酵母表达外源蛋白(foreign protein)(1)
毕赤酵母中高效引导外源蛋白分泌的信号肽的研究
毕赤酵母中高效引导外源蛋白分泌的信号肽的探究毕赤酵母被广泛应用于外源蛋白的表达和分泌，但其分泌机制依旧存在瓶颈。
信号肽作为外源蛋白分泌的关键信号，可以增进蛋白的正确折叠和定位。
本探究合成了多个信号肽并测试了其诱导外源蛋白分泌的效果。
结果显示，其中一个信号肽在毕赤酵母中具有高效的引导外源蛋白分泌的作用，并可提高外源蛋白的表达量。
这一探究为毕赤酵母外源蛋白分泌的机制探究和工业应用提供了新思路。
关键词：毕赤酵母、信号肽、外源蛋白分泌、表达、折叠定位正文：引言毕赤酵母是一种广泛应用于外源蛋白表达和分泌的真菌，其工业用途广泛，包括生产酶、生物肥料、食品添加剂等。
外源蛋白的表达和分泌是毕赤酵母应用的基础，因此其分泌机制的探究具有重要的理论和应用价值。
信号肽被认为是蛋白在细胞内穿过细胞膜从而被分泌到细胞外所必需的关键信号。
近年来，通过信号肽的调控已经在多种真菌中实现了外源蛋白的高效表达和分泌。
因此，寻找高效的信号肽，探究其引导外源蛋白分泌的机制，具有重要的应用前景。
材料和方法合成了11种可能具有对毕赤酵母分泌效果的信号肽，并转化到毕赤酵母中。
以GFP作为模型蛋白，不同信号肽在GFP表达和分泌过程中的诱导效果进行比较。
同时，测定了其中一个信号肽对外源蛋白表达量和分泌量的影响，并通过Western blot分析外源蛋白的分泌效果和分泌途径分析来探究信号肽的作用机制。
结果在11种信号肽中，有一个信号肽（称为SgPEP1）能够显著增加GFP的分泌效率，同时提高了外源蛋白的表达量。
Western blot和分泌途径分析显示，SgPEP1作用于胞内和胞外蛋白的定位和折叠，增进蛋白正确地进入胞外。
谈论本探究中发现的SgPEP1信号肽在毕赤酵母外源蛋白表达和分泌中具有高效的引导作用，这为改善毕赤酵母的表达和分泌效率提供了新思路。
在信号肽的机理探究中，需要进一步探究其在外源蛋白折叠中的作用方向和机制，以便更好地控制蛋白的定向和拓扑。
外源基因在酵母体系中表达
C.albicans hyphal n.r cell wall Ag
Spinach
2
phosphoribulokinase
S/Mut+ Halaas, et al (1995)
Shiba, et al (1995)
S/Mut+
S/Mut+, S/MutS( 30,000 copies/c ell) S/MutS
fragment C
Pertusis
3
antigen P69
Mouse EGF 0.45
Aprotinin 0.8
Kunitz
1
protease
inhibitor (A-
beta-PP)
Human
4
serum
albumin(HS
A)
HIV-1
1.25
gp120
and
0.02
I/Mut+ and Muts I/Muts S/Muts S/Mut+/Muts S/Mut+
第一代酵母基因工程表达系统是以酿酒酵 母表达系统为典型代表。
第二代酵母基因工程表达系统的典型代表 就是近年来倍受关注的毕赤酵母表达系统 等为代表的甲醇酵母表达系统：
1987年Cregg等首次报道甲醇营养型毕 赤酵母(Methy1otrophic Pichia pastoris)表达 外源蛋白以来，由于它具有表达效率高， 遗传稳定，产物可分泌表达等优点，己成 为近年来极受青睐的真核基因表达系统。
S:284
ds Fv (di-sulfide-bonded n.r S/n.r Luo, et al (1995), J.
single chain antibodies) n.r
酵母表达(1)
酵母表达引言酵母是一类单细胞真核生物，被广泛应用于生物学研究中。
酵母表达系统是指利用酵母细胞表达外源基因的技术，被广泛应用于蛋白质的高效表达和产量大规模生产。
本文将介绍酵母表达系统的原理、优势和应用。
原理酵母表达系统的核心原理是将外源基因导入酵母细胞，并通过酵母细胞的转录、翻译和修饰机制，使外源基因在酵母细胞中得到表达和功能发挥。
通常情况下，酵母表达系统主要采用酵母菌属的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)或毕赤酵母(Pichia pastoris)作为宿主细胞。
1.酵母转录机制：酵母细胞的基因表达主要通过RNA聚合酶Ⅱ进行转录，产生mRNA分子。
2.酵母翻译机制：酵母细胞通过核糖体进行翻译，将mRNA翻译成蛋白质。
3.酵母修饰机制：酵母细胞具有多种修饰酶，可以对蛋白质进行翻译后修饰，如糖基化、磷酸化等。
优势相比其他常用的表达系统，酵母表达系统具有一系列的优势：1.高效表达能力：酵母表达系统能够实现高水平的外源基因表达，产量可达到克级。
2.翻译后修饰：酵母细胞具有多种修饰酶，可以对蛋白质进行翻译后修饰，使蛋白质得到正确的糖基化等修饰。
3.生长条件简单：酵母菌生长条件相对简单，可以在常规培养基中进行培养，对培养条件的要求相对较低。
4.可溶性蛋白质表达：酵母细胞具有较强的蛋白质折叠和修饰能力，能够高效地表达可溶性蛋白质。
应用酵母表达系统广泛应用于以下领域：1.蛋白质研究：酵母表达系统可用于大规模蛋白质表达和纯化，为蛋白质的结构、功能和相互作用研究提供了高效的工具。
2.药物筛选：酵母表达系统可用于药物靶点鉴定和药物分子筛选，加速药物研发过程。
3.疫苗研究：酵母表达系统可用于疫苗候选抗原的高效表达和产量大规模生产。
4.代谢工程：酵母表达系统可用于代谢工程领域，利用酵母细胞对外源代谢产物的高效合成能力，实现产生复杂化合物的目标。
5.生物制药：酵母表达系统已经被广泛应用于生物制药领域，用于生产重组蛋白和抗体等生物药物。
乳酸克鲁维酵母表达外源蛋白研究进展
生物技术通讯 ＬＥＴＴＥＲＳ ＩＮ ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ Ｖｏｌ．１８ Ｎｏ．６ Ｎｏｖ．， ２００７
影响乳酸克鲁维酵母表达的前提下， 几乎抑制了在细菌体内的 表达。这样， 此突变体就可以表达通常在野生 ＬＡＣ４ 启动子下不 能表达的一些蛋白， 如牛肠激酶、鼠甲状腺激素结合蛋白等。
在酵母和动物细胞中， 为达到最优基因表达， 发现转录起始 码 ＡＴＧ 周 围 的 核 苷 酸 序 列 是 重 要 的 ， 如 Ｋｏｚａｋ［１３］广 泛 研 究 了 在 ＣＯＳ 细胞中这些区域对表达胰岛素的影响。同样， 酵母在高表达 外源蛋白时， 常被发现 ＡＴＧ 周围存在一些特定核苷酸， 这表明了 这些核苷酸对表达这些基因的重要作用。 ２．４ 附加型和整合型载体
Ｇ４１８、零 霉 素 （ Ｚｅｏｃｉｎ）、卡 那 霉 素 等 抗 生 素 也 已 成 为 应 用 于 乳酸克鲁维酵母的筛选标记。另外还有氮源选择方法， 如基于构 巢 曲 霉 （ Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ） 乙 酰 胺 酶 （ 由 ａｍｄＳ 基 因 编 码 ） 的 选 择标记， 能够将乙酰胺降解成氨。因为乳酸克鲁维酵母没有能力 利用乙酰胺， 只有从载体上获得乙酰胺基因而过表达乙酰胺酶 的转化细胞才能在以乙酰胺为惟一氮源的琼脂培养基上生长。 这种方法已被成功运用于乳酸克鲁维酵母 ＧＧ７９９ 菌株， 用来表 达牛肠激酶、麦芽糖结合蛋白、卵清蛋白、纤 维 素 酶 、鼠 甲 状 腺 激 素结合蛋白， 而且都是应用所提供的商业化整合型表达载体 ｐＫＬＡＣ１［１０］来 完 成 的 。 ２．３ 启动子
通常应用于酿酒酵母的营养缺陷型标记， 如 ｕｒａ３、ｌｅｕ２、ｔｒｐ１， 也被逐渐用于乳酸克鲁维酵母的分子遗传操作中。但营养缺陷 型标记应用于工业生产还存在一定的不足， 因为许多工业性生 产菌株已经通过遗传突变提高了分泌蛋白的能力， 这些菌往往 已是二倍体或者非整倍体， 或者在染色体某区段进行了修改。已 有报道认为， 用营养缺陷型菌株生产异源蛋白是不利的， Ｇｏｒｇｅｎｓ 等［８］在酿酒酵母中发现， 异源的木聚糖酶在 营 养 缺 陷 型 菌 株 中 的 分泌严重降低， 虽然这种不足可以通过在培养基中添加相应氨 基酸等养分来克服， 但采取补救措施后的菌株生长速度依旧缓 慢。在 ＵＲＡ３ 营养缺陷型乳酸克鲁维酵母菌中， 即使添加外源尿 嘧 啶 ， 其 表 达 的 牛 肠 激 酶 的 量 还 是 降 低 至 １ ／１０［９］， 原 因 可 能 是 细 胞已经因为分泌外源蛋白增加了压力， 又进一步因为合成或运 输外源氨基酸而负重。
外源蛋白表达失败或不表达的原因和解决方法
外源蛋白表达失败或不表达的原因和解决方法外源蛋白表达的定义和意义外源蛋白表达是指在一个生物体（如细菌、酵母、昆虫、哺乳动物等）中表达另一个生物体（如植物、动物、病毒等）的蛋白质的技术，它是生物技术的重要手段和工具。
外源蛋白表达可以用于研究蛋白质的结构和功能，开发新型的药物和疫苗，生产工业用途的酶和激素等。
外源蛋白表达失败或不表达的原因外源蛋白表达失败或不表达的原因很多，可以分为上游和下游两类。
上游原因上游原因是指与外源基因本身特性或重组蛋白细胞毒性等相关的原因，它们只能通过上游的合理设计来解决。
上游原因包括以下几种：•外源基因与宿主细胞的密码子用法不匹配，导致翻译效率低或错误。
•外源基因含有宿主细胞不能识别或不能正确加工的信号序列，导致转运或定位异常。
•外源基因含有宿主细胞不能识别或不能正确剪切的内含子，导致转录或翻译中断。
•外源基因含有宿主细胞不能识别或不能正确修饰的位点，导致糖基化、磷酸化等后期修饰缺失或异常。
•外源基因含有宿主细胞不能兼容或不能稳定保存的序列，导致重组质粒不稳定或降解。
•重组蛋白对宿主细胞产生毒性或抑制作用，导致细胞生长受阻或死亡。
下游原因下游原因是指与下游的操作不当或失误等相关的原因，它们可以通过下游的规范操作和优化条件来避免。
下游原因包括以下几种：•重组菌甘油管保存时间过长，导致质粒丢失或突变。
•诱导剂加错或用量不当，导致重组蛋白表达水平低或无法诱导。
•表达条件选择不合适，导致重组蛋白表达效率低或形成包涵体。
•蛋白纯化步骤操作不规范，导致重组蛋白损失或污染。
•SDS-PAGE或WB检测操作不当或试剂失效，导致重组蛋白检测失败或假阴性。
外源蛋白表达失败或不表达的解决方法外源蛋白表达失败或不表达的解决方法需要根据具体的原因和情况进行选择和调整。
一般来说，可以从以下几个方面进行优化：•优化外源基因的设计，使其与宿主细胞的密码子用法、信号序列、内含子、修饰位点等相匹配或适应，或者使用人工合成的优化基因。
酵母表达系统在植物功能基因组学研究中应用的局限性
植物生理学通讯 第４２卷 第６期，２００６年１２月1168酵母表达系统在植物功能基因组学研究中应用的局限性潘维锋 李师鹏＊山东师范大学生命科学学院，济南２５００１４Yeast, a Model System to Elucidate Plant Gene Function: Application and Limi-tationPAN Wei-Feng, LI Shi-Peng *College of Life Sciences, Shandong Normal University, Jinan 250014, China提要 介绍了酵母表达体系在植物的功能基因组学研究中的应用，并对这一实验手段应用的局限性进行了分析，以期提醒研究者应全面理解采用这一体系所获得的实验数据，确保据此而作出的结论全面、可靠。
关键词 酵母；拟南芥；基因组学；酵母功能互补；功能基因组学随着ＤＮＡ测序技术的不断完善，基因测序变得越来越经济、有效、可靠。
到２００６年６月为止已经完成包括酵母、人类、拟南芥在内的２１个真核生物基因组测序，另外还有１２６个真核生物基因组计划正在进行中（数据来源于ＮＣＢＩ数据库）。
这些前沿性工作导致了大量新基因的发现，为人们在基因组水平上研究生物的生长和发育等生命现象打下了基础。
单倍体啤酒酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）是１９９７年完成全基因组测序的，这是第一个完成的全基因组测序的真核生物。
整个酵母基因组包括约６ ２００个不含内含子的基因。
其中很多基因的功能已得到较为深入的研究，有关信息可以通过互联网在酵母基因组数据库中查到，如斯坦福大学的ＳＧＤ （Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ＧｅｎｏｍｅＤａｔａｂａｓｅ）数据库。
迄今，整个酵母的９５％以上的基因序列被系统敲除，不同的单基因敲除突变体可以从Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司ＡＴＣＣ （Ａｍｅｒｉｃａｎ ＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）或ＥＵＲＯＳＣＡＲＦ （Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｓａｃ－ｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ Ａｒｃｈｉｖｅｓ ｆｏｒ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ）获得。
基因工程-外源基因在酵母菌中的表达
基因工程刘夫锋2019.11.27基因工程5 2 3 4 1 6789重组DNA 技术与基因工程的基本概念重组DNA技术与基因工程的基本原理重组DNA技术所需的基本条件重组DNA技术的操作过程目的基因的克隆与基因文库的构建外源基因在大肠杆菌中的表达外源基因在酵母菌中的表达外源基因在哺乳动物细胞中的表达外源基因表达产物的分离纯化7.1酵母菌作为表达外源基因受体菌的特征7 外源基因在酵母菌中的表达酵母菌的分类学特征酵母菌（Yeast ）是一群以芽殖或裂殖方式进行无性繁殖的单细胞真核生物，分属于子囊菌纲（子囊酵母菌）、担子菌纲（担子酵母菌）、半知菌类（半知酵母菌），共由56个属和500多个种组成。
如果说大肠杆菌是外源基因最成熟的原核生物表达系统，则酵母菌是最成熟的真核生物表达系统。
7.1 酵母菌作为表达外源基因受体菌的特征7 外源基因在酵母菌中的表达酵母菌表达外源基因的优势全基因组测序，基因表达调控机理比较清楚，遗传操作相对简单能将外源基因表达产物分泌至培养基中具有原核细菌无法比拟的真核蛋白翻译后加工系统大规模发酵历史悠久、技术成熟、工艺简单、成本低廉不含有特异性的病毒、不产内毒素，美国FDA 认定为安全的基因工程受体系统，食品工业有数百年历史酵母菌是最简单的真核模式生物7.2 酵母菌的宿主系统7 外源基因在酵母菌中的表达7.2.2提高重组蛋白表达产率的突变宿主菌7.2.3 抑制超糖基化作用的突变宿主菌7.2.4 减少泛素依赖型蛋白降解作用的突变宿主菌7.2.1 广泛用于外源基因表达的酵母宿主菌7.2.1 广泛用于外源基因表达的酵母宿主菌目前已广泛用于外源基因表达和研究的酵母菌包括：酵母属如酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae ）克鲁维酵母属如乳酸克鲁维酵母（Kluyveromyces lactis ）毕赤酵母属如巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris ）裂殖酵母属如非洲酒裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe ）汉逊酵母属如多态汉逊酵母（Hansenula polymorpha ）裂殖酵母属如粟酒裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe ）如解脂耶氏酵母（耶氏酵母属Yarrowia lipolytica ）如腺嘌呤阿氏酵母（阿氏酵母属Arxula adeninivorans ）其中芽殖型酿酒酵母的遗传学和分子生物学研究最为详尽。
酵母表达系统
•巴斯德毕赤酵母 它是一种甲醇营养菌，甲醇可诱导与甲醇代谢相关酶基 因的高效表达，如乙醇氧化酶基因（AOX1）的表达产物可 在细胞中高水平积累。 AOX1的启动子是一种可诱导的强启
动子。以AOX1为启动子，选择AOX1基因缺失的突变株作为
受体细胞，可高效表达外源基因。 在毕赤酵母中得到表达的重组异源蛋白有乙型肝炎表面 抗原、人肿瘤坏死因子、人表皮生长因子、链激酶等几十种。 毕赤酵母的分泌表达能力比酿酒酵母强，但对其遗传背景了 解还比较少，且发酵周期也比较长。
Selecting a Pichia Expression Vector
pPIC9载体的信号肽序列和多克隆位点
Selecting a Pichia Expression Vector
Pichia Cloning
表达载体与毕赤酵母基因 组发生重组的方式：
1. 载体的3‘ AOX1区与基因组的
expression and can even lead to cell death. Other important facts: • Doubling time of log phase Mut+ or MutS Pichia in YPD is ~2 hours • Mut+and MutS strains do not differ in growth rates unless grown on methanol • Doubling time of log phase Mut+Pichia in methanol medium (MM) is 4-6 hours
AOX1基因的末端发生同源重组
2. 载体的HIS4区与基因组的HIS4 基因的末端发生同源重组
Gene Replacement at AOX1 in GS115
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
酵母表达外源蛋白（foreign protein）（1）
1、菌株
用GS115表达不出蛋白，换KM71H后，大部分克隆能表达。
2、温度：
在28度和室温下诱导表达，表达水平可能都不低。
3、pH
手册上用6.0，pH提高到6.8，不表达的蛋白可能就表达出来。
BMMY的p
H7.0-7.5比较合适。
国内外做的最好的rHSA，最适pH大概 5-6左右。
p
H3的时候yeast和peptone好像会沉淀的，可以用磷酸和磷酸二氢钾调，具体比例自己去试试。
4、偏爱密码子
codon bias一般不是主要的问题，你要表达的蛋白特性才是主要问题，酵母对分子量大（30KD以上），结构复杂（如一些蛋白酶），二硫键
含量多的蛋白往往不能有效表达，尤其是分泌表达。
密码子改造对一
些较小的而且结构简单的蛋白表达量的提高可能有一些作用。
比如一
位战友用Pichia酵母表达一个单链抗体，29KD，含有2对二硫键，表达
量约几毫克每升，选用酵母偏好密码子全基因合成后，表达量没有什
么提高。
5、表达时间与空质粒转化对照
诱导时间长了以后，是会有很多蛋白分泌出来的，时间越长杂蛋白就
越多，且分子量都比较大。
最好做一个空质粒转化的对照，这样就会
比较肯定到底是不是自身的蛋白分泌的结果。
6、污染
每个样品从G418板上挑10个左右单克隆于2ml BMGY摇菌（30ml玻璃管，比LB管大一点），纱布一般用8层，一天左右看着比较浑离心，留样1m l，余1ml换2ml BMMY诱导表达，3,4层纱布足够了。
污染一般都是跟瓶口覆盖有关的原因造成的，只盖纱布肯定会污染。
加盖报纸后，就再没遇到过污染。
如果只用6层纱布，污染的可能当然
很大，100ml 三角瓶，装量10ml培养液，用橡筋把8层纱布和2层报纸
拴紧封口，空气浴摇床。
7、不表达
蛋白有没有表达就要看你的运气了，一般重复2－3次实验都没有表达
菌株，这个蛋白就放弃表达了。
8、表达量
30KD,10mg/L表达量已经很高，最直接的方法是发酵，一般提高5－10倍。
大肠杆菌一样出现大团的超表达蛋白。
9、糖基化
酵母分泌表达的N糖基化是可以预测的，有如下序列：N X S/T就是潜
在的糖基化位点，X为任意氨基酸，1个糖基化位点会加上1－3KD左右
的糖基。
另外可能还有O糖基化话，但是无法预测其位点，不过很少听
说表达蛋白有O糖基化的。
如果胞内表达，不存在糖基化的问题。
10、表型与表达
重组SalI和BglII酶切产生单交换和双交换，结果就是产生Mut+和Muts
表型的菌株；前者在甲醇诱导表达时生长快，消耗的甲醇多，后者生
长慢，消耗的甲醇少，所以诱导表达时Muts表型要求更高的菌体浓度。
一般用Mut+表型的较多，但是对某些蛋白Muts菌株可能表达的更好，
只有试试才知道你的蛋白用那种菌株表达较好。
11、培养基
YPD：最基本的培养用；BMGY：诱导表达前培养用；BMMY：诱导表达用；MD：电转化后筛选his＋用。
YEPD是不能代替BMGY的，因为有葡萄糖，这样残留的葡萄糖会影响下
一步的诱导表达。
不过有一种方法是可行的，就是用YPG培养基代替，
只是把 YEPD中的葡萄糖用3%的甘油代替，也可以降低成本。
摇瓶毕竟
不能和发酵罐比，甘油残余会抑制甲醇利用。
BMGY、BMMY灭菌后才能加甲醇、磷酸钾、生物素。
配制BMMY时也没必
要用5%过滤除菌的甲醇，在灭菌后使用前加100%甲醇至你要的浓度。
YNB可以高压灭菌，没问题的，也可以0.22um过滤处理，天冬氨酸和苏
氨酸要待培养基高压灭菌后加入；配YPD时可以加入YPD一起灭菌，但
时间不能太长，温度不能太高，一般121-125度12-15分钟足够了。
若
时间过长，温度过高，可能导致YPD焦化。
glucose和含氮化合物在一
起容易产生美拉德反应，这是配制培养基中的禁忌。
颜色很深的话，
基本不能使用了。
或者含有葡萄糖和/或YNB的培养基108度35min高压
灭菌。
小量发酵其实可以把培养基成分中的YNB和生物素去除，培养基价格便宜，操作又方便，可以直接灭菌，效果也很好（效果不比含YNB的差）。
如果是用自己配置的培养基，如玉米浸提液、麦芽浸提液、麦麸浸提
液等等，可以不用换液，采取添料来维持酵母对培养基的营养需要。
用无机盐进行大规模发酵，更省钱。
大规模发酵时，甲醇的流加速度增加不要太快。
另外使用纯氧并不昂贵，在武汉买个钢瓶600元左右，一瓶纯氧20元。
一个批次100h左右估
计3－4 瓶氧气。
关于Tryptone和Peptone的选择：
1）用培养E.coli的Tryptone替代Peptone对有些酵母菌可以,例如一般
的表达酵母.但是对有酵母菌些绝对不行.例如做双杂交的 AH109,Y187
之类表达酵母，根本就长不好．
2）Tryptone和Peptone虽然都是营养胨，但营养成分不一样．即使是
一般的表达酵母可以在Tryptone生长，生长状态也没有在 Peptone中好．但tryptone和peptone就是含量上有点不同外，其他没什么区别，
用peptone的目的不是为了提供氮源，提供氮源的是培养基里面的YNB。
3）如果要求不高，一般使用也还凑合．尽可能的用Peptone，difco公司的，晶美公司代理的，甚至是其它国产的蛋白胨都可以很正常的培养绝大多数酵母菌．
4）用含Peptone的培养基颜色很深，纯化表达蛋白时颜色要去掉，所以还要进行麻烦的后续处理。
而改用Tryptone后，培养基颜色变得很浅，和LB（液体）颜色差不多，后续处理要简单些。
invitrogen说明书说 peptone的作用是防止目的蛋白被一些酶类水解，加入peptone的目的就是竞争性抑制目的蛋白的水解，因为peptone是一些小的短肽，是一些酶作用的底物。
培养毕赤酵母,书上说BIOTIN储液是水溶液,但事实上BIOTIN很难溶于水, 可以稍稍水浴加热一下。
配制500×BIOTIN stock solution（0.0 2％）有这么3种方案：
1）、懒人是将Biotin直接溶在去离子水中，放过夜，基本就能溶；2）、急性子是将溶液配成0.02N的NaOH，就很容易溶解了；
3）、水浴加热，温度不能高于50度。
D－生物素是具有生物活性的生物素，也就是vitaminH。
在毕赤酵母代谢过程中，作为多种酶的辅基起作用。
天然培养基中一般可以不单独添加，因为YNB中、酵母粉、蛋白胨中均含有一定量的生物素，但是做高密度发酵还是必须要添加的。
MD、MM属于基础培养基，没有哪种成分会含有微量生长因子（如生物素）。
所以肯定要加的。
附：无机培养基配方
BSM无机培养基：
85% H3PO4 26.7ml/L
CaSO4 ·2H2O 0.93g/L
K2SO4 18.2g/L
MgSO4·2H2O 14.9g/L
KOH 4.13g/L
甘油 40g/L
PMT1 4.0ml/L
100%氨水调pH5.0(1瓶50ml加800ul氨水)或10g/L硫酸铵调pH5.0，氨水用于上罐调pH（便宜，方便）。
诱导表达前调 pH6.0。
pH5.0是为了防止BSM形成磷酸钙沉淀，pH6.0是表达HSA融合蛋白的最适pH。
BSM高压灭菌后再加4.0ml/L 过滤除菌的PTM1(微量元素)4.0ml/L 。
10 0%的500ml甲醇加6ml PMT1，用于补加甲醇诱导表达目的融合蛋白。
PMT1（1L）配方：
CuSO4·5H2O 6.0g/L
KI 0.088g/L
MnSO4·H2O 3.0g/L Na2MoO4·2H2O 0.2g/L H3BO3 0.02g/L
CoCl2·6H2O 0.5g/L ZnCl2 20.0g/L FeSO4·7H2O 65.0g/L Biotin 0.2g/L
浓H2SO4 5.0ml。