（灭菌）。

紫外分光光度计，石英比色皿。

以下所有操作均在超净台内或者无菌条件下完成。

（1）往灭好菌的IL摇瓶中加入100mlBMGY培养基，然后加入约1ml脂肪酶菌株（培养基：菌液=100：1），用透气膜封口（透气，但是细菌不能透过）。

置于温控摇床上，温度调至300C，转速为250-300rpm/min，使酵母生长，OD600=2.0-6.0，时间约为15-24小时。

（2）将发酵液转入50ml离心管，1500g-3000g离心5min。

去掉上清，用BMMY 培养基将菌体浓度稀释至OD600=1.0，约有500ml左右。

将稀释后的发酵液分别加入到1L的药瓶中，每个摇瓶150ml发酵液（绝不能超过200ml）。

（3）将摇瓶置于温控摇床上，温度调至300C，转速为250-300rpm/min，使酵母表达脂肪酶，每24小时加入一次5%的甲醇，使甲醇的终浓度为0.5%。

连续诱导表达48小时。

（4）将发酵液进行12000rpm/min离心5min，取上清（若上清仍混浊，可反复离心）；进行酶活分析和蛋白含量分析。

BMGY培养基的配制（1000ml）：20g蛋白胨（peptone）,10g酵母提取物（Yeast Extract）,加水至700ml；1210C高温灭菌20min。

然后分别在无菌条件下加入10X YNB 100ml，10X 磷酸钾缓冲液（PH6.0）100ml，10X甘油 100ml。

BMMY培养基的配制方法（1000ml）：20g蛋白胨（peptone）,10g酵母提取物,加水至700ml；1210C高温灭菌20min。

然后分别在无菌条件下加入10X YNB 100ml，10X 磷酸钾缓冲液（PH6.0）100ml，10X甲醇 100ml。

毕赤酵母表达(pichia pastoris expression )实验手册(3)

毕赤酵母表达（pichia pastoris expression ）实验手册（3）液体YPD培养基可常温保存；琼脂YPD平板在4℃可保存几个月。

加入Ze ocin 100ug / ml，成为YPDZ培养基，可以4℃条件下保存1～2周。

2.4 YPDS + Zeocin 培养基（Yeast Extract Peptone Dextrose Medi um）：yeast extract 1%peptone 2%dextrose (glucose) 2%sorbitol 1 M+agar 2%+ Zeocin 100 μg/ml不管是液体 YPDS培养基，还是YPDS + Zeocin 培养基，都必须存放4℃条件下，有效期1～2周。

2.5 MGYMinimal Glycerol Medium （最小甘油培养基）（34%YNB；1%甘油；4*10-5%生物素）。

将800ml灭菌水、100ml的 10* YNB母液、2ml的500*B母液和100ml的10*GY母液混匀即可，4℃保存，保存期为2个月。

2.6 MGYHMinimal Glycerol Medium + Histidine （最小甘油培养基 + 0.004%组氨酸）在1000ml的MGY培养基中加入 10ml的100*H母液混匀，4℃保存，保存期为2个月。

2.7 RDRegeneration Dextrose Medium （葡萄糖再生培养基）（含有：1mol/L的山梨醇；2%葡萄糖；1.34%YNB；4*10-5%生物素；0. 005%氨基酸）1. 将186g的山梨醇定容至700ml，高压灭菌；2. 冷却后于45℃水浴；3. 将100ml的10*D、100ml的10*YNB；2ml的500*B；10ml的100*AA等母液和88ml无菌水混匀，预热至45℃后，与步骤2 的山梨醇溶液混合。

4℃保存。

2.8 RDHRegeneration Dextrose Medium + Histidine （葡萄糖再生培养基 + 0.004%组氨酸）在RD培养基配制的第三步中，在加入10ml的100*H母液，同时无菌水的体积减少至78ml即可，其余配制方法与RD相同。

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毕赤酵母发酵手册总览简介：毕赤酵母和酿酒酵母很相似，都非常适合发酵生长。

毕赤酵母在有可能提高总体的蛋白质产量的发酵中能够达到非常高的细胞浓度，我们建议只有那些有过发酵经验或者能得到有经验的人的指导的人参与发酵。

因为发酵的类型很多，所以我们很难为您的个人案例提高详细的过程。

下面所给出的指导是基于Mut+和Mut s两种基因型的毕赤酵母菌株在15L的台式玻璃发酵罐中发酵而成。

请在您的发酵开始前先阅读操作员手册。

下面所给出的表就发酵参数：在整个发酵过程中监测和调控下列参数非常重要。

下面的表格描述了这些参设备推荐：下面是所推荐设备的清单：·发酵罐的夹套需要在发酵过程中给酵母菌降温，尤其是在甲醇流加过程中。

你需要一个固定的来源来提供冷却水（5-10℃）。

这可能意味着你需要一个冷冻装置来保持水的冷却。

·一个泡沫探针就像消泡剂一样不可或缺。

·一个氧气的来源——空气（不锈钢的发酵罐需要1-2vvm）或者纯氧（玻璃发酵罐需要0.1-0.3vvm）。

·添加甘油和甲醇的补料泵。

·pH的自动控制。

培养基的准备：你需要准确配置下列溶液：·发酵所需的基本盐类（第11页）·PTM1补充盐类（第11页）·75ml的50％的甘油每升初始发酵液，12ml的PTM1补充盐每升甘油。

·740ml的100％的甲醇每升初始发酵液，12ml的PTM1补充盐每升甲醇。

毕赤酵母生长的测定：在不同的时间点通过测OD600的吸光值和湿细胞的重量来检测毕赤酵母的生长。

培养的代谢速率通过通过观察溶氧浓度对应于有效碳源来测定。

溶氧的测定：简介：溶解氧的浓度时指氧气在培养基中的相关比例，溶氧100％是指培养基中氧达到饱和。

毕赤酵母的生长需要消耗氧气，减少溶解氧的满度。

毕赤酵母在生长时会消耗氧气，减少溶氧的程度。

然而，因为代谢甲醇的最初阶段需要氧气，所以将溶氧浓度维持在一个适当的水平（＞20％）来确保毕赤酵母在甲醇上的生长就至关重要。

准确测定和监测培养中的溶氧浓度将会为您提供关于培养状态和健康程度之类的重要信息。

因此，精确校正您的发酵设备非常重要，请查阅您的操作手册。

溶氧浓度的维持：1、很难依靠发酵罐的氧气转换速率（OTR）将溶氧浓度维持在20％，特别是在小型的玻璃罐中。

在玻璃发酵罐中，通气一般约为0.1-0.3vvm（1L发酵液每分钟1L氧气）来提供氧气使DO保持在20％。

氧气消耗的变化依赖于所添加的甲醇的总量和蛋白质的表达。

2、在通气为0.1-0.3vvm时，氧气可达到足够的水平，这在许多玻璃发酵罐中可以通过通入无菌空气来实现。

在不锈钢发酵罐中，压力可增加OTR（与K L a 有关）。

3、如果一个发酵罐不能提供足够水平的氧气，甲醇的添加需要因此适当降低。

请注意降低甲醇的总量可能导致蛋白质表达水平的降低。

4、为了使蛋白质表达水平达到最大，发酵时间应被分割来以较低的流加速度添加相似水平的甲醇。

对许多重组蛋白质来说，可以观察到甲醇消耗的总量和蛋白质产生的总量有直接的关系。

DO测量的用处：在毕赤酵母生长阶段，消耗氧气而使DO浓度维持在较低水平。

请注意不管是在甘油或甲醇中生长，都要消耗氧气。

DO浓度可用来衡量代谢速率和碳源是否受抑制，代谢速率则是培养健康程度的一个指标。

如果你希望能够完全的诱导AOX1启动子，确定碳源是否受抑制就非常重要。

例如：DO浓度的改变可让你确定是否在添加甲醇前所有的甘油都已耗尽，其次还可以确定甲醇流加的速率是否超过消耗的速率。

过多的甲醇（＞1-2％vvm）可能会产生毒害。

DO的调控：如果碳源受到抑制，关闭碳源的添加将会导致培养理工甲醇的速率降低，DO值会上升。

终止碳源的添加，观察在碳源的流加关闭后需要多长时间来使DO值上升10％。

如果延迟时间很短（＜1min），说明碳源受抑制。

发酵的准备和甘油批式发酵发酵种子液的摇瓶培养：记住不要向摇瓶中加入太多的培养基，培养基体积应该在摇瓶总体积的10-30％左右。

1、摇瓶中包含约为初始发酵液体积5-10％的从MD或MGY平板上的一个菌落或者冷冻甘油储藏液中接种的MGY或BMGY。

2、摇瓶应该30℃，250-300rpm的摇床上培养16-24h直到OD600=2-6。

为了精确的测量OD600＞1.0，在读数前将样液稀释10倍。

甘油批式发酵：1、将发酵罐和包含4％甘油的发酵基础盐类培养基灭菌。

2、在灭菌和冷却后，待温度降至30℃时，开启搅拌和通气至操作环境（通常为最大转速和0.1-1.0vvm）并用28％的氨水（未稀释）将培养基的pH调整到5.0。

每升培养基中加入4.35ml无菌的PTM1基础盐类。

3、从种子液摇瓶中接种初试发酵体积5-10％的种子液到发酵罐内。

请注意在培养开始先DO值接近于100％。

当开始培养后会消耗氧气，导致DO值下降。

请添加所需氧气以确保DO值超过20％。

4、进行批式发酵直到甘油被完全消耗（18-24h），标志是DO值增加到100％。

请注意甘油完全消耗的时间会随着初试发酵液密度而变化。

5、每个发酵阶段的完成都需要进行取样，并且每天至少两次。

每个时间点取10ml样品，并从10ml中另取出1ml样品。

样品用于分析细胞的生长（OD600和细胞湿重），pH，显微观察，蛋白质的浓度或活性。

将菌体和上清（离心后）在-80℃下保藏，用于后面的分析。

再进行第5页的甘油补料培养。

产量：这个阶段所期望达到的细胞产量为90-150g/L湿细胞。

重组蛋白质由于缺乏甲醇的诱导而不会产生。

甘油补料培养介绍：一旦所有的甘油在批式发酵培养中耗尽，甘油的补料需要马上开始来在限制条件下增加细胞生物量。

当你准备进行甲醇诱导时，你需要通过DO值来确定甘油已耗尽。

甘油补料培养：1、加入50％w/v的每升含12mlPTM1的甘油进行补料。

将补料速率设为18.15ml每小时每升初试发酵液体积。

2、甘油补料将进行约4h或更长。

在本阶段完成后细胞产量应达到180-220g/L湿细胞但是不会有重组蛋白质的产生。

注意：蛋白质的表达水平依赖于在甘油补料培养中所产生的细胞量。

补料持续时间将会变化来使蛋白质的产量达到最优，建议的大致的范围为50-300g/L湿细胞。

4％甘油的是所建议的在补料中的最大水平，更高的甘油浓度将会产生毒害问题。

重要：如果溶氧低于20％，应该停止甘油或甲醇的补料并且不做任何提高溶氧的事直到溶氧稳定。

这时开始调整搅拌、通气、压力或氧气的补充。

蛋白酶：在文献中，有报道称如果培养基的pH低于3.0，中性蛋白酶会被抑制。

如果你认为中性蛋白酶降低了你的蛋白质的产量，在甘油补料培养中或者在甲醇诱导的开始阶段将pH控制设定点改为3.0并且允许培养的代谢活动在低于3.0的pH条件下进行4-5h（Brierley，et al.，1994；Siegel，et al.，1990）。

甲醇补料培养简介：在甲醇补料来充分诱导AOX1启动子前左右的甘油都必须消耗干净。

然而，有报道称甘油和甲醇的混合补料已经成功的表达了重组蛋白质（Breerley，et al.，1990；Sreekrishna，et al.，1989）。

慢慢的流加甲醇来使培养适应在甲醇中生长非常重要。

如果甲醇加德太快将会杀死细胞。

一旦培养物适应了甲醇，用DO值来分析培养的状态并且来确定甲醇流加的时间点来使蛋白质的表达达到最优。

在甲醇上生长液会产生大量热量。

所以这个阶段温度的控制非常重要。

Mut+型菌株的甲醇补料培养：1、终止甘油的补料并且开始用含12mlPTM1基本盐类每升的100％的甲醇进行诱导。

设定补料速率为3.6ml/h每升初试发酵液体积。

2、在开始的2-3h内甲醇会在发酵液中累积，培养物适应甲醇的过程中溶氧值会有变化。

3、如果DO值不能维持在20％以上，停止流加甲醇，等到DO值稳定后继续以当前速率流加甲醇。

增加搅拌、通气、压力或者氧气的补充来使DO维持在20％以上。

4、当培养物完全适应利用甲醇（2-4h）并且甲醇成为其限制性生长因子后，将会有一个稳定的DO读数和一个较快的DO稳定时间点（通常不到1min）。

在培养物适应甲醇后而将流加速率翻倍前在限制条件下保持这个较低的流加速率最少1h。

然后流加速率增加一倍到约7.3ml/h每升初始发酵液体积。

5、在以7.3ml/h/L的速率流加2h后，增大甲醇流加速率到10.9 ml/h每升初始发酵液体积。

这个流加速率贯穿剩余发酵过程。

6、整个甲醇补料培养一共加入接近740ml每升发酵液初始体积，持续差不多70h。

然而，这个针对不同的蛋白质可能会有一些变化。

产量：在甲醇补料培养中细胞浓度会最终增加到350-450g/L湿细胞。

记住这些因为大多数的发酵都在进行补料培养模式，最终的发酵体积会接近于2倍初始发酵体积。

Mut s型毕赤酵母菌株的发酵：因为Mut s型培养物代谢甲醇不充分，他们的氧气消耗就非常低。

因此，你不能利用DO值来估量培养。

在Mut s型菌株的标准发酵中，调整甲醇流加速率来保持培养基中的不超过0.3％（可以由气象色谱分析来确定）的过量甲醇。

当气象色谱分析确保甲醇维持在无毒害水平，我们在有经验的指导下来进行Mut s 型菌株的蛋白质的表达。

气象色谱分析对于分析和优化Mut s型重组菌株的生长非常有帮助。

甲醇补料培养，接上Mut s型菌株的甲醇补料培养:Mut s型菌株的甘油批式培养和甘油补料培养这两个阶段按照Mut+型菌株所描述的发酵。

Mut+型和Mut s型在甲醇诱导阶段的区别主要是方法和培养过程中甲醇流加的总量。

1、在开始阶段流以1ml/h每升初始发酵液体积的速率流加每升含12mlPTM1基础盐类的甲醇2h。

然后每30min增加10％直到3ml/h的速率，以此速率保持整个发酵过程。

2、发酵在甲醇诱导约100h后放罐。

时间可能因蛋白质表达的优化而变化。

细胞的成熟与衰退：简介：方法和设备不完全的列在下面。

细胞的总量或上清液的体积将会决定你需要哪种设备。

收获细胞和上清液：在小型发酵罐（1-10L）中，培养物可以被手机到离心管（500-1000ml）中，再到离心管中将细胞从上清液中分离出来。

在大型发酵罐中，大型的膜过滤单元（微孔）或Sharples离心机可用于将细胞从上清液中分离出来。

最合适的方法依赖于你需要细胞还是上清液作为你想要表达的蛋白质的来源和你可以利用到什么。

上清液可以直接装载到适当的蒸馏塔中或通过超滤来浓缩。

细胞的衰亡：我们建议用玻璃粉来进行细胞破碎。

这个方法对于大量的细胞来说可能显得繁冗。

遂于大量的细胞，我们发现用乳化技术效果很好。

French式压碎细胞看上去效果没有玻璃粉或者如花技术那么好。

BMGY基本培养基：对于1L的培养基，将下列成分混合加入：85％的磷酸26.7mlCaSO40.93gK2 SO418.2gMg SO414.9gKOH 4.13g甘油40g水加至1L（NH4）2SO410g/LPTM1基本盐类：Cu SO4-5H2O 6g碘化钠0.08gMn SO4- H2O 3.0g钼酸钠-2 H2O 0.2g硼酸0.02g氯化钴0.5gZnCl220.0gFe SO465.0g生物素0.2gH2 SO45ml加水至1L加入后可能会产生沉淀，无关紧要。