毕赤酵母表达外源蛋白糖基化研究进展
毕赤酵母N_糖基化改造的研究进展
毕赤酵母N 糖基化改造的研究进展张 倩,宋海峰(军事医学科学院放射与辐射医学研究所药理毒理研究室,北京100850)[摘要] 毕赤酵母表达系统具有诸多优点,广泛用于生产重组蛋白。
由于其糖基化途径与人不同,表达的糖蛋白为高甘露糖型,改变了糖蛋白的结构,影响其特性和功能,且具有免疫原性,限制了以毕赤酵母为表达系统大量生产重组蛋白的应用。
在过去的20多年里,很多研究集中在毕赤酵母N 糖基化人源化改造研究上,希望产生类人的糖链结构,但进展缓慢。
近期,毕赤酵母N 糖基化改造研究已经取得了重大进展,产生了类人的末端为唾液酸的糖链结构,为应用毕赤酵母表达系统大量生产重组蛋白铺平了道路。
现对毕赤酵母N 糖基化的研究进展进行简述。
[关键词] 毕赤酵母;N 糖基化;糖蛋白[中图分类号]Q513.2;R915.2 [文献标识码]A [文章编号]1003-3734(2008)14-1206-03 Advances i n the asparagi nes li nked glycosyl ati on i n Pichi a pastorisZ HANG Q ian,SONG H a i feng(Depart m ent of Phar m aco logy and Toxico logy,Institute of Rad i a tion M ed icine,A cade my of M ilitar y M e d ical Sciences,B eijing100850,Ch i n a)[Abstract] W ith m any advantages,P ichia pastoris is w i d ely used to pr oduce reco m binan t pro teins.Due to t h e differences i n N g l y cosylati o n pathw ay bet w een P ichia pastoris and hum an,the struct u re o f h i g h m annose g lycan of P ichia pastoris w as changed,the characterization and functi o n o f t h e glycopro teins,or even i m munogen ic w ere af fected.The applicati o n of P ichia pastoris to produce g l y coprote i n s w as li m ited.I n the past t w o decades,m any re searches focused on the m od ificati o n of N glycosylati o n to obtai n hum an li k e glycopro teins,yet got li m ited success. Rencently,great advance m ents have been m ade to produce hum anized sia l y lated gycopro teins,w hich paved t h e w ay to use P ichia pastoris as host to produce reco m b i n ant pro teins.Th is rev i e w summ arizes the re levant researches.[Key w ords] P ichia pastoris;N g l y cosy lati o n;glycopr o te i n毕赤酵母(P ichia pastoris)表达系统是20世纪80年代初期发展起来的一种新型的外源蛋白表达系统,它既具有原核表达系统操作简易、易于培养、生长速度快、表达量高、成本低等优点,还具有真核生物表达系统的对外源蛋白的翻译后修饰等特点,如糖基化、蛋白磷酸化等。
巴斯德毕赤酵母表达外源蛋白的研究进展
达 系统 。具 有 比 哺乳 动 物 细 胞 易 于 进 行 遗 传 操 这 主要 归功 于毕赤 酵母 具有 的其 他 表达 系 统不 可
比拟 的优点 ： 具有 目前 最强 ， 调控 机 理最 严 格 的启 动子一 醇 氧化 酶 Ａ Ｘ Ｏ １基 因启 动子 ， 格 调 控外 严
缺乏转 录后 加工 修饰 的缺 陷 ， 弥补 酿 酒 酵 母 缺 乏
系统 的 起 源 、 物 学特 性 、 合 蛋 白的 表 达 以及 影 响 蛋 白表 达 量 的 因 素 。 生 融
关 键 词 毕 赤 酵 母 ； 物 学特 性 ； 白表 达 生 蛋
中图分类号 Ｔ ９６ Ｑ ２ 文献标识码 Ａ 文 章 编 号 １０ ７ ２ （ ０７ ０ ０ ７ ０ ０ ５－ ０ １ ２０ ）６— ０ ２— ５
Ａｄ ａ ｃ ｎ ｔ ｅ Ｒｅ ｅ ｒ ｈ ｏ ｒ ｉ ｎ Ｐｒ ｔ ｉ ｐｒ ｓ ｉ ｎ ｏ ｃ ｉ ｓｏ ｖ ｎ ｅ ｉ ｈ ｓ ａ ｃ ｆ Ｆｏ ｅ ｇ ｏ ｅ ｎ Ｅｘ ｅ ｓｏ ｆＰｉ ｈ ａ ｐａ ｔ ｒ
Ｌ Ｇ ｉ ｇ ＯＮ Ｊｎ ，ＤＵ Ｌ － ｉ ｉ ｎ ｘ
物 的转 录后调 控 机 制 ， 如蛋 白 酶加 工 、 叠 、 硫 折 二
ｔｉ ａ ｅ ，ｔ ｅ ａ ｖ ｎｃ ｎ ｏｉ ｉ ｈ ｓ ｐ ｐ ｒ ｈ ｄ ａ ｅｉ ｒｇｎ，ｂ ｏｏ ｉ ａ ｈ ｒ ｃｅ ｉｔｃ ，ｆ ｓｏ ｒ ｔｉ ｘ ｒ ｓ ｉｎ ｏ ｈｅ ｓ ｓｅ ａｎ ｈｅａ ｓ ｃａｅ ｉｌ ｇｃ ｌｃ ａ ａ ｔｒｓｉ ｓ ｕ ｉｎ ｐ ｏｅ ｎ ｅ ｐ ｅ ｓｏ ｆｔ ｙ ｔｍ ｄ ｔ ｓ ｏ ｉｔｄ
密 度发 酵 ， 源 蛋 白表 达 量 高 ； 在 过 氧 化 物 酶 外 存
工 ， 赤酵母 表 达 系 统 在 国 内外 已经 引 起 了高 毕 度重视， ２０ 到 ０ ５年 止 ， 经有 ５ ０ 多种 蛋 白在 该 已 ０ 系统 中进行 了表 达 。
毕赤酵母中高效引导外源蛋白分泌的信号肽的研究
毕赤酵母中高效引导外源蛋白分泌的信号肽的探究毕赤酵母被广泛应用于外源蛋白的表达和分泌，但其分泌机制依旧存在瓶颈。
信号肽作为外源蛋白分泌的关键信号，可以增进蛋白的正确折叠和定位。
本探究合成了多个信号肽并测试了其诱导外源蛋白分泌的效果。
结果显示，其中一个信号肽在毕赤酵母中具有高效的引导外源蛋白分泌的作用，并可提高外源蛋白的表达量。
这一探究为毕赤酵母外源蛋白分泌的机制探究和工业应用提供了新思路。
关键词：毕赤酵母、信号肽、外源蛋白分泌、表达、折叠定位正文：引言毕赤酵母是一种广泛应用于外源蛋白表达和分泌的真菌，其工业用途广泛，包括生产酶、生物肥料、食品添加剂等。
外源蛋白的表达和分泌是毕赤酵母应用的基础，因此其分泌机制的探究具有重要的理论和应用价值。
信号肽被认为是蛋白在细胞内穿过细胞膜从而被分泌到细胞外所必需的关键信号。
近年来，通过信号肽的调控已经在多种真菌中实现了外源蛋白的高效表达和分泌。
因此，寻找高效的信号肽，探究其引导外源蛋白分泌的机制，具有重要的应用前景。
材料和方法合成了11种可能具有对毕赤酵母分泌效果的信号肽，并转化到毕赤酵母中。
以GFP作为模型蛋白，不同信号肽在GFP表达和分泌过程中的诱导效果进行比较。
同时，测定了其中一个信号肽对外源蛋白表达量和分泌量的影响，并通过Western blot分析外源蛋白的分泌效果和分泌途径分析来探究信号肽的作用机制。
结果在11种信号肽中，有一个信号肽（称为SgPEP1）能够显著增加GFP的分泌效率，同时提高了外源蛋白的表达量。
Western blot和分泌途径分析显示，SgPEP1作用于胞内和胞外蛋白的定位和折叠，增进蛋白正确地进入胞外。
谈论本探究中发现的SgPEP1信号肽在毕赤酵母外源蛋白表达和分泌中具有高效的引导作用，这为改善毕赤酵母的表达和分泌效率提供了新思路。
在信号肽的机理探究中，需要进一步探究其在外源蛋白折叠中的作用方向和机制，以便更好地控制蛋白的定向和拓扑。
毕赤酵母表达研究进展
利用强效可调控启动子AOX，已高效表达了HBsAg、TNF、EGF、破伤风毒素C片段、基因1工程抗体等多种外源基因［11、12、13］，证实该系统为高效、实用、简便，以提高表达量并保持产物生物学活性为突出特征的外源基因表达系统，而且非常适宜扩大为工业规模［14］11. 彭毅，杨希才，康良仪。
影响甲醇酵母外源蛋白表达的因素。
生物技术通报2000，4：33-3612. 11 3 Cregg JM . Tschopp JF Stillman C, et al .High-level expression and efficient assembly of hepatitis B surface antigen in the methylotrophic yeast pichia.pastoris Bio/Technology,1987,5:479-48513. Sreekrishma K , Nelles L ，Potenz R，et al .High-level expression ,purification ,and characterization of recombinant human tumor necrosis factor synthesized and characterization in the methylotrophic yeast pichia .pastoris ,Biochemistry ,1989,28:4117-412514. Siegel RS , Buckholz RG, Thill GP , et al .Production of epider growth factor in methylotrophic yeast cells, International Patent Application ,1990 ,Publication No:WO90/10697毕赤酵母是甲醇营养型酵母，可利用甲醇作为其唯一碳源。
毕赤酵母工程菌高密度发酵的研究进展_夏姗
毕赤酵母工程菌高密度发酵的研究进展夏姗1,2，武福军2,3，赵洪亮2，薛冲2，刘志敏21.安徽大学生命科学学院，安徽合肥230039；2.军事医学科学院生物工程研究所，北京100071；3.山西康宝生物制品股份有限公司，山西长治046000［摘要］近年来毕赤酵母已成为一种优越的异源蛋白表达系统。
而提高目的蛋白的表达水平，高密度发酵已成为关键技术环节之一。
我们从毕赤酵母工程菌的选择、培养基的优化设计，以及发酵工程过程控制等方面简要阐述毕赤酵母的高密度发酵，并提出了工程菌在高密度发酵过程中存在的问题。
［关键词］毕赤酵母工程菌；高密度发酵；培养基优化；发酵过程控制［中图分类号］Q78［文献标识码］A［文章编号］1009-0002（2013）01-0109-04Progess of Pichia pastoris Engineering Bacteria on High-Density Fer⁃mentationXIA Shan 1,2,WU Fu-Jun 2,3,ZHAO Hong-Liang 2,XUE Chong 2,LIU Zhi-Min 2*1.School of Life Science,Anhui Uniservity,Hefei 230039;2.Beijing Institute of Biotechnology,Beijing 100850;3.Shanxi Kangbao Biological Product Co.Ltd,Changzhi 046000;China*Corresponding author,E-mail:liuzhm@［Abstract ］Pichia pastoris has been utilized widely as an excellent heterologous gene expression system recently.High-density fermentation has been a key technique tache to improve the expression level of the protein of inter ⁃est.In this paper,we expounded the choose of engineering bacteria,designation and optimization of culture medi ⁃um,and control of fermentation course to increase P.pastoris on high-density fermentation.Moreover,the questionsexisting in industry high-density fermentation were put forward.［Key words ］Pichia pastoris ;high-density fermentation;optimization of culture medium;control of fermentationcourse综述doi:10.3969/j.issn.1009-0002.2013.01.02620世纪80年代以来，随着生物技术药物在人类疾病治疗和预防中的广泛应用，大大加速了微生物细胞表达产品的产业化进程。
毕赤酵母表达系统研究进展
毕赤酵母表达系统研究进展马银鹏;王玉文;党阿丽;孔祥辉;张介驰【摘要】毕赤酵母是外源蛋白表达的一种重要宿主.毕赤酵母表达系统既具有原核表达系统操作简单、价格低廉、生产率高的优点,又具有真核表达系统能对表达后的蛋白折叠、糖基化和形成二硫键等翻译后进行加工和修饰的功能,因此毕赤酵母表达系统具有广泛的应用前景和重要的研究价值.本研究对毕赤酵母表达系统的特点、组成、影响外源基因高效表达的影响因素等进行总结.【期刊名称】《黑龙江科学》【年(卷),期】2013(004)009【总页数】5页(P27-31)【关键词】毕赤酵母;表达系统;外源蛋白;甲醇【作者】马银鹏;王玉文;党阿丽;孔祥辉;张介驰【作者单位】黑龙江省科学院微生物研究所,哈尔滨150010;黑龙江省科学院微生物研究所,哈尔滨150010;黑龙江省科学院微生物研究所,哈尔滨150010;黑龙江省科学院微生物研究所,哈尔滨150010;黑龙江省科学院高技术研究院,哈尔滨150020;黑龙江省科学院微生物研究所,哈尔滨150010;黑龙江省科学院高技术研究院,哈尔滨150020【正文语种】中文【中图分类】Q815大肠杆菌(Escherichia coli)表达系统由于其具有遗传背景和生化特性清楚、成本低廉、操作简便、生产效率高等优点最早被采用作为外源基因表达系统。
但大肠杆菌表达系统缺少真核生物的蛋白翻译后进行加工和修饰的功能，表达的蛋白大部分以包含体形式存在，且需要经过复杂的复性才能恢复构象和活性以及背景杂蛋白较多[1］，为克服这些缺点，人们于1979年开发了酵母表达系统。
酵母是单细胞低等真核生物，既具有原核生物细胞生长速度快、容易培养、操作简单等优点，又具有真核生物表达时对蛋白质的加工和修饰等功能。
因此相对于原核表达系统表达出的不具有活性的蛋白，酵母表达出的蛋白是具有生物学活性的，而且酵母表达系统比其他真核表达系统如昆虫、哺乳动物组织等表达系统快速、简便、成本低[2］。
毕赤酵母表达蛋白质的糖基化
α32岩藻糖化增强,许多乳房肿瘤丧失了Le b抗原的表达,这和疾病的恶性程度和转移性相关。
乳房癌组织中S Le x也有增加。
3.肿瘤转移O2G alNAc聚糖结构对肿瘤转移的形成是很关键的。
对肝癌细胞株P LC/PEF/5的研究表明含大量核心1、核心2结构的O2G alNAc聚糖与一种新型的肿瘤相关抗粘附素(dysadherin)结合,抑制了抗粘附素的稳定表达并导致E2钙粘蛋白表达上调。
结果促进了细胞之间的粘附作用,促进了肿瘤转移[1]。
在各种人类结肠癌细胞中,K M12细胞表达与粘蛋白链结合的二聚S Le x,表现出高度转移性。
K M122HX细胞表达S Le a抗原,结果较无S Le a表达的K M122LX细胞表现出更强的粘附能力[10]。
抑制唾液酸化可以减弱肿瘤细胞的转移能力。
以上这些表明,唾液酸化链可能调节肿瘤细胞和其他细胞以及细胞基质之间的相互作用、影响肿瘤细胞的粘附和抗粘附性并延长其在血液中的生存期。
参考文献[1] Tsuiji H et al.G lycobiology,2003,13(7):521—527[2] Seko A et al.G lycobiology,2002,12(6):379—388[3] Schneider F et al.Cancer Res,2001,61:4605—4611[4] W ang F et al.J Histochem Cytochem,2001,49:1581—1592[5] M eichenin M et al.Cancer Res,2000,60:5499—5507[6] Seko A et al.G lycobiology,2000,10(9):919—929[7] M are L et al.Eur J Biochem,2004,271:186—194[8] M achida E et al.Cancer Res,2001,61:2226—2231[9] Dalziel M et al.J Biol Chem,2001,276(14):11007—11015[10] Ota M et al.Cancer Res,2000,60:5261—5268 文章编号:100021336(2004)0420353203毕赤酵母表达蛋白质的糖基化顾 园 诸欣平 王少华(首都医科大学寄生虫学教研室,北京100054)摘要:毕赤酵母表达系统可对表达产物进行翻译后加工如糖基化等。
毕赤酵母蛋白表达系统研究进展
P． pastoris 是甲醇营养型酵母中的一种，可以在 含有甲醇的培养基上快速生长。与其他蛋白表达系
收稿日期： 2010-11-02 基金项目： 福建省科技厅资助项目（ 2009N0032） ，福建省教育厅资助项目（ JA08041） 作者简介： 杨梅，女，博士，教授，研究方向： 生物化学与分子生物学； E-mail： myang@ fjnu． edu． cn
3 外源蛋白的表达及其影响因素
目前，毕赤酵母蛋白表达系统在国内外应用都 很广泛，已成功表达许多外源蛋白。但由于毕赤酵 母本身仅分泌少量蛋白，因此外源蛋白占培养基中 总蛋白的绝大多数。有些外源蛋白的表达量可达到 g / L 以上水平，如 Hao 等［27］成功表达的重组人复合 α-干扰 素 （ cIFN） 的 表 达 量 达 到 1． 24 g / L； Huang 等［28］表达的截短的 1，3-1，4-β-D-葡聚糖酶的表达 量为 3 g /L。虽然许多外源蛋白都可以在毕赤酵母 中高效表达，但仍然有些蛋白表达量相对较低或不 表达，在同一表达系统中表达不同的外源蛋白，其表 达量千差 万 别，外 源 蛋 白 的 表 达 受 多 方 面 因 素 的 影响。 3． 1 外源基因自身的内在特性
母属（ Candida） 和汉逊酵母属（ Hansenula） 等。毕赤 酵母（ P． pastoris） 作为甲醇酵母的一种，是单细胞低 等真核生物，已发展成为广泛应用的表达宿主。与 其他表达系统相比，毕赤酵母具有不可比拟的优势， 其既有原核生物繁殖快、易于培养、培养基廉价和试 验过程简单可行等特点，又具有强有力的启动子，还 可以对外源蛋白进行加工折叠和翻译后修饰，具备 了典型的真核生物表达体系的特点。毕赤酵母表达 系统已发展成为一个较为理想的蛋白表达系统，被 国内外广泛应用于生产外源蛋白。目前，已有 500 多种外源蛋白在该表达系统中获得表达［4］。
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毕赤酵母表达外源蛋白糖基化研究进展杨婕【摘要】Pichia pastoris as the host for the expression of recombinant proteins, has not only the advantages of prokaryotic expression system such as inexpensive in culture, ease of genetical manipulation, high levelsof protein expression, but also has post-translational protein processing capabilities like other higher eukaryotes such as protein folding, formation of disulfide bond and glycosylation. Gly-cosylation is an important form of posttranslational modification in secreted proteins and affects the structure and function of these pro-teins. In this review, we discuss protein glycosylation and humanized glycosylation engineering in Pichia pastoris.%毕赤酵母作为表达外源蛋白的宿主，不仅具有原核生物表达系统的优点，如培养成本低、遗传操作简单、表达效率高等，还可以对表达的外源蛋白进行翻译后修饰加工，如蛋白质折叠、二硫键形成和糖基化等，因而有其独特的优势。
在分泌蛋白修饰中，糖基化是一种重要修饰方式，影响蛋白的结构与功能。
本文就毕赤酵母对表达的分泌蛋白进行糖基化修饰及糖基人源化改造研究进展进行综述。
【期刊名称】《福建畜牧兽医》【年(卷),期】2014(000)002【总页数】3页(P20-22)【关键词】毕赤酵母;O-糖基化;N-糖基化;糖基人源化【作者】杨婕【作者单位】福建师范大学生命科学学院福州 350108【正文语种】中文由于生物体天然表达的蛋白量都比较低，从中提取蛋白质进行结构、功能研究或临床应用难度很大，因此，越来越多的生物学家选择重组表达进行研究或临床应用。
目前已有许多从不同表达系统中表达的重组蛋白被批准可以用于人的治疗，包括红细胞生成素，凝血因子和单克隆抗体等[1]。
外源基因的表达系统有原核和真核表达系统两大类，原核表达系统以E.coli应用得最多，真核表达系统主要有哺乳动物细胞表达系统、昆虫表达系统、酵母表达系统等。
毕赤酵母中近年发展起来的应用最为广泛的真核表达系统之一，原因在于毕赤酵母表达系统兼具原核表达系统和高等真核生物表达系统如昆虫细胞或CHO细胞特点。
表现为培养成本低，遗传操作简单，表达效率高，对表达的外源蛋白进行翻译后加工和修饰[2]。
自从投入商业化使用之后，毕赤酵母表达系统表达的外源蛋白的表达种类逐年增多，2006年已经有600多种的外源蛋白成功表达[3-5]。
但其对蛋白的糖基化修饰与高等真核生物相比有显著的不同，这可能会影响在其系统中表达的高等真核生物蛋白的结构和功能[6]。
本文就毕赤酵母对表达的分泌蛋白进行糖基化修饰及糖基人源化改造研究进展进行简要综述。
常见的外源基因表达系统有原核生物表达系统和真核生物表达系统。
原核生物表达系统是最早开发利用的表达系统，它的成本低，生活周期短，表达量高，容易培养等特点，但不能对表达的蛋白进行修饰。
真核生物表达系统主要有哺乳动物细胞表达系统，昆虫细胞表达系统，酵母表达系统。
目前开发出的酵母表达系统有两个--酿酒酵母和毕赤酵母表达系统，由于毕赤酵母在以下方面优于酿酒酵母而得到越来越多的应用：在发酵时不产生大量的酒精、有很强的诱导型启动子AOX1和糖基化修饰时添加的糖链比酿酒酵母来得短[7]。
不同的表达系统有其各自优势与局限性，在实际应用中应综合权衡各种因素，最终选择最适的表达系统（见表1）。
很多哺乳动物的天然蛋白质是经过糖基化的，所以为了保证重组蛋白的生物学活性进行正确的糖基化过程是很必要的[8]。
毕赤酵母对分泌的蛋白也会进行糖基化修饰，其生物学过程较为复杂。
根据糖链与蛋白质氨基酸残基上基团连接类型的不同，可以分为O-连接糖链与N-连接糖链。
O-糖链指的是寡糖与赖氨酸或脯氨酸的羟基相连，N-糖链指的是糖基与多肽链结构上的天冬酰胺-X-丝氨酸/苏氨酸（X为除脯氨酸以外的任何一种氨基酸）基序上的天冬酰胺相连。
2.1 O-糖基化和其他的酵母和真菌一样，毕赤酵母能将糖链连接到蛋白质苏氨酸或者丝氨酸上的羟基上。
毕赤酵母添加的寡糖只有甘露糖残基，更加高等的真核生物，例如哺乳动物，这些寡糖组成就有更加多变的糖结构包括N-乙酰氨基半乳糖，半乳糖和唾液酸。
不仅在糖链的组成上，在对糖基化蛋白选择上，毕赤酵母与高等真核生物也有很多不同，如有些蛋白在天然宿主中并不会被糖基化，但是毕赤酵母却能糖基化这些异源蛋白。
而有些蛋白在天然宿主中被糖基化，但在毕赤酵母中或许没有在丝氨酸和苏氨酸上糖基化它[9]。
毕赤酵母O-糖基化的程度已经在Aspergillus awamori葡糖糖化酶催化结构域上进行了研究[10]。
在毕赤酵母中分泌的葡糖糖化酶催化结构域的分子量比天然蛋白大20 kDa左右，分析表明大约有10 kDa由于N-糖基化，剩余的10 kDa由于O-糖基化，可能由20～30个甘露糖残基组成。
Mochizuki等在毕赤酵母表达人抗凝血酶Ⅲ，和天然的抗凝血酶Ⅲ相比，O-糖基化导致重组蛋白活性被抑制一半[11]。
这些研究结果表明由于毕赤酵母O-糖基化修饰与哺乳动物存在较大的差异，可能会对分泌蛋白活性产生严重的影响。
目前毕赤酵母对分泌蛋白进行O-糖基化修饰还不是很清楚。
2.2 N-糖基化N-连接糖基化有一个信号序列，其序列为Asn-Xaa-Ser/Thr。
研究发现这个信号序列对于N-连接的糖基化是必要的，但不总是充分的[12]。
毕赤酵母表达的外源蛋白蛋白质N-糖基化修饰起始于内质网。
葡萄糖、甘露糖、半乳糖、N-乙酰氨基葡萄糖与磷酸多萜醇形成一个共同的脂多糖前体Glc3Man9GlcNAc2，然后该前体被转运至新生肽链Asn-Xaa-Ser/Thr保守序列的天冬酰胺残基上。
随后在葡萄糖苷酶Ⅰ和Ⅱ的作用下切除三个葡萄糖残基，接着被内质网甘露糖苷酶Ⅰ切除一个甘露糖，形成Man8GlcNAc2结构[13]。
然后携带Man8GlcNAc2糖基的蛋白被转运到高尔基体，在ɑ-1,6-甘露糖基转移酶的作用下，ɑ-1,3-甘露糖分支末端添加一个甘露糖[14-15]，其他的甘露糖转移酶和磷酸甘露糖转移酶特异的识别此糖链结构，继续向上添加甘露糖和磷酸甘露糖，形成高甘露糖结构[16]。
甘露糖残基在毕赤酵母中一般为8～14个。
酿酒酵母则会增加更多的甘露糖，可高至40～150个，并且还会有α-1，3-甘露糖糖苷键，这大大增加了蛋白的免疫原性。
而在人类中则修去多余的甘露糖，加上半乳糖和唾液酸等其他的单糖形成复合多糖(complex glycan)。
在形成核心寡聚糖Man8GlcNA2后，哺乳动物和毕赤酵母中N-Man8GlcNA2聚糖的生物合成路径开始不同。
人开始卸载甘露糖残基，酵母和其他的真菌则添加甘露糖残基。
毕赤酵母的N-糖基化和哺乳动物与人的糖基化过程差异明显，容易形成以高甘露糖链为主的过度糖基化修饰，会引起免疫反应，限制了它作为药物蛋白使用。
因此对毕赤酵母糖基化过程进行改造是非常必要。
研究如何使毕赤酵母表达的蛋白具有与人相同或相似的糖基化是一项目非常有意义的工作。
做这项工作时研究人员的思路是利用基因工程手段往毕赤酵母中导入人类糖链加工基因，使得毕赤酵母能对其产生的糖链进行类似于人类细胞中的加工，产生的糖链与高等哺乳动物产生的糖链相同或相似，这项工程也被称之为糖基人源化工程（humanized glycosylation engineering）[1,17-21]。
第一：通过敲除或是使ɑ-1，6-甘露糖基转移酶基因（OCH1基因）失活：ɑ-1，6-甘露糖基转移酶可以将甘露糖添加到Man8GlcNA2寡糖链的ɑ-1，3连接的寡糖臂上从而形成Man9GlcNA2，然后甘露糖基转移酶继续添加甘露糖，导致有另外30多个甘露糖残基的多聚体的形成[16]。
因此为了避免酵母的高甘露糖现象，可以通过敲除或是使OCH 1基因失活来阻止ɑ-1，6-甘露糖的延伸。
第二：引入ɑ-1，2-甘露糖苷酶Ⅰ，进行降解甘露糖。
Davidson等发现敲除ALG3基因，可以达到引入ɑ-1，2-甘露糖苷酶Ⅰ同样的效果[22]。
酵母糖基人源化最后一步将唾液酸转移到复合的糖蛋白的末端β-1，4-半乳糖。
这一步是酵母糖基人源化最重要的一步。
最早开始在毕赤酵母中开展这项研究的是Callewaert等，他们共表达了Trichoderma reesei 1，2-alpha-D-mannosidase和二个糖蛋白influenza virus hemagglutinin及trypanasoma cruzi trans-sialidase基因。
结果表明，分泌的外源蛋白高甘露糖链明显减少，而类似人类中的甘露糖链Man5GlcNac2是糖蛋白中的主要糖链。
Callewaert等研究工作表明糖基化改造在毕赤酵母中是一条可行的方案，并开创了毕赤酵母糖基人源化的先河。
Hamilton S R等在糖基人源化方面进行了大量的卓有成效的研究。
2006年Hamilton S R等又通过敲除4个酵母特异性糖化基因，导入14个外源基因，使得改造后的工程菌90%以上的复合糖蛋白末端都被唾液酸化（sialylation），并且在用糖基化改造过的工程菌表达人源化的IgGs时得到证明[23]。
1993年毕赤酵母作为外源蛋白表达系统投入商业化以后，越来越受到欢迎，目前在该系统中已成功表达了众多蛋白。
虽然毕赤酵母表达系统有众多优点，但还有许多需要改进的地方。
除了本文提到的糖基化改进外，在蛋白折叠、分泌通道中的囊泡转运、前体蛋白加工、密码子偏好、信号肽等方面将是重点要考虑的地方。
今后随着各方面的改进，毕赤酵母作为外源蛋白表达系统的优势将变得越来越明显。
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