信号肽序列对毕赤酵母表达外源蛋白质的影响
基因的推理设计与改造—体外分子进化的捷径[1]
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的体外快速改造与进化 ( 遗 传 密 码 偏 爱 不 仅 可 以 用 在 基 因 设 计 改 造 上$ 而且可以 对 基 因 的 分 泌 调 控 序 列 进 行 改 造 ( 近 年 来$ 许多蛋白质在毕赤酵母中实现了高效表达 $ 但仍 然有多种的蛋白质表达量相对较低 ( 提高毕赤酵母 外源蛋白质的表达量是降低工业化生产成本的关键 因素之一 $ 为了进一 步 提 高 外 源 蛋 白 质 的 分 泌 表 达 水平 $ 我们按毕赤酵 母 的 偏 爱 密 码 合 成 了 酿 酒 酵 母 $ 并结合其 他调整 使得 表 的 $ 因子信号肽序列 . G * S 达量提 高 了 " 倍 $ 实现了分泌调控序列的快速改
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巴斯德毕赤酵母表达系统的特点及应用
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毕赤酵母表达系统简介
巴斯德毕赤酵母及启动子1.1 毕赤酵母表达系统简介随着蛋白异源表达的飞速发展，越来越多的表达系统被建立并得到应用。
酵母作为单细胞真核生物，因具有比较完备的基因表达调控机制和对表达产物的加工修饰能力，仍表现出不可比拟的优势。
以甲醇营养型酵母（Methylotrophic yeast）-毕赤酵母为代表的第二代酵母表达系统，是近年来被公认的最有效的外源蛋白表达系统之一，已有多种外源蛋白在该宿主系统中获得了成功表达[1]。
作为生产外源蛋白的重要宿主菌，依靠其各种不同功能的表达载体，已经得到广泛的应用。
表达的蛋白质包括酶、膜蛋白、抗原、抗体和调节蛋白等[2,3]。
毕赤酵母（Pichia pastoris）表达系统是近年来发展迅速、应用广泛的一种真表达系统。
它是甲醇营养型酵母菌，有两个乙醇氧化酶（alcohol oxidase，Aox）码基因AOX1和AOX2，两者序列相似，AOX1基因严格受甲醇诱导和调控。
当甲醇为唯一碳源时，AOX1启动子可被甲醇诱导，启动乙醇氧化酶的表达，从而用甲醇进行代谢[4]。
含AOX1启动子的质粒可用来促进编码外源蛋白的目的因的表达。
随着Invitrogen公司开发的一系列毕赤酵母表达试剂盒的应用，目前用该统已成功表达出了数以千计的来自细菌、真菌、原生动物、植物、无脊椎动物、包括人在内的脊椎动物以及病毒等的具有生物学功能的外源蛋白或蛋白结构[5,6]。
1.1.1 P.Pastoris表达载体及其元件由于毕赤酵母没有稳定的附加质粒，表达载体需与宿主染色体发生同源重组，外源基因表达框架整合于染色体中以实现外源基因的表达整合表达的优点在于保持外源基因稳定性并可产生多拷贝基因。
典型的毕赤氏酵母表达载体含有醇氧化酶基因的调控序列，主要的结构包括：5′AOX1启动子片段、多克隆位点(MCS)、转录终止和polyA形成基因序列(TT)、筛选标记(His4或Zeocin)、3′AOX1基因片段，作为一个能在大肠杆菌中繁殖扩增的穿梭质粒，它还有部分pBR322质粒或COLE1序列。
毕赤酵母表达系统在外源蛋白表达中的研究及应用
写一篇毕赤酵母表达系统在外源蛋白表达中的研究及应用的报
告，800字
毕赤酵母表达系统是一种高效、灵活的工具，可用于外源蛋白表达研究和应用。
它是一种重要的生物工程技术，可以实现外来基因的大规模表达，分子量可达到200 KD 以上。
目前，毕
赤酵母表达系统已成功地用于各类重要蛋白质的表达，并发挥了重要作用。
毕赤酵母表达系统的优势在于它能够表达复杂的蛋白质，而且不受细胞因子的限制，能够有效提高蛋白表达的效率。
此外，该系统还具有良好的原核性、容易稳定表达、灵活的改造等特点。
因此，毕赤酵母表达系统被广泛应用于外源蛋白表达和重组蛋白的研究中。
例如，已成功利用该系统彻底破解人工合成水稻Hsp70基因编码蛋白的结构，它同时也是人类在蛋白研
究中的有力工具。
毕赤酵母表达系统在医学研究中也得到了很大的发展。
比如，可以用毕赤酵母表达系统来研究和表达病毒血管瘤病毒(HPV)-695E5蛋白，而这种蛋白可能会加速病毒复制和细胞侵入，因
此有助于治疗HPV相关的癌症。
利用毕赤酵母表达系统还可
以大规模表达多肽，如α-肌动蛋白及其相关蛋白，从而探索
肌钙蛋白的生物学功能。
总的来说，毕赤酵母表达系统是一种重要的生物工程技术，它能够实现外来基因的大规模表达，受益于它的灵活性和稳定性，可以成功用于外源蛋白表达及其相关研究与应用中，是一项具有重大意义的研究。
毕赤酵母表达实务
高，特别是-3位的A对翻译效率非常重要。该序列被后人称为Kozak序列，并被应用
于表达载体的构建中。 所谓Kozak规则，即第一个AUG侧翼序列的碱基分布所满足的统计规律，若将第一 个AUG中的碱基A，U，G分别标为1，2，3位，则Kozak规则可描述如下： (1)第4位的偏好碱基为G； (2)AUG的5’端约15bp范围的侧翼序列内不含碱基T； (3)在-3，-6和-9位置，G是偏好碱基； (4)除-3，-6和-9位，在整个侧翼序列区，C是偏好碱基。 Kozak规则是基于已知数据的统计结果，不见得必须全部满足，一般来说，满足项 即可。真核引物设计需在AUG前加上GCCACC
Clone gene of interest into Pichia expression vector. 载体的选择
Clone gene of interest into Pichia expression vector. 重组载体构建策略
Strategies generally fall into three different categories: 1. Ligation of a compatible restriction fragment: a) Forced (directional) insertion involving the use of two different sites in the multiple cloning site (for pPIC3.5, pHIL-S1, or pPIC9 vectors). b) Ligation of the fragment with the same restriction end on both ends into a single, compatible site (e.g. EcoR I cloning in pHIL-D2). 2. PCR amplification of the fragment containing the gene of interest in such a way that compatible restriction ends are generated for ligation into the appropriate vector.
外源基因的表达及其优化策略
5’ TTGACA
17bp
TATAAT
转录起始位点
核糖体结合位点
三、原核生物基因表达的调控 1. 启动子 （1）启动子序列
原核启动子共有序列的功能
三、原核生物基因表达的调控 1. 启动子
（2）翻译的起始位点 a)核糖体结合位点（ ribosome binding site ,RBS）
Shine-Dalgarno（SD） sequence： mRNA上与核糖体 16sRNA结合的序列。
四、常用大肠杆菌表达载体 3.融合蛋白表达载体系统 pGEX系列 lacI
tac lacP lac O S-D/ATG GST 插入位点 TGA
产物提纯: GST融合蛋白用Glutathione Sepharose亲和层析柱 分离纯化。
四、常用大肠杆菌表达载体 3.融合蛋白表达载体系统 pGEX系列
段DNA)内类似于终止子结构的一段DNA序列
3.对DNA结构的影响 1)核基质结合区 ：造成一种分割作用，使每个转录单元保持相对的独立性 2)绝缘子 ：阻止临近调控元件，对所界定基因的启动子起增强或者阻遏的作用 3)基因座控制区：以组织特异性及拷贝数依赖的方式将相关基因的表达增强到
生理学水平的异位染色质位点
S-D序列距离AUG的距离也影响翻译
b)起始密码：位于SD序列下游 AUG（91%）、GUG（8%）、UUG（1%）
三、原核生物基因表达的调控 2.RNA多聚酶 大肠杆菌只有一种类型的RNA多聚酶转录tRNA，
rRNA和mRNA。
三、原核生物基因表达的调控 3. 转录终止子
在表达载体克隆位点的下游一般设计一段转录终止子。
rrnB T
四、常用大肠杆菌表达载体 1. 非融合型表达载体 pKK223-3 载体：
巴斯德毕赤酵母PEP4基因的剔除及对基因工程菌外源蛋白质表达的影响
巴斯德毕赤酵母PEP4基因的剔除及对基因工程菌外源蛋白
质表达的影响
杨扬;赵健;石军
【期刊名称】《食品与药品》
【年(卷),期】2007(009)004
【摘要】目的构建蛋白酶缺失菌株,提高外源蛋白质表达的分泌率与产量.方法构建质粒pRS306/PEP4 L&R,利用基因重组原理剔除巴斯德毕赤酵母中的PEP4基因.比较基因剔除前后外源蛋白质表达量的差异.结果剔除毕赤酵母中的PEP4基因后外源蛋白质表达量平均提高9.5%.结论剔除毕赤酵母中的PEP4基因可有效地控制外源蛋白质MIP表达时的降解.
【总页数】4页(P10-13)
【作者】杨扬;赵健;石军
【作者单位】华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室,上海,200237;华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室,上海,200237;上海生命科学院模式生物,中心,上海,200031
【正文语种】中文
【中图分类】Q784
【相关文献】
1.巴斯德毕赤酵母PEP4基因的剔除及对基因工程菌外源蛋白质表达的影响 [J], 杨扬;赵健;石军
2.影响外源基因在巴斯德毕赤酵母表达的因素 [J], 蔡尽忠
3.巴斯德毕赤酵母表达系统在外源基因表达中的研究进展 [J], 罗竞红;游自立
4.外源基因在巴斯德毕赤酵母中多拷贝整合的研究进展 [J], 谢涛;王红宁
5.巴斯德毕赤酵母基因组外源基因整合数的高通量定量分析 [J], 吴丽娟;蒋建新;朱佩芳;康格非
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毕赤酵母对甲醇胁迫的响应及其对蛋白表达的影响
ｇｙ，Ｇｕｉｙａｎｇ，Ｇｕｉｚｈｏｕ ５５００００）
迫，例如代谢产物、不适温度、ｐＨ 和离子强度等胁迫，这些胁
迫可能会显著影响细胞的生理特性，包括蛋白合成和分泌表
达能力，该问题已经受到越来越多的科研工作者的关注。 毕
赤酵母是甲基营养型酵母，能以甲醇作为唯一碳源和能源，
同时，甲醇也是诱导毕赤酵母外源蛋白表达最常用的诱导
物，但甲醇本身对宿主也会产生胁迫效应。 因此，若要获得
物饥饿等［２０］ 都会激发此通路。 ＵＰＲ 下游靶基因功能涵盖大
在细胞质中被甲醛脱氢酶（ ＦＬＤ１） 催化为甲酸，接着被甲酸
等，对细胞生理特性影响也十分广泛，有些效应并不与蛋白
被醇氧化酶（ＡＯＸ１ 和 ＡＯＸ２）转化为甲醛和过氧化氢。 甲醛
脱氢酶转化为二氧化碳和水，并释放能量；或是甲醛在二羟
丙酮合成酶（ＤＡＳ１）作用下与 ５－磷酸木酮糖合成 ３－磷酸甘
Ｌｉ 等［１５］ 研究发现，在甲醇诱导阶段，毕赤酵母能量代谢途径
普遍下调。
２．３ 诱发氧化胁迫响应（ｏｘｉｄａｔｉｖｅ ｓｔｒｅｓｓ ｒｅｓｐｏｎｓｅ） 毕赤酵
母需要提高过氧化物酶水平来抵御甲醇的毒害作用［１６］ 。 在
部分新生肽合成、折叠、翻译后修饰、运输途径和 ＥＲＡＤ 途径
表达有直接的关联。
ｃｈａｉｎ Ｆｖ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｆｒａｇｍｅｎｔ） ［１０］ 均 能 获 得 理 想 的 表 达 水 平。
Ｖａｎｚ 等［１１］ 报道，诱导表达乙肝表面抗原（ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ ｓｕｒｆａｃｅ
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ISSN058229879生物化学与生物物理学报ACTABIOCHIMICAetBIOPHYSICASINICA2003,35(2):154-160CN3121300/Q收稿日期:2002208221 接受日期:2002210216
上海市科委重大项目(No.993913002)和上海永业农科生物工程公司资助3联系人:Tel,021262205704;Fax,021262209988;e2mail,
yaoquanhong@yahoo.com
信号肽序列对毕赤酵母表达外源蛋白质的影响熊爱生 彭日荷 李 贤 范惠琴 姚泉洪3 郭美锦1 张嗣良1(上海市农业科学院生物技术研究中心、上海市农业遗传育种重点实验室,上海
201106;
1华东理工大学生物工程学院,上海200237
)
摘要 乙醇氧化酶启动子被分离、克隆,并建立了转化方法后,毕赤酵母已被发展成为一种高效的外源蛋白表达宿主。为了进一步提高外源蛋白质的分泌表达,对信号肽序列进行了研究。首先按毕赤酵母的偏爱密码合成了酿酒酵母的α因子信号肽序列MF4I,随后在MF4I信号肽序列的N端分别引入1～10个毕赤酵母Aox1蛋白质的N
端氨基酸,构成10种不同的分泌信号肽序列,10种不同的分泌信号肽序列被用于植酸酶基因的毕赤酵母分泌表达。以上新的信号肽序列都可使植酸酶的分泌表达量增加,而以N端增加A、I、P三个氨基酸的信号肽序列引起的提高最大;和野生型的酿酒酵母α因子信号肽序列相比,使植酸酶分泌表达量增加5倍,摇瓶中植酸酶的分泌表达量为90mg/L。此外在MF4I信号肽的引导序列和内切蛋白酶间增加了EEAEAEAEP和K共10个氨基酸,
进一步提高信号肽的分泌效率,使表达又提高约35%,使得摇瓶中酸性植酸酶的表达量达到120mg/L,是pPCI9K
表达量的8倍。
关键词 毕赤酵母;信号肽序列;表达载体;高效表达 毕赤酵母(Pichiapastoris)系统是近年来发展很快的一个真核表达系统,许多有活性的蛋白质已经在毕赤酵母系统中大量表达。毕赤酵母在缺乏抑制性碳源如葡萄糖、甘油时,能以甲醇为唯一碳源生长。毕赤酵母表达系统是真核表达系统,可以对表达的蛋白质进行加工折叠和修饰,还具有发酵方法成熟、发酵密度高、培养简单廉价、外源蛋白质既可以胞内积累又可分泌;表达产量高、背景蛋白质少、易于表达产物纯化等优点。 近年来,许多蛋白质在毕赤酵母中实现了高效表达,达到了克级水平,部分达到了十几克的高表达[1,2];但仍然有多种的蛋白质表达量相对较低[3,4]。提高毕赤酵母外源蛋白质的表达量是降低工业化生产成本的关键。 在菌株、培养条件、发酵等逐渐成熟的情况下,构建高表达的载体是提高外源基因表达量的一个关键因素。mRNA5′端非翻译区(5′2UTR)的核苷酸序列和长度影响外源基因的表达。一个适当长度的5′非翻译区可极大地促进mRNA有效地翻译。维持外源基因mRNA5′2UTR尽可能和Aox1mRNA的5′2UTR的相似是必需的。通过人血清白蛋白(HAS)和Aox1mRNA的5′2UTR一致,使HSA基因的表达量提高了50倍[5]。酿酒酵母α交配因子(MFα)信号肽在酵母表达外源蛋白质中广泛使用[6～9],研究显
示在MFα中间插入EEAEAEAEPK共10个氨基酸的新信号肽序列可使胰岛素在毕赤酵母中的分泌效率提高了2倍以上[10]。偏爱密码子的使用能够较大幅度提高植酸酶基因的表达水平[11]。Aox1启动子能够高效启动Aox1基因在毕赤酵母中的表达,
在信号肽的起始密码子ATG后增加Aox1基因ATG
后的氨基酸序列能够提高目的蛋白质的表达量。 本文研究了信号肽序列调整对外源蛋白质在毕赤酵母系统中表达的影响。通过连续延伸PCR技术[12,13]按酵母偏爱设计并合成了信号肽序列,研究了各种调整对表达的影响。
1 材料和方法(MaterialsandMethods)1.1 材料1.1.1 菌株与质粒 毕赤酵母菌株[Pichiapas
2
toris(His2Mut+)]购自美国种质保藏中心(ATCC)。
大肠杆菌菌株E.coliDH5α、质粒pBluescriptSK等为Promega公司产品。质粒pPIC9K为Invitrogen公司产品。1.1.2 试剂耗材 PCR引物由上海生工公司合成,限制性内切酶、T4连接酶和PyrobestDNA聚合酶为TaKaRa公司产品。DNA测序试剂盒购于Phar2macia公司。G418、脱糖基化试剂EndoH、植酸酶检测试剂(植酸钾钠、钼酸胺、偏钒酸胺)以及植酸酶纯品购自Sigma公司,其他化学试剂均为国产AR级。1.2 方法1.2.1 信号肽序列的化学合成 根据GenBank(Z46233)[14]的信号肽序列和Aox1基因[15]的氨基酸序列,按照酵母偏爱密码[16],设计合成引物。引物从两端开始设计,5′端到中间为正向引物,3′端到中间为反向引物。两条引物之间存在20～25bp的重叠序列(表1)。基因合成采取连续延伸PCR方法进行[12,13](图1)。1.2.2 DNA操作 基因工程操作根据文献[17]进行。制备的双链质粒DNA在ABI377型DNA自动化测序仪上进行序列测定。测序工作在上海市农业科学院生物技术研究中心植物基因工程研究室完成。1.2.3 酵母各表达载体构建 分别将修饰过的信号肽序列,用HindIII和XhoI双酶切,定向插入表达酸性植酸酶的酵母表达载体中[18],构建不同信号肽的酸性植酸酶重组质粒。1.2.4 酵母的电击转化及筛选 将活化的毕赤酵母于500mLYPD(20g/L蛋白胨、10g/L酵母提取物、20g/L葡糖糖)中30℃培养18h,至A值达到1.7,5000r/min离心收集菌体,先后用500mL、250mL预冷的无菌水洗菌体,离心去上清液,用20mL预冷的1mol/L山梨醇悬浮菌体。离心后菌体再用0.5mL预冷的山梨醇悬浮,用于电击。大量抽提酵母表达质粒,BglII酶切回收小片段,取2μg线性化片段加入50μL感受态细胞,冰浴5min,用Bio2RedGenePulser电击仪电击,参数为2.5kV,25μF。电击结束后,立即加入1.0mL预冷的1.0mol/L山梨醇,取200μL涂布于固体选择培养基平板[186g/L山梨醇、20g/L葡萄糖、13.4g/L酵母氮源基础培养基(YNB)、0.05g/L谷氨酸、0.05g/L甲硫氨酸、0.05g/L赖氨酸、0.05g/L亮氨酸、0.05g/L异亮氨酸、20g/L琼脂糖],30℃培养直至转化子出现。用牙签将转化子对应点种到MM(13.4g/LYNB、0.4mg/L生物素、5g/L甲醇、15g/L琼脂糖)和MD(13.4g/LYNB、0.4mg/L生物素、20g/L葡萄糖、15g/L琼脂糖)平板上,30℃培养2天,在MD上生长正常而在MM上生长不正常或不生长的转化子为阳性克隆。将阳性克隆分别对应划线于MD和G418浓度为0.5
μ
g/LMD平板上进行单拷贝的筛选。含G418
MD平板上不生长,MD平板上生长的为表达单元单拷贝的克隆[19]。1.2.5 重组酵母的培养及诱导表达 将重组酵母接种于20mLBMGY(10g/L酵母提取物、20g/L
蛋白胨、13.4g/LYNB、0.4mg/L生物素、10g/L
甘油),30℃培养,离心收集菌体,加入20mL诱导培养基BMMY(用0.5%甲醇代替BMGY中的甘油),30℃下继续诱导培养36h。1.2.6 高表达菌株筛选及SDS2PAGE电泳分析 将所有的阳性克隆分别单独接种到试管中,30℃培养至A值达到3左右,再利用0.5%甲醇诱导培养36h。每个诱导菌株取5μL上清液进行SDS2PAGE并且结合植酸酶活性测定筛选高表达菌株。分别将各构建的高表达菌株接种到三角瓶中,30℃培养至A值达到4～5,再利用甲醇诱导培养36h。每个诱导菌株取10μL上清液进行SDS2PAGE检测,
分析蛋白质的表达量。酸性植酸酶在毕赤酵母中表达时,糖基化程度较高[20],蛋白质电泳条带较为复杂。含约100μ
g酸
性植酸酶蛋白的发酵上清液中加入3000u的EndoH
进行脱糖基化处理,37℃水浴5h,进行SDS2PAGE
电泳[21]。 以植酸钾钠为底物进行酶活性测定。植酸酶酶活性测定方法采取钼黄法[22]。植酸酶酶活性单位(u)定义为:在37℃下,每分钟分解植酸盐释放出
1nmol/L无机磷酸所需要的酶量为1u。
2 结果(Results)2.1 不同信号肽序列的合成与序列测定 通过图1所示连续延伸PCR,利用表1的引物,
再利用高保真的PyrobestDNA聚合酶合成了15条信号肽序列,分别编号为:XHT1、XHT2、XHT3、XHT4、XHT5、XHT6、XHT7、XHT8、XHT9、XHT10、XHT11、XHT12、XHT13、XHT14和XHT15(表2)。
XHT1消除了ATG密码子前的BamHI酶切位点(GGATCC),使得启动子与信号肽序列间直接相连,
没有使用酵母偏爱密码(notuse2biascodon),该调整对表达有促进作用。XHT2～15
551Feb.,2003熊爱生等:信号肽序列对毕赤酵母表达外源蛋白质的影响