毕赤酵母表达外源基因存在的问题与对策
万方数据
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毕赤酵母表达外源基因存在的问题与对策
作者：丁镌， 宋跃芬， 袁野， 刘娣
作者单位：丁镌,宋跃芬(东北农业大学动物科技学院,黑龙江,哈尔滨,150030)， 袁野(中国刑警学院警犬技术系,辽宁,沈阳,110034)， 刘娣(东北农业大学动物科技学院,黑龙江,哈尔滨
,150030;黑龙江省农科院,黑龙江,哈尔滨,150086)
刊名：
畜牧与兽医
英文刊名：ANIMAL HUSBANDRY & VETERINARY MEDICINE
年，卷(期)：2007,39(2)
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本文链接：/Periodical_xmysy200702022.aspx。
重组毕赤酵母甲醇利用表型与基因拷贝数对外源基因表达的影响
Muts 和 Mut- 三种表型 。这三种甲醇利用表型 (下简称 表型 )实质是由重组载体在毕赤酵母内重组方式所决 定的 。毕赤酵母内外源基因重组方式通常有三种 [2 ] : 一是双交换 (Double cross2over) ,发生在染色体 AOX1 位点和表达载体的 PAOX1及转录终止区 。含 PAOX1、外源 基因和转录终止区的表达单元置换染色体上有完整功 能的 aox1 基因 , 产生的表达菌株基因型为 H is+ M utS ( aox1 - aox2 + ) 。由于 aox1基因被置换 ,只能靠微弱转 录能力的 aox2基因 ,因此甲醇利用率很低 ; 二是 AOX1 单交换 ( Single cross2over) ,发生在染色体 AOX1 位点和 表达载体的 AOX1 区 。外源基因的表达盒插在 AOX1 基因的上游或下游 ,并且这一过程可重复发生获得更 多拷贝的转化子 。此类重组方式产生的基因型是 H is+ M ut+ ( aox1 + aox2 + ) , AOX1基因仍然有活性 ,利用甲醇 能力与野生型相同 ; 三是 his4 位点单交换 。重组发生 在染色体 h is4 位点和表达载体的 his4 位点 ,使得一个 或多个表达 盒 插 入在 his4 位 点 , 产 生 的 基 因 型 也 是 H is+ M ut+ ( aox1 + aox2 + ) 。 因此 , aox1 替换与否将导致细胞代谢甲醇的速率
2 基因拷贝数对外源蛋 白和发酵表 型特征 的影响
2. 1 基因拷贝数对外源蛋白表达的影响 基因剂量对外源目的蛋白表达有重要影响作用 。 许多试验表明一个拷贝的外源蛋白表达盒足够外源蛋
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改良毕赤酵母分泌表达外源蛋白能力的研究进展
象， 并对不 正 确 折 叠 构 象 蛋 白 进 行 严 格 筛 选 的 主
1
主要的内质网驻留蛋白及其折叠加 工外源蛋白的分子机制
内质网腔是将分泌表达蛋白折叠成天然构
要场 所
［11］
。 内 质 网 驻 留 蛋 白 包 括 3 类 ：折 叠 酶 、 分
子伴侣和凝集素伴侣。几种主要 的 内 质 网 驻 留 蛋 白对多肽 /蛋 白 质 的 折 叠 加 工 分 子 机 制 如 图 1 所 示。
and facilitate the folding progress by consuming ATP ； Foldase PDI further accelerates the protein folding process by formation of correct disulfide bonds mediated in a cycle of Pdi and Ero1 ； Nascent glycoproteins are bound by calnexin and mediated to correct folding and processing of the N － glycans． Correctly folded and processed proteins are released to transport vesicles ，while failed folding leads to binding by the BiP complex and targeting to ERAD．
bip参与内质网功能的而共表达bip的同时再共表达辅分子伴侣能够更pdi基因pdi似乎与新合成的scfv在折叠过程的不同阶段相互作用推测bip主要辅助未折叠或部分折叠scfv转运和保持折叠状态而pdi通过它的二硫键催化或异构化活性促进scfv的折叠23共表达pdi可能对富含半胱氨酸外源蛋白的分泌表达有胱氨酸的美洲板口线虫necatoramericanus分泌性蛋白naasp1时发现共表达pdi可以有效提多拷贝菌株分泌表达该蛋白能力
外源蛋白在巴氏毕赤酵母中高效表达的策略
第22卷 第3期 吉首大学学报(自然科学版)Vol.22 No.3 2001年9月J ournal of J ishou University(Natural Science Edi ti on)Sept.2001文章编号:1007-2985(2001)03-0040-05外源蛋白在巴氏毕赤酵母中高效表达的策略聂东宋,梁宋平,李 敏(湖南师范大学生命科学院,湖南长沙 410081)摘 要:高效表达外源蛋白,在理论和实践上特别是在生物制药中具有重要意义,巴氏毕赤酵母(Pichia pastoris)是表达外源蛋白最理想的真核表达系统之一.影响外源蛋白在P.pas toris中表达的因素很多,主要包括外源基因自身的特性、载体、宿主细胞几个方面,了解和灵活运用它们的联系,有助于获得外源基因在P.pastoris中的高效表达.关键词:巴氏毕赤酵母;外源蛋白;高效表达中图分类号:Q75 文献标识码:A巴氏毕赤酵母(P.pastoris)是一种单细胞真核生物,基因工程菌近年来已被广泛用于商业化生产外源蛋白.与其它表达系统比较,该系统具有以下优点:(1)高表达.该表达系统利用醇氧化酶基因启动子很强,细胞生长速度快,所以该表达系统表达的外源蛋白产量很高,如破伤风毒素蛋白的产量高达12g/L[1],其它表达系统一般为毫克级.(2)高稳定.由于该表达系统的表达载体不是以自主复制的质粒形式存在,而是整合到酵母染色体上,所以构建的菌株十分稳定.(3)高分泌.P.pastoris中一些分泌信号和先导序列如a-因子的分子生物特性已研究得十分清楚,加之它身体的生物学特性,其分泌表达可达10g/L,这在已知的分泌表达系统中是十分罕见的.虽然已有许多蛋白在P.pastoris中实现了高效表达,但仍有一些蛋白表达量相对较低,如 -cryptogein表达量级为1~5mg/L[2],AFP在摇瓶中表达时最高水平不超过5mg/L[3],有些甚至不能表达,如HIV表面糖蛋白[4].此外,酵母表达系统的局限性还在于分泌表达产物的不均一性,如信号肽加工不完全,表达产物内部降解等现象[5] 其次,当利用该系统的载体将外源基因通过双交换整合到宿主体中AOX1基因位置时,AOX1基因被破坏,这样使细胞利用甲醇能力大大降低.从而大大延长了细胞培养发酵时间.这种外源蛋白表达的差异,一方面是由于外源基因本身的特性而引起的,另一方面,表达条件也对表达量起了极其重要的作用.笔者综述了影响甲醇酵母中外源基因高效表达的各种因素,并阐述了优化外源蛋白在P.pastoris中高效表达的策略.1 外源基因本身的特性对表达的影响1 1外源基因的A+T组成外源基因本身的4种核苷酸的组成对基因的表达起重要作用.许多高A+T含量的基因通常会由于提前终止而不能有效转录,共有序列ATTATTTTATAAA就是一个转录提前终止信号 Caro1A Scorer[6]在表达人免疫缺损病毒(HI V)包膜糖蛋白gp120时,这个信号造成了gp120的转录提前终止.提前终止被认为是一种具有种族特异性的现象,如在P.pastoris中不能表达的HIVE NV蛋白在酿酒酵母中表达良好.[4]因此,可以通过调整高A+T含量区的核苷酸的组成来避免提前终止的发生,使其A+T含量在30%~50%收稿日期:2001-08-05基金项目:国家自然科学基金资助项目(39670392)作者简介:聂东宋(1967-),男,湖南省衡阳县人,湖南师范大学硕士研究生,主要从事基因结构与功能研究.范围内,CareJJ [1]用这种方法使破伤风毒素C 片段得到高效表达.1 2密码子的选择在不改变氨基酸组成的前提下,通过修饰密码子序列也可以提高表达水平.目前公认的观点是:通过优化基因的密码子序列,可以适应tRNA 的同工受体及宿主的反义密码子摇摆位置处被修饰的核苷酸的丰度,同时也有利于翻译的二级结构的形成.在酵母中表达较高的基因往往是采用酵母本身所偏爱的密码子,研究也表明在所有61个密码子中有25个是酵母所偏爱的[7].赵翔[8]通过对Pichia pastoris 的28个蛋白编码基因的同义密码子的使用情况的分析,确定了P.pastoris 的19个高表达优先密码子.这些结果与已知的Saccharomyles Cervisiae 及Kluyveromyles lactis 的密码子基本相似,但在谷氨酸的密码选择上截然相反.谷氨酸以GAG 为高表达优越密码而不是以S.cerevisiae 和ctis 所偏爱的GAA 为优越密码.姚斌等[9]在P.Pastoris 中表达植酸酶时,把在酵母中使用频率为0的精氨酸的密码子突变为使用频率较高的密码子时,表达水平提高了37倍.1 3mRNA5 非翻译区(5 -UTR)核苷酸的序列和长度5 -UTR 的核苷的序列和长度影响外源基因的表达.由于UTR 太长或太短都会造成核糖体40S 亚基识别障碍,因此,一个适当长度的5 -UTR 有助于mRNA 进行有效的翻译.Aox1基因5 -UTR 长为114nt 且富余A+ ,因此,为了获得最佳蛋白表达量,维持外源基因mRNA5 -UTR 尽可能与Aox1mRNA5 -UTR 相似是十分必须的,最好二者保持一致.Sreekrishna 等[10]通过调整人体血清白蛋白的(HSA)的mRNA5 非翻译区使之与醇氧化酶Aox1的非翻译区保持一致后,HSA 的表达量提高50倍以上,肠组织蛋白酶E (C TSE)的表达水平通过5 -UTR 的调整亦极大地增加[11].此外5 -UTR 应避免AUG 序列,以确保mRNA 从实际翻译起始位点开始翻译,起始密码AUG 周围不应形成二级结构,可通过密码子的替换来达到目的.2 外源蛋白在P.pastoris 中的高效表达策略2 1优化表达载体系统1)载体的选择.应用甲醇酵母表达异源蛋白时有多种载体可供选择,既有胞内表达载体(如pPIC3),又有分泌表达载体,如pPIC9,PHI L-D,PA0804,Pa0815,Ppsc3K 等.一般而言,对于非分泌蛋白采用胞内表达方式,而对于正常分泌蛋白则选择分泌型载体,这样更有利于表达产物的分离纯化.2)选择强启动子.P.pastoris 载体中最常用的启动子为Aox1启动子(Aox1promoter P Aox1),它的甲醇诱导性很强,因此,由它控制的外源基因通常能得到高效表达.也有人曾用P Aox2和P DAS 启动子,但二者的强度大大低于PAox1.如果带有外源基因的载体通过双交换整合起P.pastoris 的Aox1基因位置时,Aox1基因将被破坏.虽然Aox2和Aox1基因的序列同源性高达97%,但Aox1基因表达产物在正常细胞中仅占总酶量的5%.这样就使细胞利用甲醇的能力大大下降,从而使表达量下降且延长了细胞发酵时间(150~200h).为了克服这一缺点,戴秀玉[12]等通过分离选择恢复利用甲醇能力的自发突变体,从Aox1基因缺陷菌株中分离得到Mut +的自发突变体.他们对突变体的Aox2基因上游区域经PCR 护增产物测序,确定了该突变体在-255和-529两个位置的碱基发生了改变,而这两个位置为阻遏蛋白结合区域.该区域发生点突变后阻遏蛋白便不能很好地与之结合,通过去阻遏作用使得转录效率增强,从而提高表达量和缩短发酵时间.最近一种无需甲醇诱导而能组成性表达外源基因的毕赤酵母载体pGAPB 和pGAPB 已经构建成功,这些载体利用了三磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)基因启动子P GAP ,在它的控制下B-1acz 基因表达率比甲醇诱导下的以P Aox1启动子的产量更高[13].由于该组成型启动子不需甲醇诱导,发酵工艺更为简单,而且产量更高,所以成为替代PAox1的最强有力的启动子.Doring 等[14]分别用pGAPZB 和pPICZB 来生产兔肾肽载运蛋白(rPE PTZ)和小人肠肽转运蛋白(hpEPTZ),前者表达的这两种蛋白的产量均比后者高4倍,看来在生产哺乳动物膜转运蛋白时pGAP 比PAox1更理想.3)信号肽的选择.分泌表达是一种理想的蛋白质生产方式,既可以减轻宿主细胞代谢负荷,又可减少宿主细胞蛋白酶对外源蛋白的降解.利用外源蛋白自身信号肽与酵母信号肽表达外源蛋白均有成功报道.用自身信号肽在P.pastoris 中表达成功的例子如人血清白蛋白和牛凝血酶等.但如果自身的信号肽序列效41第3期 聂东宋,等:外源蛋白在巴氏毕赤酵母中的高效表达42吉首大学学报(自然科学版)第22卷果不佳则可尝试用甲醇酵母的信号肽.这些信号肽主要有酸性磷酸酶基因PHO1的信号肽、蔗糖酶基因SUC2的信号肽、间质金属蛋白酶(MMP)的信号肽及转化酶(invertase)的信号肽等.其中a-因子信号肽使用最广,尤其对于小分子物质如抑肽酶、表皮生长因子、凝血固子X 等[10].杨晟[15]等采用a-因子信号肽比利用人血清白蛋白天然前导肽作为分泌信号肽可使重组人血清白蛋白表达量高出10%左右.另外如果外源基因产物不能分泌到体外,还可将产物连上一个定向肽(peroxisome targeting singal,P TS),使其定向运输到过氧化物酶体中,以免产物积累对宿主细胞造成毒害,同时产物自身的稳定性会大大增强.Water-ham[16]等利用定向肽在P.pastoris中成功地将P GAP启动下的 -半乳糖苷酶定向运输到过氧物酶体中.但用P.pastoris表达基因工程产物的另一问题是信号肽加工不完全,其表达的外源基因产物常比设计的多几个氨基酸残基,这可能是酵母自身调节机制对外源基因高表达的应答反应[5].Singh[17]等通过定向缺失诱变MF a1和干扰素基因连接处寡核苷酸导致了含有天然N端的成熟干扰素的正确释放,可以成为解决这一问题的好办法.2 2 增加外源基因整合拷贝数巴氏毕赤酵母载体在宿主染色体上大多数为单拷贝整合,但由于P Aox1在甲醇诱导下的强启动性以及整合后常常稳定,所以即使单拷贝也能获得较高的产量.如乙肝表面抗原在P.pastoris中单拷贝产率可达0 4g/L(酿酒酵因至少需50拷贝才能达到此水平)[18].但在另一些例子中,提高拷贝数可大大增加表达水平,如鼠表皮生长因子(E GF)、人肿瘤坏死因子(TNF)和破伤风毒素片段C[10].目前提高整合拷贝数的方法主要有:(1)通过不同的转化方法提高拷贝数.P.pastoris的转化方法有电激法、原生质体法、氯化锂法等,其中以原生质法转化使细胞群中产生多拷贝转化子频率相对较高.但若使用G418检测拷贝数,则配合电激法转化的效果更好[19].(2)在体外载体上多次插入目的基因片段.但这种多拷贝整合不太稳定且拷贝数有限.(3)将载体中目的基因两端连上来自宿主或其它非必需高重复的基因片段,通过同源重组而达到高拷贝整合的目的.由于rDNA在酵母基因组中有100~200个重复单元,所以这是一种提高拷贝的理想方式.该策略已在酿酒酵母[20]、乳酸克鲁维酵母[21](K lactis)中得到成功应用,可惜在P.pastoris中尚未见实验报道.目前要快速高效地筛选高拷贝的转化子,传统方法有SDS-PAGE、免疫印迹、southern blotting 等,但这些方法费时费力.通过PC R法检测拷贝数既方便又快捷,另外还可通过提高G418的浓度来筛选高拷贝转化子.但是个别情况下,拷贝数增加对产量也会产生负效应[22],这可能是由于分泌效率低的蛋白在过高表达的情况下会对分泌途径形成负反馈抑制,因此基因拷贝数对表达量的影响是无法预测的.高表达菌株的筛选应以表达蛋白量为唯一标准.Jeffrey[23]等建立了一种双筛选膜筛选方法:首先将菌转至醋酸纤维素膜上,再与硝酸纤维素膜叠放在酵母固体培养基上,经过一段时间培养后分泌蛋白就印在硝酸纤维素膜上,接着用此蛋白的抗体检测,即可挑出最高蛋白量对应的克隆.用这种方法,每套滤膜可筛选出100 ~1000个克隆,从而快速地从大量重组子中筛选出高表达克隆.2 3优化发酵条件1)通过提高菌株的生物量来提高外源蛋白表达量.采用不同的培养基配方和不同的发酵参数,通过提高细胞的绝对总数来提高外源蛋白的产量.影响P.pastoris生长的外界因素主要包括:(1)培养基组成.目前主要有MGY/mm、B MG/Bmm、B MGY/B mmy3种培养基可用于培养P.pastoris.但由于BMGY/Bmmy既含有磷酸缓冲液又含蛋白胨和酵母提取物,因而菌株生长更好,大大增加了生物量,使表达量也相应大大提高.如在表达mEGF时,在B mmy培养基中单拷贝转化子表达量为20 g/L,而在不含蛋白胨和酵母提取物的基本培养基中表达量少于1 g/L[24].蛋白胨和酵母提取物中几乎不含大分子蛋白质,只有分子量低于3000Da的小分子多肽,因此对于大分子外源蛋白的分离纯化不会造成不便.(2)诱导前菌体OD值.P. pastoris中蛋白表达分2个阶段:一是生长阶段,在含甘油的培养基中生长菌体,待OD600达到2~6时再离心收集菌体;二是诱导表达阶段,将收集的菌体转入含甲醇的培养基中诱导表达.理论上而言,OD600值越高,生物量越大,则总的表达量亦应该越高.但是OD600值越高培养基中氧和营养供给越受限制,而且外源蛋白的溶解性、稳定性、毒性都会对菌体产生影响.因此,高密度并不一定意味着高表达.鉴于发酵罐培养较之摇瓶培养在溶解量、pH值、通气量营养补给方面的优越性,有人建议在筛选高表达菌种时,经初筛后的菌株应立即用发酵罐进行发酵条件的研究,从而大大提高表达量.如在表达mEGF时,发酵罐较之摇瓶培养提高10倍,从48mg/L 到447mg/L;在表达破伤风肠毒素C 片段时,发酵罐也提高表达量10~20倍.2)防止目的蛋白降解.外源蛋白的稳定性直接影响到基因表达的产量.几乎没有一种高表达蛋白是特别稳定的,宿主菌内蛋白酶水平决定着表达产物的降解速度.高密度培养酵母固然可以大大提高培养基上清中分泌外源蛋白的含量,但随着重组蛋白的分泌增加,其它一些细胞内物质如蛋白酶亦会分泌增多,在培养基中积累从而造成对重组蛋白的降解.此外酵母细胞膜上有一种KEX-2样蛋白水解酶,能专一性水解 -因子前体中羧基端的肽键,即连续的2个碱性氨基酸(如lysAry,lyslys,Arglys),从而使目的蛋白降解.为了提高外源蛋白在发酵液中的稳定性,免受蛋白酶降解,可采有以下几种方法:一是改造P.pastoris 表达宿主菌株,缺失基因组中主要蛋白水解酶的基因,使目的基因稳定.或使用已有的蛋白酶缺陷菌株如SMD1168(his4pep4)、SMD1165(his4,prb1)和SMD1163(his4,pep4,prb1)亦可避免产物降解的发生[10].二是在培养液中补加一些富含氨基酸的组分和酪蛋白水解物、胃蛋白水解物,提供给酵母细胞蛋白酶过量的底物,以减少目的蛋白的降解.三是由于P.Pastoris 能忍耐较宽的pH 范围(pH 3.0~7.0),因此可调节溶液pH 值抑制蛋白水解酶活性,防止目的蛋白降解.四是降低甲醇诱导表达时的培养温度,Mei M 等[25]通过将诱导表达时的温度由30 降至25 ,半乳糖氧化酶表达量提高4倍.总之,P.pastoris 表达系统由于具有表达量高、本身遗传稳定、具翻译后加工能力、产物可分泌发酵、工艺成熟、分离纯化简单、蛋白质产物糖基化方式更接近高等生物等优点,已成为目前国内外倍受青睐的真核表达系统.目前用该系统表达的外源基因已上百种,很多医药制品如人血清白蛋白、人白介素-2、乙肝表面抗原、水蛭素等在该系统中都已成功表达,有些即将进入市场[26].但影响外源基因在P.pastoris 中表达的因素非常复杂,建立稳定的高效表达外源蛋白的表达体系并非易事.笔者着重探讨了与遗传因素及发酵方面有关的因素,这些策略的灵活运用将不同程度改善外源蛋白在P pastoris 中的表达水平.外源蛋白在P.pastoris 的高效表达是一个涉及多学科的问题,尚需其它研究领域的共同合作探讨.参考文献:[1] CLARE J J,RAYMENT F B,B ALLANTINE S P,et al.Hihg-level Expression of T etanus Toxin Fragment C in Pichia Pastoris StrainsContaining Multiple T andem Integration of the Gene[J].Bio/Technology,1991,(9):455-460.[2] MIC HAEL J D.Over Expressi on in Pichia Pastoris and Crystallization of an Elicitor Protein Secreted by the Phytopathogenic Fungus[J].Protein expression and Purification,1996,(8):254-261.[3] LOEVEN M C.Biosyn thetic Production of Type Fi sh Anti freeze Protein:Fermen tation by Pichia Pastris[J].Appl Microbiol Bi tech -nol,1997,(48):480-486.[4] CLARE J,SCORERC,BUC KHOLZ R E xpression of EGF and HIV Envelope Glycoprotein[J].Methods Mol 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毕赤酵母表达系统在外源蛋白表达中的研究及应用
写一篇毕赤酵母表达系统在外源蛋白表达中的研究及应用的报
告，800字
毕赤酵母表达系统是一种高效、灵活的工具，可用于外源蛋白表达研究和应用。
它是一种重要的生物工程技术，可以实现外来基因的大规模表达，分子量可达到200 KD 以上。
目前，毕
赤酵母表达系统已成功地用于各类重要蛋白质的表达，并发挥了重要作用。
毕赤酵母表达系统的优势在于它能够表达复杂的蛋白质，而且不受细胞因子的限制，能够有效提高蛋白表达的效率。
此外，该系统还具有良好的原核性、容易稳定表达、灵活的改造等特点。
因此，毕赤酵母表达系统被广泛应用于外源蛋白表达和重组蛋白的研究中。
例如，已成功利用该系统彻底破解人工合成水稻Hsp70基因编码蛋白的结构，它同时也是人类在蛋白研
究中的有力工具。
毕赤酵母表达系统在医学研究中也得到了很大的发展。
比如，可以用毕赤酵母表达系统来研究和表达病毒血管瘤病毒(HPV)-695E5蛋白，而这种蛋白可能会加速病毒复制和细胞侵入，因
此有助于治疗HPV相关的癌症。
利用毕赤酵母表达系统还可
以大规模表达多肽，如α-肌动蛋白及其相关蛋白，从而探索
肌钙蛋白的生物学功能。
总的来说，毕赤酵母表达系统是一种重要的生物工程技术，它能够实现外来基因的大规模表达，受益于它的灵活性和稳定性，可以成功用于外源蛋白表达及其相关研究与应用中，是一项具有重大意义的研究。
毕赤酵母高效表达策略-1
1.基因的内在特性主要包括mRNA 5’端非翻译区(5’2 U TR)、基因的A +T 组成和密码子的使用频率3 个方面。
由于巴斯德毕赤酵母中乙醇氧化酶的表达量极高(占胞内可溶蛋白的30% 以上) 因此为了有高的蛋白表达量,维持外源基因mRNA 5’－U TR。
尽可能和AOXlmRNA 5’－U TR 相似是必需的, 最好是保持两者一致。
A + T 含量高的基因在巴斯德毕赤酵母中表达时偶尔会造成转录提前终止,这是因为A T 丰富区可能存在转录提前终止信号。
因此对A T 含量丰富的基因最好是重新设计序列, 使其A + T 含量在30%～55% 范围内。
巴斯德毕赤酵母也有特殊的密码子偏好趋向。
（赵翔,霍克克,李育阳. 毕赤酵母的密码子用法分析[J ] . 生物工程学报,2000 ,16(3) :308 - 311.）外源蛋白自身的理化特点也影响其表达和分泌。
外源蛋白的加工修饰都会影响蛋白的表达量。
2．选择强启动子启动子在转录水平上调控基因的表达最常用的启动子是AOXI 启动子。
PGAG(三磷酸甘油醛脱氢酶启动子) 是最近在巴斯德毕赤酵母中克隆到的一个组成型启动子,在它的控制下β- LabZ 基因表达率比甲醇诱导下的PAOX驱动的产量更高,由于该组成型启动子不需要甲醇诱导,发酵工艺应该更简单,同时其产量更高,所以成为代替PAOX1 最有潜力的启动子。
通过分离选择恢复利用甲醇能力的自发突变体, 从AOX1 基因缺陷菌株中分离M ut+ 的自发突变体，从中筛选提高表达量的突变体。
（戴秀玉, 王恂, 周坚1 毕赤氏酵母PAOX2 突变化序列分析〔J 〕1微生物学报, 1999, 39 (6) : 559～5611）3．增加外源基因整合拷贝数（1）Invitrogen 公司最新发展的质粒pPIC9K上带有G418 的抗性基因,可以通过转化子对G418抗性水平快速筛选高拷贝转化子（配合电激法转化的效果更好）。
（2）在体外载体上多次插入目的基因片段。
2016.08.31毕赤酵母蛋白不表达的原因（排版）
2016.08.31毕赤酵母蛋白不表达的原因（排版）毕赤酵母蛋白不表达的原因很多朋友问这样一个问题：为什么毕赤酵母不表达?他们自己也很纳闷，重组酵母PCR检测也证明目的基因重组了，但是诱导之后就是在表达上清中检测不到目的蛋白，仔细研究操作手册后仍然不知道原因。
本人，根据自己的经验，采用倒推的方法，按实验过程从后向前分析，供大家参考：1、诱导之后表达上清中检测不到目的蛋白：①：检测的方法是否有问题，要考虑是不是蛋白表达量低而没有检测到?如果是蛋白表达低，可以选择浓缩蛋白，具体的方法很多，有TCA、丙酮、浓缩柱等等方法，之前在本版已经发过帖，在此不赘述。
②：如果蛋白浓缩N倍之后仍然检测不到，那基本可以确证蛋白并不在上清中。
那么蛋白到哪里去了，考虑是否没有分泌出来，而是在胞内，那就需要通过裂解酵母来检测胞内蛋白，具体的方法很多，在此也不赘述，曾整理过相关破碎的帖子。
③：如果胞内也没有目的蛋白表达，那么基本可以确定蛋白并没有表达。
2、为什么没有表达呢?倒推回来就是诱导的过程了，诱导体系是什么?甲醇浓度是多少?培养问题是多少，转速是多少?这些都要注意。
甲醇一般是0.5%-1.0%，本人用的是0.5%，也有很多人也用1.0%，曾见过一个帖子，说超过1.5%反而会抑制表达，没有验证过，供大家参考。
培养问题28-30度比较合适，转速250rpm比较合适，诱导体系没有固定的体系，说明书上推荐的是BMGY到OD600 2~6，换到BMMY 中OD600 为1左右。
3、如果诱导的过程也没有问题，那问题就复杂了，特别是重组酵母PCR 检测证明目的基因确实已经发生了重组。
这个时候是最郁闷的了，但是郁闷怎么办，还是要找原因，在此我给的建议是先做RT-PCR证明mRNA水平的情况，也就是说有没有转录。
如果转录了，后续的操作也没有问题(本帖的1、2项)，那么只有重新设计实验，比如换酵母株，有文章上说：用GS115表达不出蛋白，换KM71H后，大部分克隆能表达。
毕式酵母表达常见问题及解析
毕式酵母表达常见问题及解析点击次数：433 作者：佚名发表于：2008-08-27 15:20转载请注明来自丁香园1、问：我用毕式酵母表达一个27KD的蛋白，小量表达并做SDS－PAGE有一条类似三聚体的条带。
用大量表达，表达上清用镍柱进行亲和层析，在FPLC上可以看到一个大峰，但跑电泳却没有发现条带，为什么呢？请赐教参考见解：你在大量表达后有没有跑电泳检测?表达上清用镍柱亲和层析后洗脱液有没有电泳检测?你首先要做的是:1,确定你的蛋白确实有表达;2,亲和层析是表达的蛋白确实被洗脱下来了.然后再考虑FPLC的事.在FPLC上可以看到一个大峰，但跑电泳却没有发现条带，可能的原因有：1，上样时没有目的蛋白，可能是1)没表达2)亲和层析时没洗脱或是穿透了；2，目的蛋白结合在FP LC柱子上没被洗脱；3，目的蛋白穿透FPLC柱子，你在FPLC上看到的大峰可能是盐分峰；4，电泳时没跑好,目的蛋白没被检测到.FPLC大峰也可能是目的蛋白峰，它的吸收值有多少？不要看与基线相比的高度,要看吸收值，如果吸收值不高的话就是蛋白的浓度太低,浓缩后再跑电泳。
2、问：我现在做的是裂殖酵母表达，表达载体pesp-2,酵母菌珠sp-q01.说明只提供用化学转化法，但我转化了好几次都没有结果，是否也可以用电转化，在多克隆位点把质粒线性化？参考见解：其实无论是那种类型的酵母表达，转化方法基本是一制的。
化学转化法对酵母转化讲就不是很高，这里你可以用电转的。
查一下以前别人的讨论，看看电转化方法，效率提高了，筛选的希望就大些了由于筛选表达酵母的时间比较长，两个方案同时做应该来的及的至于线性化，对于电转是要做的步骤，这是为了后面定位重组整合。
3、问：我做毕赤酵母分泌表达,想问做阴性对照的是应该用加甲醇前的上清还是用一直不加甲醇摇瓶同样时间的上清呢?参考见解：对于阴性对照我一般都用转了不含基因的原始质粒（比如９K等）的菌作为对照，诱导过程中同样加入甲醇，诱导的时间均一样，每次样品都会有一个对照。
毕赤酵母在基因克隆与表达中的应用2_占今舜
3.2 pH 值
毕 赤 酵 母 能 在 pH3.0 ～ 7.0 的 范 围内生长。在不同的表达体系中，不同 的蛋白酶需要最佳 pH 值存在不同，且 不同的重组蛋白对蛋白酶的耐受性有差 异，因此选择适当的发酵 pH 值不仅不 影响细胞的生长，还能降低蛋白酶活性 甚至灭活，减少目的蛋白的降解。Xue 等 [20] 研究发现，pH 值在 5.8 ～ 8.0 的 范围内，真菌免疫调节蛋白 LZ-8 蛋白 表达量随 pH 值上升而提高，且 pH 值 到 8.0 时， 蛋白表达量达到峰值。另外， Zhao 等 [21] 研究结果表明，即使对于同 一工程菌，它的菌种生长阶段和表达阶 段的最适 pH 值也不一样。
4 小结
自上个世纪的 60 年代，人们发现 可以利用甲醇为唯一碳源和能源生长的 酵母以来，它们不仅因能够生产单细胞 蛋白作为动物饲料的潜力而引起了广泛 关注，还可以通过其克隆表达外源蛋白 而被广泛利用。如今，毕赤酵母由于在 基因克隆和表达中具有明显的优点而被 广泛应用于医药领域和动植物生产。但 是其也存在一些不足，如发酵周期较 长 ；甲 醇 具 有 易 燃 易 爆 以 及 有 毒 性， 在生产中存在危险性 ；培养基和培养 条件不太成熟等。但是，随着人们对 其不断的研究和优化条件，减少其存在 的不足，提高其生产效率，将更加广泛 地应用于生产。
[3] D E M A I N A L , V A I S H N A V P ． Production of recombinant proteins by microbes and higher organisms[J].Biotechnology Advance,2009,27(3):297-306． [4] P F E F F E R J , R I C H T E R S , NIEVELER J, et al．High yield expression of lipase A from Candida antarctica in the methylotrophic yeast Pichia pastoris and its purification and characterisation[J]. Applied Microbiology and Biotechnology,2006,72(5) : 931-938． [5] ZHANG A L, ZHANG T Y, LUO J X, et al．Inducible expression of human angiostatin by AOXI promoter in P．pastoris using high-density cell culture[J].Molecular Biology Reports,2009,36(8):2265-2270． [6] JIN F L, XU X X, YU X Q, et al．Expression and characterization of antimicrobial peptide CecropinAD in the methylotrophic yeast Pichia pastoris[J].Process Biochemistry, 2009,44: 11-16． [7] H A R T N E R F S , G L I E D E R A ． Regulation of methanol utilisation pathway genes in yeasts[J]. Microbial Cell Factories,2006,5:39． [8] YU P．A new approach to the production of the recombinant SOD protein by methylotrophic Pichia pastoris[J].Applied Microbiology and Biotechnology,2007,74(1):93-98． [9] G H A F F A R A , K H A N S A , MUKHTAR Z, et al．Heterologous expression of a gene for thermostable xylanase from Chaetomium thermophilum in Pichia pastoris GS115[J]. Molecular Biology Reports,2011,38（5）:3227-3233. [10] 吕中原，钱江潮， 储炬，等 . 同时利用 AOX1 和 GAP 启动子表达 SAM 合成酶 促进重组毕赤酵母中 S- 腺苷甲硫氨酸 积 累 [J]. 工 业 微 生 物，2008，38（4） ： 24-30. [11] LIN-CEREGHINO J, HASHIMOTO M D, MOY A, et al. Direct selection of Pichia pastoris expression strains using new G418 resistan cevectors[J]. Yeast, 2008, 25 (4) : 293- 299. [12] YANG L,AN X,WEI F,et al． E x p r e s s i o n a n d p u r i f i c a t i o n o f recombinant human interleukin-18 protein using a yeast expression system[J].Protein Expression and
影响外源基因在巴斯德毕赤酵母中的表达
影响外源基因在巴斯德毕赤酵母中的表达摘要要在一种宿主表达系统中成功表达外源蛋白并获得较高产量，必须要较为全面地了解影响其表达的诸多因素。
影响外源基因在巴氏毕赤酵母中表达的因素主要包括：外源基因的特性、表达框的染色体整合位点和方式、宿主菌的甲醇利用表型、基因剂量、分泌信号、产物稳定性和翻译后修饰等。
本文就这些因素进行分析，并提出一定的对策和建议。
酵母菌是单细胞真核生物，具有生长快、易于遗传操作、能对外源蛋白进行翻译后加工和修饰、不产生有毒产物等特点，被认为是表达外源蛋白的合适宿主。
几种工业酵母尤其是巴氏毕赤酵母(pichia pastoris, Pp)，因具有旺盛的生长力以及其它一些独特的性质，已发展成为较成熟的蛋白生产的表达系统。
已有许多细菌、真菌和高等动植物的基因在Pp中成功表达(如破伤风毒素片段Ｃ，12g/L)，但也有许多蛋白的表达量并不理想(如多瘤病毒大T抗原，0.5mg/L)，甚至不能表达(如HIV表面糖蛋白)。
另外，酵母表达系统的局限性还在于分泌产物的不均一性，包括聚合体的存在、信号肽加工不完全以及内部降解等现象。
所有这些都提醒我们在Pp中表达外源蛋白时，应周密考虑影响其表达的各个因素。
1、外源基因特性外源基因在Pp中表达时，其自身就是影响表达水平的重要因素。
不同的培养基配方、发酵参数和饲养方案主要是通过提高细胞绝对总数而并非单个细胞产率来提高外源蛋白的产量。
Fahnestock等发现随着外源的蛛牵拉丝蛋白基因拷贝数的增加，其生产效率会相对有所降低。
另外，许多高A+T含量的基因常会由于提前终止而不能有效转录引;不合适的mRNA5'非翻译区的核苛酸序列和长度也可能会便基因的表达不尽如人意。
提前终止被认为是一种具有种属特异性的现象，譬如在Pp中不能表达的HIV ENV蛋白在啤酒酵母中却表达良好。
因此，可以通过调整高A+T含量区的核甘酸组成来避免提前终止的发生。
而Sreekrishna 等通过调整人血清白蛋白(human serum albumin，HSA)的mRNA5'非翻译区与醇氧化酶(alcohol oxidase 1，AOX1)的5'非翻译区相同后，HSA的表达量可以提高50倍以上。
影响外源基因在巴氏毕赤酵母中表达的因素
影响外源基因在巴氏毕赤酵母中表达的因素
李欣;郭树华
【期刊名称】《生物技术通讯》
【年(卷),期】2000(011)002
【摘要】要在一种宿主表达系统中成功表达外源蛋白并获得较高产量,必须要较为全面地了解影响其表达的诸多因素.影响外源基因在巴氏毕赤酵母中表达的因素主要包括:外源基因的特性、表达框的染色体整合位点和方式、宿主菌的甲醇利用表型、基因剂量、分泌信号、产物稳定性和翻译后修饰等.本文就这些因素进行分析,并提出一定的对策和建议.
【总页数】4页(P132-134,140)
【作者】李欣;郭树华
【作者单位】山东医科大学免疫学教研室,济南,250012;军事医学科学院放射医学研究所,北京,100850
【正文语种】中文
【中图分类】Q81
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