毕赤酵母手册

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毕赤酵母表达手册

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毕赤酵母多拷贝表达载体试剂盒用于在含多拷贝基因的毕赤酵母菌中表达并分离重组蛋白综述：基本特征：作为真核生物，毕赤酵母具有高等真核表达系统的许多优点：如蛋白加工、折叠、翻译后修饰等。

不仅如此，操作时与E.coli及酿酒酵母同样简单。

它比杆状病毒或哺乳动物组织培养等其它真核表达系统更快捷、简单、廉价，且表达水平更高。

同为酵母，毕赤酵母具有与酿酒酵母相似的分子及遗传操作优点，且它的外源蛋白表达水平是后者的十倍以至百倍。

这些使得毕赤酵母成为非常有用的蛋白表达系统。

与酿酒酵母相似技术：许多技术可以通用：互补转化基因置换基因破坏另外，在酿酒酵母中应用的术语也可用于毕赤酵母。

例如：HIS4基因都编码组氨酸脱氢酶；两者中基因产物有交叉互补；酿酒酵母中的一些野生型基因与毕赤酵母中的突变基因相互补，如HIS4、LEU2、ARG4、TR11、URA3等基因在毕赤酵母中都有各自相互补的突变基因。

毕赤酵母是甲醇营养型酵母：毕赤酵母是甲醇营养型酵母，可利用甲醇作为其唯一碳源。

甲醇代谢的第一步是：醇氧化酶利用氧分子将甲醇氧化为甲醛，还有过氧化氢。

为避免过氧化氢的毒性，甲醛代谢主要在一个特殊的细胞器－过氧化物酶体－里进行，使得有毒的副产物远离细胞其余组分。

毕赤酵母表达操作手册(PDF精译版)

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不仅如此，操作时与E.coli及酿酒酵母同样简单。

它比杆状病毒或哺乳动物组织培养等其它真核表达系统更快捷、简单、廉价，且表达水平更高。

同为酵母，毕赤酵母具有与酿酒酵母相似的分子及遗传操作优点，且它的外源蛋白表达水平是后者的十倍以至百倍。

这些使得毕赤酵母成为非常有用的蛋白表达系统。

与酿酒酵母相似技术：许多技术可以通用：互补转化基因置换基因破坏另外，在酿酒酵母中应用的术语也可用于毕赤酵母。

毕赤酵母是甲醇营养型酵母：毕赤酵母是甲醇营养型酵母，可利用甲醇作为其唯一碳源。

甲醇代谢的第一步是：醇氧化酶利用氧分子将甲醇氧化为甲醛，还有过氧化氢。

为避免过氧化氢的毒性，甲醛代谢主要在一个特殊的细胞器－过氧化物酶体－里进行，使得有毒的副产物远离细胞其余组分。

毕赤酵母发酵手册

毕赤酵母发酵手册总览简介：毕赤酵母和酿酒酵母很相似，都非常适合发酵生长。

毕赤酵母在有可能提高总体的蛋白质产量的发酵中能够达到非常高的细胞浓度，我们建议只有那些有过发酵经验或者能得到有经验的人的指导的人参与发酵。

因为发酵的类型很多，所以我们很难为您的个人案例提高详细的过程。

下面所给出的指导是基于Mut+和Mut s两种基因型的毕赤酵母菌株在15L的台式玻璃发酵罐中发酵而成。

请在您的发酵开始前先阅读操作员手册。

下面所给出的表就发酵参数：在整个发酵过程中监测和调控下列参数非常重要。

下面的表格描述了这些参设备推荐：下面是所推荐设备的清单：·发酵罐的夹套需要在发酵过程中给酵母菌降温，尤其是在甲醇流加过程中。

你需要一个固定的来源来提供冷却水（5-10℃）。

这可能意味着你需要一个冷冻装置来保持水的冷却。

·一个泡沫探针就像消泡剂一样不可或缺。

·一个氧气的来源——空气（不锈钢的发酵罐需要1-2vvm）或者纯氧（玻璃发酵罐需要0.1-0.3vvm）。

·添加甘油和甲醇的补料泵。

·pH的自动控制。

培养基的准备：你需要准确配置下列溶液：·发酵所需的基本盐类（第11页）·PTM1补充盐类（第11页）·75ml的50％的甘油每升初始发酵液，12ml的PTM1补充盐每升甘油。

·740ml的100％的甲醇每升初始发酵液，12ml的PTM1补充盐每升甲醇。

毕赤酵母生长的测定：在不同的时间点通过测OD600的吸光值和湿细胞的重量来检测毕赤酵母的生长。

培养的代谢速率通过通过观察溶氧浓度对应于有效碳源来测定。

溶氧的测定：简介：溶解氧的浓度时指氧气在培养基中的相关比例，溶氧100％是指培养基中氧达到饱和。

毕赤酵母的生长需要消耗氧气，减少溶解氧的满度。

毕赤酵母在生长时会消耗氧气，减少溶氧的程度。

然而，因为代谢甲醇的最初阶段需要氧气，所以将溶氧浓度维持在一个适当的水平（＞20％）来确保毕赤酵母在甲醇上的生长就至关重要。

毕赤酵母实验操作手册

毕赤酵母表达实验手册大肠杆菌表达系统最突出的优点是工艺简单、产量高、生产成本低。

然而，许多蛋白质在翻译的修饰加工，如磷酸化、糖基化、酰胺化及蛋白酶水解等过程才能转化成活性形式。

大肠杆菌缺少适合用于表达结构复杂的蛋白质。

另外，蛋白质的活性还依赖于形成正确的二硫键并折叠成高级结表达的蛋白质往往不能进行正确的折叠，是以包含体状态存在。

包含体的形成虽然简化了产物的纯的活性，为了得到有活性的蛋白，就需要进行变性溶解及复性等操作，这一过程比较繁琐，同时增与大肠杆菌相比，酵母是低等真核生物，具有细胞生长快，易于培养，遗传操作简单等原核生物的生物时表达的蛋白质进行正确加工，修饰，合理的空间折叠等功能，非常有利于真核基因的表达，菌系统缺乏蛋白翻泽后加工、修饰的不足。

因此酵母表达系统受到越来越多的重视和利用。

大肠杆菌是用得最多、研究最成熟的基因工程表达系统，当前已商业化的基因工程产品大多是通过其主要优点是成本低、产量高、易于操作。

但大肠杆菌是原核生物，不具有真核生物的基因表达调加工修饰能力，其产物往住形成没有活性的包涵体，需要经过变性、复性等处理，才能应用。

近年程菌表达外源蛋白日益引起重视，主更是因为酵母是单细胞真核生物，不但具有大肠杆菌易操作、化生产的特点，还具有真核生物表达系统基因表达调控和蛋白修饰功能，避免了产物活性低，包涵间题［1］。

与大肠杆菌相比，酵母是单细胞真核生物，具有比较完备的基因表达调控机制和对表达产物的们对酿酒酵母（Saccharomyces.Cerevisiae）分子遗传学方面的认识最早，酿酒酵母也最先作为外宿主．1981年酿酒酵母表达了第一个外源基因一干扰素基因，随后又有一系列外源基因在该系统得素和胰岛素已大量生产并在人群中广泛应用，但很大部分表达由实验室扩展到工业规模时，培养基数的选择压力消失，质粒变得不稳定，拷贝数下降，而大多数外源基因的高效表达需要高拷贝数的量下降。

同时，实验室用培养基复杂而昂贵，采用工业规模能够接受的培养基时，往往导致产量的酵母的局限，人们发展了以甲基营养型酵母（methylotrophic yeast）为代表的第二代酵母表达系甲基营养型酵母包括：Pichia、Candida等．以Pichia.pastoris（毕赤巴斯德酵母）为宿主的外源来发展最为迅速，应用也最为广泛，已利用此系统表达了一系列有重要生物学活性的蛋自质。

毕赤酵母表达手册

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不仅如此，操作时与E.coli及酿酒酵母同样简单。

它比杆状病毒或哺乳动物组织培养等其它真核表达系统更快捷、简单、廉价，且表达水平更高。

同为酵母，毕赤酵母具有与酿酒酵母相似的分子及遗传操作优点，且它的外源蛋白表达水平是后者的十倍以至百倍。

这些使得毕赤酵母成为非常有用的蛋白表达系统。

与酿酒酵母相似技术：许多技术可以通用：互补转化基因置换基因破坏另外，在酿酒酵母中应用的术语也可用于毕赤酵母。

毕赤酵母是甲醇营养型酵母：毕赤酵母是甲醇营养型酵母，可利用甲醇作为其唯一碳源。

甲醇代谢的第一步是：醇氧化酶利用氧分子将甲醇氧化为甲醛，还有过氧化氢。

为避免过氧化氢的毒性，甲醛代谢主要在一个特殊的细胞器－过氧化物酶体－里进行，使得有毒的副产物远离细胞其余组分。

毕赤酵母发酵工艺手册

毕赤酵母发酵工艺手册1. 引言欢迎使用毕赤酵母发酵工艺手册。

本手册旨在介绍毕赤酵母发酵的基本原理、工艺步骤以及相关注意事项。

通过遵循本手册，您可以更好地理解和掌握毕赤酵母的发酵过程，从而在生产中取得更好的效果。

2. 毕赤酵母发酵基本原理- 毕赤酵母是一种常见的酵母菌，其发酵能力强，适用于多种发酵产品的生产。

- 发酵是指通过酵母菌对底物中的糖类进行代谢，产生酒精和二氧化碳的过程。

- 毕赤酵母在发酵过程中需要适宜的温度、pH值和营养物质等条件。

3. 毕赤酵母发酵工艺步骤1. 发酵前准备：- 准备好所需的发酵基质，包括糖类、氮源和维生素等。

- 对基质进行消毒处理，确保无害菌的存在。

2. 接种毕赤酵母：- 选择合适的毕赤酵母培养液进行接种，注意接种量的控制。

- 将毕赤酵母培养液均匀加入发酵基质中。

3. 发酵条件控制：- 控制发酵温度在合适的范围内，一般为25-30摄氏度。

- 监测发酵基质的pH值，保持在适宜的范围内。

- 提供足够的氧气供给，促进酵母的生长和代谢。

4. 发酵过程监测：- 定期对发酵过程中的温度、pH值和酵母数量等进行监测和记录。

- 根据监测结果及时调整发酵条件，确保发酵过程稳定进行。

5. 发酵结束：- 当发酵基质中的糖类被完全代谢，产物达到预期时，发酵过程结束。

- 将发酵产物经过处理和提取，得到最终的产品。

4. 注意事项- 在发酵过程中，应注意卫生和消毒，以防止杂菌的污染。

- 严格控制发酵条件，避免过高或过低的温度、pH值对发酵效果产生不利影响。

- 根据不同的发酵产品，可能需要调整发酵步骤和条件，建议根据具体要求进行调整。

- 在使用本工艺手册时，请参考其他文献和专业意见，确保准确性和可靠性。

以上是关于毕赤酵母发酵工艺手册的简要介绍。

希望本手册能对您在毕赤酵母的发酵工艺中提供帮助和指导。

如有任何问题，请随时与我们联系。

谢谢！。

GS115毕赤酵母表达菌使用说明

GS115 毕赤酵母表达菌
编号
名称
北京华越洋生物 NRR01030 GS115 毕赤酵母表达菌
基本信息：
名称：GS115 毕赤酵母表达菌
规格：300ul 甘油菌
储存温度： -‐80℃
发突变为组氨酸野生型的概率一般低于 10-‐8。GS115 毕赤酵母可以在 YPD
培养基中生长，或者在补充有组氨酸的 minimal media 中生长，但是无法
在单独的 minimal media 中生长。GS115 毕赤酵母在做质粒转化的时候，
可采用电转化的方式将质粒转入。
基因组：
His4（基因 5 是毕赤酵母菌株，是巴斯德毕赤酵母的一种，属于真核细胞。
一般的针对原核生物的抗生素例如卡那和氨苄对酵母是无效的，因此为了
操作说明：
1，本品包含一份甘油菌，使用本甘油菌时可以不用完全融解，在甘油菌表
面蘸取少量涂板或进行液体培养即可。也可以完全融解后使用，但随着冻融次数
的增加，细菌的活力会逐渐下降。
2，为保证菌种纯正，避免其它细菌污染，尽量先划平板，然后再挑单克隆
菌落进行后续操作。
毕赤酵母适宜的生长温度是 28 至 30 度，温度超过 32 度对蛋白的表
达是有害的，并可能导致细胞的死亡。GS115 毕赤酵母是是组氨酸缺陷型
（His4 基因型），如果表达载体上携带有组氨酸基因，可补偿宿主菌的组
氨酸缺陷，因此可以在不含组氨酸的培养基上筛选转化子。这些受体菌自
养。细菌在 30-‐35℃培养箱中培养 24-‐48h，真菌在 23-‐28℃培养箱中培养 24-‐72h
（必要时，可适当延长培养时间）。

毕赤酵母表达操作手册(PDF精译版)

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不仅如此，操作时与E.coli及酿酒酵母同样简单。

它比杆状病毒或哺乳动物组织培养等其它真核表达系统更快捷、简单、廉价，且表达水平更高。

同为酵母，毕赤酵母具有与酿酒酵母相似的分子及遗传操作优点，且它的外源蛋白表达水平是后者的十倍以至百倍。

这些使得毕赤酵母成为非常有用的蛋白表达系统。

与酿酒酵母相似技术：许多技术可以通用：互补转化基因置换基因破坏另外，在酿酒酵母中应用的术语也可用于毕赤酵母。

毕赤酵母是甲醇营养型酵母：毕赤酵母是甲醇营养型酵母，可利用甲醇作为其唯一碳源。

甲醇代谢的第一步是：醇氧化酶利用氧分子将甲醇氧化为甲醛，还有过氧化氢。

为避免过氧化氢的毒性，甲醛代谢主要在一个特殊的细胞器－过氧化物酶体－里进行，使得有毒的副产物远离细胞其余组分。

比赤酵母发酵手册 Pichia fermentation

High Yield Protein Production from Pichia pastoris Yeast:A Protocol for Benchtop FermentationBy Julia Cino, PhDIntroductionOver the last several decades, geneticists have learned how to manipulate DNA to identify, excise, move and place genes into a variety of organisms that are quite different genetically from the source organism. A major use for many of these recombinant organisms is to produce proteins. Since many proteins are of immense commercial value, numerous studies have focused on finding ways to produce them inexpensively, easily and in a fully functional form.The production of a functional protein is intimately related to the cellular machinery of the organism producing the protein. E. coli has been the “factory” of choice for the expression of many proteins because its genome has been fully mapped and the organism is easy to handle; grows rapidly; requires an inexpensive, easy-to-prepare medium for growth; and secretes protein into the medium which facilitates recovery of the protein. However, E. coli is a prokaryote and lacks intracellular organelles, such as the endoplasmic reticulum and the golgi apparatus that are present in eukaryotes, which are responsible for modifications of the proteins being produced. Many eukaryotic proteins can be produced in E. coli but are produced in a nonfunctional, unfinished form, since glycosylation or post-translational modifications do notoccur. Therefore, researchers have recently turned to eukaryotic yeast and mammalian expression systems for protein production.Pichia Pastoris Expression SystemOne such eukaryotic yeast is the methanoltrophic Pichia pastoris. Pichia pastoris has been developed to be an outstanding host for the production of foreign proteins since its alcohol oxidase promoter was isolated and cloned; its transformation was first reported in 1985 [1,2]. Compared to other eukaryotic expression systems, Pichia offers many advantages, because it does not have the endotoxin problem associated with bacteria nor the viral contamination problem of proteins produced in animal cell culture. Furthermore, P. pastoris can utilize methanol as a carbon source in the absence of glucose. The P. pastoris expression system uses the methanol-induced alcohol oxidase (AOX1) promoter, which controls the gene that codes for the expression of alcohol oxidase, the enzyme which catalyzes the first step in the metabolism of methanol. This promoter has been characterized and incorporated into a series of P. pastoris expression vectors. Since the proteins produced in P. pastoris are typically folded correctly and secreted into the medium, the fermentation of genetically engineered P. pastoris provides an excellent alternative to E. coli expression systems. A number of proteins have been produced using this system, including tetanus toxin fragment, Bordatella pertussis pertactin, human serum albumin and lysozyme. (3 - 7).Minimizing Growth Limiting FactorsAnother advantage of Pichia pastoris is a prolific growth rate. Therefore, it would seem easy enough to culture it in a shake flask. This seeming advantage, however, can pose a host of problems, including pH control, oxygen limitation, nutrient limitation and temperature fluctuation. Researchers at New Brunswick Scientific (Edison, NJ) found that by switching from a shaker to a fermentor, protein production in Pichia could be increased by over 140% (3). The fermentor enables dissolved oxygen (DO) levels to be raised, not just by increasing agitation, but by increasing air flow, by supplementing the air s tream with pure oxygen, or by doing all three either in series or in parallel.Nutrient limitation can also be minimized, since fermentors can be run in fed-batch mode, where fresh media or growth limiting nutrients can be pumped into the vessel at a rate that is capable of replenishing the nutrients that are depleted. Shakers can only run in a batch mode, meaning that the growth of the cells is limited by the nutrients present in the medium at the time of inoculation. The fermentor’s fed-batch mode further enables methanol flow rates to be controlled to condition the cells to the presence of the methanol, as well as provide methanol at the proper rate to allow addition of just enough methanol for protein synthesis while preventing excess methanol addition which can cause toxicity.Researchers have found that optimum protein production in P. pastoris occurs at 30°C, and that all protein expression ceases at 32°C. However, high heat loads occur when P. pastoris is actively growing or expressing high levels of protein. In actively growing shake flask cultures, it is not uncommon for the temperature to increase 25°C if left uncontrolled. Therefore, it isimperative that all aspects of the fermentor, including temperature controller, heat exchanger, vessel and piping, must be designed to regulate temperature for optimum protein production. In addition to the fermentor’s internal controller, an external bioprocessing software (BioCommand®,New Brunswick Scientific) is routinely used to supervise the process, as well as to provide optimal nutrient feed rates, based on either the current status of the culture or to actuate pre-determined control scenarios.Fermentation ProtocolResearch was conducted in BioFlo® 3000 benchtop fermentors (New Brunswick Scientific) (Figure 1) with interchangeable, autoclavable vessels of 1.25 to 10 L working volume, as well as in a BioFlo 4500 fermentors with sterilizable-in-place vessels of 15 L and 20 L working volume, (New Brunswick Scientific). However, these procedures can be adapted to other size fermentors thereby making the protocols scalable. In the author’s laboratories, P. pastoris fermentations are run as multi-stage fed-batch processes with oxygen supplementation (Table 1). Here, oxygen is supplied automatically to meet the dissolved oxygen requirements for high-density cell growth.Method for a Typical CultureA frozen vial of 1 ml P. pastoris sample was inoculated into a 1 L shake flask with 150 mL Yeast Nitrogen Base (YNB)-glycerol medium. A variety of genetically engineered P. pastoris strains were used, many of which are slow growing on methanol (mut s) and engineered to produce proteins of interest. The culture was incubated at 30°C, 240 rpm, for 14 hours in anenvironmental incubator shaker (New Brunswick Scientific). The entire 150 mL volume of inoculum was transferred to a 3.3 L fermentor vessel (total volume) containing 1.5 L of basal salts medium (see media components, Table 2) plus 4.4 mL/L trace metal solution (4). The temperature was controlled at 30°C. The dissolved oxygen was set at 30% and pH is at 5.0. Ammonium hydroxide solution (30%) was used as the base solution to adjust the pH. After 20 hours of batch culture, the optical density (OD) reaches 42. The glycerol fed-batch process was then initiated. The feeding medium consisted of 50% glycerol and 12 mL/L of trace metal solution. The feed rate was 24 mL/L/h, which was adjusted automatically based on the DO reading. DO control was maintained by the proportional integral derivitive (PID) cascade controller, which changes the speed of agitation. Pure oxygen was automatically supplied to the fermentor to keep the DO level at the setpoint after the agitation speed reached the maximum allowable setpoint. After the growth phase, a half-hour carbon-source starvation period was established before the culture was switched to the production phase.The production phase (methanol feeding) was started after 43 hours of cell growth. The production feed medium consists of 100% methanol and 12 mL/L trace metal solution. Feeding rates were divided into three stages: 6 hr induction, 48 hr in a high-feed-rate stage and 44 hr in a low-feed-rate stage. The feeding rate of the induction stage was ramped from 1 to 10.9 mL/L/hr, which was controlled by the computer program. Feeding rates in the high and low rate stages were 15 and 2 mL/L/hr respectively. The total volume of feed was 2 L. During the fermentation, oxygen demand can be quite high and oxygen was added to the air stream automatically. (Figure 2)pH is usually adjusted to inhibit the activities of proteinases existing in the culture broth during the production phase. Furthermore, since a host strain that isprotease deficient was used, it was not necessary to change the pH level when culture was shifted from cell growth phase to production phase. It has been found that pH 5 is the optimal for cell metabolism and cell growth and that the oxygen consumption rate is higher at that pH. Using this protocol, optical densities of up to 630 can be obtained. Protein expression, of course, varies with the particular protein being expressed.Although not without problems related to its culture, P. pastoris culture protocols are scalable and have become a powerful tool for the production of commercially valuable proteins.More information on P. pastoris culture (expression vectors, protocols, etc.) can be obtained from Invitrogen, Inc., Carlsbad, CA and from Pichia Protocols published by Humana Press and edited by David R. Higgins and James M. CreggTIME STAGE MODE FEED SUBSTANCE* FEED RATE (Hrs) (ml/L/hr) 0-20Growth Batch None N.A.20-42.5Growth Fed-Batch50% Glycerol24**42.5-43Starvation Batch None N.A.43-49Induction Fed-Batch100% Methanol1-10.9***49-97Production Fed-Batch100% Methanol1597-141Production Fed-Batch100% Methanol2Table 1*All feed solutions contain 12 ml/L of a trace metals solution.**Feed rate adjusted based on dissolved oxygen levels via BioCommand®** *Linear ramp programmed via the “Time Profile” of BioCommand®Figure 1: BioFlo 3000 fermentor with supervisory control system.Figure 2: Pure oxygen supplementation profile of a P. pastoris culture showing the increasedoxygen requirement of the culture.Table 2:MEDIUM COMPONENTS AND FEED SOLUTIONSH3PO4 - 27 ml/LCaSO4. 2 H2O - 0.9 g/LK2SO4 - 18 g/LMgSO4. H2O -15 g/LKOH - 4.13 g/LTrace Metals Solution - 4.4 ml/LGlycerol - 40 g/LTrace Metals SolutionCupric sulfate . 5 H2O - 6.0 g/LSodium iodide - 0.08 g/LManganese sulfate . H2O - 3.0 g/LSodium molybdate - 0.2 g/LBoric acid - 0.02 g/LCobalt chloride - 0.5 g/LZinc chloride - 20 g/LFerrous sulfate . 7 H2O - 65.0 g/LBiotin - 0.2 g/LSulfuric acid - 5.0 mlWater - to 1.0 literFeed SolutionsGlycerol Feed Solution:50% glycerol with 12 ml/L trace metals solutionMethanol Feed Solution:100% glycerol with 12 ml/L trace metals solutionDr. Cino is Product Manager, New Brunswick Scientific, PO Box 4005, Edison, NJ 08818-4005. Phone 800-631-5417. Fax: 732-287-4222. Web: .E-mail: cino@. The author acknowledges Yinliang Chen, Jeffrey Krol, Victor Sterkin of New Brunswick ScientificReferences1. Cregg, J.M., J. F. Tschopp, C. Stillman, R. Siegel, M. Akong, W. S. Craig, R. G.Buckholz, L. R. Madden, P. A. Kellaris, G. R. Davis, B. L. Smiley, J. Cruze, R.Torregrossa, G. Velicelebi and G. P. Thill. 1987. High-level expression and efficient assembly of hepatitis B surface antigen in the methylotrophic yeast, Pichia pastoris. BIO /TECHNOLOGY, Vol 5, 479-4852. Brierley, R.A., C. Bussineau, R. Kosson, A. Melton and R. S. Siegel. 1992. inFermentation Development of Recombinant Pichia pastoris Expression the Heterologous Gene: Bovine Lysozyme, Annals New York Academy of Sciences, 350-3623. Chen, Y., Krol, J., Cino, J., Freedman, D., White, C., and Komives, E., 1996. ContinuousProduction of Thrombomodulin from a Pichia pastoris Fermentation . Journal Chem. Tech.Biotechnol. Vol. 67, 143-1484. Clare, J.J., F.B. Rayment, S.P. Ballantine, K. Sreekrishna and M.A.Romanos, 1991. High-level expression of tetanus toxin fragment C in Pichia pastoris strains containing multiple tandem integrations of the gene. BIO/TECHNOLOGY, Vol 9, 455-4605. Cregg, J.M., T.S. Vedvick and W.C. Raschke. 1993. Recent advances in the expressionof foreign genes in Pichia pastoris. BIO/TECHNOLOGY, Vol.11, 9056. Digan, M. E., S. V. Lair, R. A. Brierley, R. S. Siegel, M. E. Williams, S. B. Ellis, P. A.Kellaris, S. A. Provow, W. S. Craig, G. Velicelebi and M. M. Harpold. 1989.Continuous production of a novel lysozyme via secretion from the yeast, Pichia pastoris.Vol 7, 160-1647. Tschopp, J. F., G. Sverlow, R. Kosson, W. Craig and L. Grinna. 1987. High-levelsecretion of glycosylated invertase in the methylotrophic yeast, Pichia pastoris .BI0 /TECHNOLOGY, Vol 5, 1305Additional ReadingAgrawal, P., G. Koshy and M. Ramseier. 1989. An algorithm for operation a fed-batch fermentor at optimum specific-growth rate. Biotechnol. Bioeng., 33, 115-125Aiba, S., S. Nagai and Y. Nishizaqa. 1976. Fed-batch culture of Saccharomyces cerevisiae : a perspective of computer control to enhance the productivity in baker’s yeast cultivation. Biotechnol Bioeng., 18, 1001-1011Bentley, W. E. and D. S. Kompala. 1989. A novel structured kinetic modelingapproach for the analysis of plasmid instability in recombinant bacterial cultures. Biotechnol. Bioeng., 33, 49-61Komives, E. A. 1994. Expression of Highly disulfide Bonded Proteins in Pichiapastoris, Structure. 2,1003-1005Modak, J. M. and H. C. Lim. 1989. Simple nonsingular control approach to fed- batch fermentation optimization. Biotechnol. Bioeng., 33, 11-15Shimizu, N., S. Fukuzono, K. Fujimori, N. Nishimura and Y. Odawara. 1988. Fed-batch cultures of reconbinant Escherichia coli with inhibitory subtance concentration monitoring. J. Ferment. Technol., 66, 2, 187-191Wei, D., S. J. Paurulekar and W. A. Weigandin. 1990. Multivariable control of continuous and fed-batch bioreactors. Biotechnical Engineering VI, Ann.N.Y. Acad. Sci. Vol 589, 508-528Wu, W., K. Chen and H. Chiou. 1985. On-line optimal control for fed-batch culture of Baker’s yeast production. Biotechnol. Bioeng., 27, 756-760Yamane, T., T. Kume, E. Sada and T. Takamatsu. 1977. A simple optimization technique for fed-batch culture. J. Ferment. Technol., 55,587-593Yang, X. 1992. Optimization of a cultivation process for recombinant protein production by Escherichia coli. J. Biotechnol. 23, 271-289。

毕赤酵母表达(pichia pastoris expression )实验手册(3)

毕赤酵母表达（pichia pastoris expression ）实验手册（3）液体YPD培养基可常温保存；琼脂YPD平板在4℃可保存几个月。

加入Ze ocin 100ug / ml，成为YPDZ培养基，可以4℃条件下保存1～2周。

2.4 YPDS + Zeocin 培养基（Yeast Extract Peptone Dextrose Medi um）：yeast extract 1%peptone 2%dextrose (glucose) 2%sorbitol 1 M+agar 2%+ Zeocin 100 μg/ml不管是液体 YPDS培养基，还是YPDS + Zeocin 培养基，都必须存放4℃条件下，有效期1～2周。

2.5 MGYMinimal Glycerol Medium （最小甘油培养基）（34%YNB；1%甘油；4*10-5%生物素）。

将800ml灭菌水、100ml的 10* YNB母液、2ml的500*B母液和100ml的10*GY母液混匀即可，4℃保存，保存期为2个月。

2.6 MGYHMinimal Glycerol Medium + Histidine （最小甘油培养基 + 0.004%组氨酸）在1000ml的MGY培养基中加入 10ml的100*H母液混匀，4℃保存，保存期为2个月。

2.7 RDRegeneration Dextrose Medium （葡萄糖再生培养基）（含有：1mol/L的山梨醇；2%葡萄糖；1.34%YNB；4*10-5%生物素；0. 005%氨基酸）1. 将186g的山梨醇定容至700ml，高压灭菌；2. 冷却后于45℃水浴；3. 将100ml的10*D、100ml的10*YNB；2ml的500*B；10ml的100*AA等母液和88ml无菌水混匀，预热至45℃后，与步骤2 的山梨醇溶液混合。

4℃保存。

2.8 RDHRegeneration Dextrose Medium + Histidine （葡萄糖再生培养基 + 0.004%组氨酸）在RD培养基配制的第三步中，在加入10ml的100*H母液，同时无菌水的体积减少至78ml即可，其余配制方法与RD相同。

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毕赤酵母表达实验手册作者：Jnuxz 来源：丁香园时间：2007-9-5大肠杆菌表达系统最突出的优点是工艺简单、产量高、周期短、生产成本低。

然而，许多蛋白质在翻译后，需经过翻译后的修饰加工，如磷酸化、糖基化、酰胺化及蛋白酶水解等过程才能转化成活性形式。

大肠杆菌缺少上述加工机制，不适合用于表达结构复杂的蛋白质。

另外，蛋白质的活性还依赖于形成正确的二硫键并折叠成高级结构，在大肠杆菌中表达的蛋白质往往不能进行正确的折叠，是以包含体状态存在。

包含体的形成虽然简化了产物的纯化，但不利于产物的活性，为了得到有活性的蛋白，就需要进行变性溶解及复性等操作，这一过程比较繁琐，同时增加了成本。

大肠杆菌是用得最多、研究最成熟的基因工程表达系统，当前已商业化的基因工程产品大多是通过大肠杆菌表达的，其主要优点是成本低、产量高、易于操作。

但大肠杆菌是原核生物，不具有真核生物的基因表达调控机制和蛋白质的加工修饰能力，其产物往住形成没有活性的包涵体，需要经过变性、复性等处理，才能应用。

近年来，以酵母作为工程菌表达外源蛋白日益引起重视，原因是与大肠杆菌相比，酵母是低等真核生物，除了具有细胞生长快，易于培养，遗传操作简单等原核生物的特点外，又具有真核生物时表达的蛋白质进行正确加工，修饰，合理的空间折叠等功能，非常有利于真核基因的表达，能有效克服大肠杆菌系统缺乏蛋白翻译后加工、修饰的不足。

因此酵母表达系统受到越来越多的重视和利用。

［1］。

同时与大肠杆菌相比，作为单细胞真核生物的酵母菌具有比较完备的基因表达调控机制和对表达产物的加工修饰能力。

酿酒酵母（Saccharomyces.Cerevisiae）在分子遗传学方面被人们的认识最早，也是最先作为外源基因表达的酵母宿主。

1981年酿酒酵母表达了第一个外源基因----干扰素基因［2］，随后又有一系列外源基因在该系统得到表达［3、4、5、6］。

干扰素和胰岛素虽然已经利用酿酒酵母大量生产并被广泛应用，当利用酿酒酵母制备时，实验室的结果很令人鼓舞，但由实验室扩展到工业规模时，其产量迅速下降。

原因是培养基中维特质粒高拷贝数的选择压力消失［7、8］，质粒变得不稳定，拷贝数下降。

拷贝数是高效表达的必备因素，因此拷贝数下降，也直接导致外源基因表达量的下降。

同时，实验室用培养基成分复杂且昂贵，当采用工业规模能够接受的培养基时，导致了产量的下降［9］。

为克服酿酒酵母的局限，1983年美国Wegner等人最先发展了以甲基营养型酵母（methylotrophic yeast）为代表的第二代酵母表达系统［10］。

甲基营养型酵母包括：Pichia、Candida等．以Pichia.pastoris（毕赤巴斯德酵母）为宿主的外源基因表达系统近年来发展最为迅速，应用也最为广泛。

毕赤酵母系统的广泛应用，原因在于该系统除了具有一般酵母所具有的特点外，还有以下几个优点［1、9、11］；⑴具有醇氧化酶AOX1基因启动子，这是目前最强，调控机理最严格的启动子之一。

⑵表达质粒能在基因组的特定位点以单拷贝或多拷贝的形式稳定整合。

⑶菌株易于进行高密度发酵，外源蛋白表达量高。

⑷毕赤酵母中存在过氧化物酶体，表达的蛋白贮存其中，可免受蛋白酶的降解，而且减少对细胞的毒害作用。

Pichia.pastoris基因表达系统经过近十年发展，已基本成为较完善的外源基因表达系统，具有易于高密度发酵，表达基因稳定整合在宿主基因组中，能使产物有效分泌并适当糖基化，培养方便经济等特点。

利用强效可调控启动子AOX1，已高效表达了HBsAg、TNF、EGF、破伤风毒素C片段、基因工程抗体等多种外源基因［11、12、13］，证实该系统为高效、实用、简便，以提高表达量并保持产物生物学活性为突出特征的外源基因表达系统，而且非常适宜扩大为工业规模［14］。

目前美国FDA已能评价来自该系统的基因工程产品，最近来自该系统的Cephelon制剂已获得FDA批准，所以该系统被认为是安全的．Pichia.pastoris表达系统在生物工程领域将发挥越来越重要的作用，促进更多外源基因在该系统的高效表达，提供更为广泛的基因工程产品［9、11］。

近年来，Invitrogon公司开发了毕赤酵母表达系统的系列产品，短短几年已经有300多种外源蛋自在该系统得到有效表达，被认为是目前最有效的酵母表达系统。

毕赤酵母宿主菌常用的有GS115和KM71两种，都具有HIS4营养缺陷标记。

其中，GS115茵株具有AOX1基因，是Mut＋，即甲醇利用正常型；而KM71菌株的AOX1位点彼ARG4基因插入，表型为Muts，即甲醇利用缓慢型，两种菌株都适用于一般的酵母转化方法。

P ichia.pastoris酵母菌体内无天然质粒，所以表达载体需与宿主染色体发生同源重组，将外源基因表达框架整合于染色体中以实现外源基因的表达［15］，包括启动子、外源基因克隆位点、终止序列、筛选标记等。

表达载体都是穿梭质粒，先在大肠杆菌复制扩增，然后被导入宿主酵母细胞。

为使产物分泌胞外，表达载体还需带有信号肽序列。

毕赤酵母表达系统有多种分泌型表达质粒，有许多蛋白在毕赤酵母得到了高效分泌表达。

胞外表达需要在外源蛋白的N末端加上一段信号肽序列，引导重组蛋白进入分泌途径，可使蛋白蛋白质在分泌到胞外之后获得准确的构型。

毕赤酵母对外源蛋白自身的信号序列识别能力差，在本试验中所使用pPICZαA质粒，其信号肽来自酿酒酵母的α-交配因子（α-factor），能很好的达到以上的要求。

并且作为新一代的毕赤酵母分泌表达质粒，它还拥有一个特点是其具有Zeocin抗性标记基因，给我们筛选转化子的工作带来很大的便利［1、9］。

pPICZαA质粒是作为新一代的毕赤酵母分泌表达质粒，它的主要特点简介如下：⑴具有强效可调控启动子AOX1（alcohol oxidase，醇氧化酶）；⑵具有Zeocin抗性筛选标记基因，重组转化子可直接用Zeocin进行筛选，即在YPDZ平板上生长的转化子中，100％都有外源基因的整合，大大简化了重组转化酵母的筛选过程［15］。

在操作过程中，Zeocin也可用来筛选含表达载体pPICZαA的大肠杆菌转化子，不必另外使用Amp，经济而又简便；。

⑶在表达载体A0X1 5’端启动子序列下游，有供外源基因插入的多克隆位点，多克隆位点下游有A0X1 3’端终止序列；⑷分泌效率强的信号肽α-factor.Invitrogen公司开发的毕赤酵母表达系统的系列产品作为目前被应用为最为广泛的酵母表达系统，其主要的优点有：醇氧化酶可调控的强启动子，能高密度发酵，重组蛋白表达量高。

外源基因整合在酵母基因组上，可以稳定存在。

同时，高效分泌表达质粒能将外源蛋白表达后，进行翻译后加工处理，将外源蛋白分泌到细胞外，不但提高表达蛋白的活性，而且．有利于产物的纯化。

一．毕赤酵母表达常用溶液及缓冲液的配制1．1 各种母液的配制10*YNB （含有硫酸铵、无氨基酸的13.4%酵母基础氮源培养基）4℃保存。

34g酵母基础氮源培养基（无硫酸铵）+100g硫酸铵，溶于1000ml水中，过滤除菌。

500*B （0.02%生物素Biotin）4℃保存保存期为1年。

20mg的生物素溶于100ml 水中，过滤除菌。

100*H （0.4%Histidine 组氨酸）4℃保存保存期为1年。

400mg的L-组氨酸溶于100ml水中，（加热至50℃以促进溶解），过滤除菌。

10*D （20%Dextrose 葡萄糖）保存期为1年。

200g葡萄糖溶于1000ml水中，灭菌15min或过滤除菌。

10*M （5%Methanol 甲醇）保存期为2个月。

将5ml的甲醇与95ml水混匀，过滤除菌。

10*GY （10%Glycerol 甘油）保存期为1年以上。

将100ml甘油和900ml水混匀后，高压灭菌或过滤除菌。

100*AA （0.5% of each Amino Acid，各种氨基酸）4℃保存保存期为1年。

分别将500mg的L-谷氨酸、L-蛋氨酸、L-赖氨酸、L-亮氨酸和L-异亮氨酸溶于100ml水中，过滤除菌。

1M 磷酸钾溶液（potassium phosphate buffer，pH6.0），将1mol/L的K2HPO4溶液132ml与1mol/L的KH2PO4溶液868ml混匀，其pH为6.0，如需调节pH，则使用磷酸和氢氧化钾调节pH。

1.2 常用溶液及缓冲夜1.2.1 碱裂解法抽提质粒DNA所用溶液：溶液Ⅰ：50mmol / L glucose，100mmol / L EDTA，25mmol / L Tris－HCI (pH 8.0)溶液Ⅱ：0.2mol／L NaOH，1％SDS（临用时配制）溶液Ⅲ：29.44g KAc，11.5ml Acetic acid，加ddH2O至100 ml。

4℃保存。

1.2.2 10% 甘油（Glycerol）：将100ml甘油和900ml水混匀后，高压灭菌或过滤除菌。

保存期为1年以上。

1.2.3 Rnase-H2O：1ul Rnase 加入1ml 灭菌dd H2O。

4℃保存。

1.2.4 TE缓冲液：10mmol / Tris-CI（pH 8．0），lmmol / L EDTA（pH 8.0）1.2.5 STE缓冲液：0.1mol / L, 10mmol / L Tris-HCl (pH 8.0), 1mmol / L EDTA (pH 8.0)1.2.6 SCE缓冲液：1mol / L Sorbitol (山梨醇), 10mmol / L 柠檬酸钠，10mmol / L EDTA1.2.7 1M potassium phosphate buffer （pH 6.0）：132 ml 1M K2HPO4868 ml 1M KH2PO41.2.8 50X TAE 琼脂糖凝胶电泳缓冲液，pH 8.0（1L）：242 g Tris57.1 ml Acetic Acid37.2 g EDTA二．毕赤酵母表达的培养基配制［5］2.1 LB（Luria－Bertani）培养基：Trypton l％Yeast Extract 0.5％NaCl l％PH 7.0制作平板时加入2％琼脂粉。

121℃高压灭菌20min。

可于室温保存。

用于培养pPICZαA原核宿主菌TOP10F’时可加入Zeocin 25ug / ml。

2.2 LLB（Low Salt LB）培养基：Trypton l％Yeast Extract 0.5％NaCl 0.5％PH 7.0制作平板时加入2％琼脂粉。

121℃高压灭菌20min。

可于室温保存数月。

用于培养pPICZαA原核宿主菌TOP10F’时，加入Zeocin 25ug / ml，可以4℃条件下保存1～2周。