应用WAVE生物反应器快速生产临床级别的T淋巴细胞
5-2ReadyToProcess一次性生产平台缩短轮换准备周期从而
ReadyToProcess 一次性生产平台缩短轮换准备周期从而提高产能
Ingemar Daniels，产品经理，GE Healthcare，Uppsala，Sweden Kristoffer Hansson，细胞培养和纯化经理，CMC Biologics，Copenhagen，Denmark Sandeep Kristiansson，细胞培养和纯化首席科学家，CMC Biologics，Copenhagen，Denmark
增加 30%产能
由于一次性使用产品可减少耗时的辅助准备步骤，从而能有效地提高产品产能（表 1 和 2）。 对于一个生产计划为 49 周（3 周用于维修和校正）的厂房以及每批 14 天生产周期而言，去 除清洗步骤意味着批间轮换准备时间从原来的 7 天缩减至 4 天，这使得每年生产的批次数量 从原来的 16 次增加至 19 次。而对于每批 7 天的生产周期而言，同样的缩减准备时间将使得 每年的最大批次数量从 24 增至 31，厂房产能增加 30%。（图 2）
行为
制定清洗方案
Campaign equipment rationale 包括设备清 洁理由和清洁标准等 设备安装 使用前清洁
柱填装和理论塔板数 检测 不同批次间清洗 取样准备 卸柱，更换备用部件 使用后清洗以及使用 后取样
QC 分析质控
预测所需 时间 1天
0.5 天
0.5 天 0.5 天 1天 0.5 天 1-2 小时 1天 1天
பைடு நூலகம்介绍
CMO 合同制造商或多品种的新药研发和临床生产平台常常受到紧张的项目时间限制，需要在多个生产线上 进行多个产品的快速 GMP 生产。清洗是浪费宝贵生产时间的一个重要因素。经过丹麦 CMC Biologics 公司 研究认定，ReadyToProcess™一次性生产平台可通过减少清洗步骤而增加设备用于有效生产的时间，提高厂 房设备利用率，有效增加产能。因此 ReadyToProcess™技术可以增加现有厂房的产出，实现多品种的高通 量快速临床生产，缩短生物药品上市周期，从而实现良好的经济回报。
WAVE细胞培养手册原理和方法
7
ห้องสมุดไป่ตู้
除免疫 T 淋巴细胞外，WAVE 反应器还适合骨髓间充质干细胞(mesenchymalstromal /stem cells, MSCs) 等贴壁治疗性细胞的规模培养。骨髓间充质干细胞(MSCs) 需要贴壁到合适的表面以进行扩增，通常使用大 量 T 型瓶进行培养，属于劳动密集型操作，需要较大的存储空间。Linnea Pauler 等人的研究表明，WAVE 微载体细胞培养和 T 型瓶的细胞生长速度相似。然而，WAVE 微载体培养可以提供更大的可贴附表面积， 细胞密度得以提高，因此获得同样数量贴壁细胞所需的培养基体积仅为常规 T 型瓶培养系统的一半，有效 降低培养基的成本。从操作上讲，使用 WAVE 反应器时，约 80 个 T 型瓶可以被减少为一个 WAVE 培养袋， 操作非常简便，劳动强度显著降低。
酵等多种培养体系，成为未来细胞培养的发展方向。
WAVE2/10
WAVE 20/50
WAVE 使用预先消毒的细胞培养袋，在精细控制的可加热的摇动平台上，自动反馈控制培养温度、 pH、溶氧和压力等参数，实现细胞培养过程的自动化精密控制。相比搅拌罐生物反应器，WAVE 生物反应 器使用温和高效的波浪混合方式（见上图），避免搅拌桨和鼓泡对细胞剪切力伤害的同时，显著提高体积 传氧系数(kLa >50 hr-1)，使得细胞状态更好，生长速度快密度高，表达蛋白性质均一，易于操作和放大，避 免使用消泡剂。
为了实现贴壁细胞的规模化培养，GE 公司(原法玛西亚)开发了世界上首个细胞培养微载体产品，在微 载体细胞培养方面积累了近 50 年的经验：Cytodex球形微载体，为细胞提供更大的细胞贴附表面，避免使 用多个 T 型瓶的简单平行放大，显著降低劳动强度，为贴壁细胞的规模化培养和培养工艺自动控制和优化 提供了可能性。球形微载体 Cytodex为生物相容性的亲水交联葡聚糖，专为贴壁细胞贴壁悬浮生长而设计， 其直径 100-300 μ m，Cytodex1表面为正电基团，比表面积达 4400 cm2/g；Cytodex3表面为一层变性胶原， 比表面积 2700cm2/g。不仅为细胞提供更大的比表面积从而提高细胞密度，改性后的微载体表面更有利于 细胞贴壁铺展，生长速度快，细胞状态好；而且微载体可以有效的保护细胞防止外界剪切力的影响，还可 以通过 WAVE 微载体细胞球转球工艺实现放大扩增。目前 GE 公司的球形微载体 Cytodex已经被广泛用于细 胞培养的各个领域，拥有超过 600 篇应用文献和大规模实例，成为贴壁细胞规模化培养的金标准。
用于WAVE Bioreactor 系统的一次性 Cellbag 生物反应袋
3, 7
P4 P3
4, 8
P1 P2
描述 空气入口滤器 3/16 in × 3/8 in × 2 in硅胶管, 无针取样
1/8 in × 1/4 in × 39 in C-Flex管, female luer 3/16 in × 3/8 in × 2 in硅胶管, 无针取样 空气出口滤器, 止回阀 空气入口滤器
端口
描述
4
表7. Cellbag生物反应袋尺寸和选项 Bioclear 10 膜（续）
Cellbag
Cellbag 2 L, Bioclear 10 film
P7 P9
P6
P5
P8 P1 P2 P3 P4
产品号
28-4122-69 (part number: CB0002L10-01)
端口 描述
1 1/8 in × 1/4 in × 39 in C-Flex管, female Luer 2 N/A 3 3/16 in × 3/8 in × 2 in 硅胶管, 无针取样 4 N/A
表1.Cellbag生物反应袋组件和材料
组件
Bioclear 10 膜
Bioclear 11 膜
倒钩端口 Luer连接 MCP接头 MCX接头 管路适配器 C-Flex™管路 硅胶管 螺帽端口 内部灌注过滤器 y接头 pHOPT传感器 DOOPT II传感器
Tempwell 通气过滤器 CLAVE®接头 ReadyMate™接头
GE医疗中国
数据文件28-9511-36 AG
ReadyToProcessTM
用于WAVE Bioreactor™系统的一次性 Cellbag™生物反应袋
设计与WAVE生物反应器系统一起使用的Cellbag生物反 应袋（图1）为预灭菌的一次性袋子，用于研究、研发 和商业化生产操作中，培养期间的培养基和细胞为非介 入式混合。作为GE 医疗生命科学ReadyToProcess平台 中即用型产品组成部分，Cellbag生物反应袋无需灭菌或 清洗步骤，为细胞生长提供适宜的环境，同时最大限度 减少交叉污染的风险。它是由多层薄的透明USP VI级塑 料制成，且很容易的连接到整套的ReadyToProcess平台 中，来实现即用型的细胞培养、纯化和流体处理。细胞 培养、纯化和流体处理。
一种EBV特异性的细胞毒性T细胞的制备方法[发明专利]
![一种EBV特异性的细胞毒性T细胞的制备方法[发明专利]](https://img.taocdn.com/s3/m/0a7e7ab58662caaedd3383c4bb4cf7ec4bfeb67b.png)
(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202011588232.5(22)申请日 2020.12.29(71)申请人 山东省齐鲁细胞治疗工程技术有限公司地址 250101 山东省济南市高新区港兴三路1109号实验楼201室申请人 银丰生物工程集团有限公司(72)发明人 吕晓菲 张慧慧 谭毅 李想 (74)专利代理机构 济南泉城专利商标事务所37218代理人 牛芳(51)Int.Cl.C12N 5/0783(2010.01)C12N 5/0781(2010.01)C12N 13/00(2006.01)(54)发明名称一种EBV特异性的细胞毒性T细胞的制备方法(57)摘要本发明属于细胞生物学技术领域，具体涉及一种EBV特异性的细胞毒性T细胞的制备方法：采用刺激细胞按照不同比例刺激脐血或外周血来源的单个核细胞3周，培养过程中每3天对半更换细胞培养液，维持细胞密度为3.0×106/mL，共刺激培养21天；所述刺激细胞为辐照过的EBV转化的B淋巴细胞，所述单个核细胞与刺激细胞以每周减少的比例进行，即第0天时，单个核细胞与刺激细胞的比例为40:1，第7天为20:1，第14天为5:1，每种比例分别刺激一周，共刺激三周。
本发明提供的EBV ‑CTL的制备方法，能够快速有效提高扩增效率，体外功能实验表明，EBV ‑CTL可以特异性的杀伤EBV感染的细胞，且杀伤效率在90%以上。
在临床上，对同种异体干细胞移植后受体的EBV免疫治疗具有重要的潜在意义。
权利要求书1页 说明书4页 附图5页CN 112626015 A 2021.04.09C N 112626015A1.一种EBV特异性的细胞毒性T细胞的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：采用刺激细胞按照不同比例刺激单个核细胞，刺激培养3周，收获细胞；所述刺激细胞为辐照过的EBV 转化的B淋巴细胞。
CAR-T细胞疗法GMP生产概述
CAR-T细胞疗法GMP生产概述1. GMP法规近年来，CAR-T疗法在血液瘤治疗方面表现出令人鼓舞的结果，2017年美国FDA批准了两款CAR-T细胞产品上市，极大地鼓舞了细胞免疫治疗研发热情，CAR-T疗法在某些血液肿瘤中具有显著的疗效，并预示着肿瘤治疗模式的变革。
CAR-T细胞疗法在其它恶性肿瘤方面也进行了深入的研究，部分产品已开展了早期临床试验，以评估CAR-T细胞的安全性和有效性。
FDA规定CAR-T细胞临床试验样品必须经IND批准在GMP条件下生产。
GMP法规见美国Federal Regulations第21篇的各个章节。
它们涵盖各种产品的制造，包括食品、小分子药物等。
CAR-T最相关的章节在第210和211部分中介绍，在FDA指南“CGMP for Phase I Investigational Drugs”中简要介绍了用于早期临床试验的生产要求。
讨论的关键领域如表1所示，其中包括一个专门的章节，涵盖与细胞和基因治疗产品相关的问题。
表1 FDA关于药物临床I期CGMP指南主要内容2. 厂房及设施用于制造、加工或包装CAR-T的任何建筑或设施应具有适当的尺寸、位置，并采用适当的洁净室级材料建造，以确保适当的清洁、维护和生产操作。
制造设施中的每个指定工作区域必须有适当的空间供设备、材料和人员移动，以防止不同部件、过程中材料或不同CAR-T产品之间的混合，从而有助于防止污染。
如果使用多产品制造设施，则需要进行适当的交叉污染研究验证。
CAR-T细胞治疗产品、病毒载体和质粒的生产应当分别在各自独立的生产区域进行，并配备独立的空调净化系统。
采用密闭设备、管路进行细胞治疗产品的生产操作；密闭设备、管路安置环境的洁净度级别可适当降低。
同一生产区域有多条相同的生产线，且采用隔离器的，每个隔离器应当单独直接排风。
细胞治疗产品、病毒载体、质粒的生产操作环境的洁净度级别，可参照表格中的示例进行选择。
表2生产操作环境的洁净度级别细胞治疗产品生产操作示例：✓B级背景下的局部A级1.处于未完全密封状态下产品的生产操作和转移；2.无法除菌过滤的溶液、培养基的配制；3.病毒载体除菌过滤后的分装。
生物材料专业词汇中英文对照
管中管结构pipe-in-pipe structure神经生长因子缓释微球recombinant human nerve growth factor sustained release microsphere非取向支架non-oriented scaffold孔道结构pore-channel structure纳米复合材料nanocomposites生物安全性biological safety人工合成材料artificial synthetic material药物缓释材料drug delivery material载体材料carrier material透析膜材料dialysis membrane material纳米材料nanomaterial扫描隧道显微镜scanning tunneling microscope (STM) 化学气相沉积chemical vapor deposition (CVD)碳纳米管carbon nano-tube抗折强度flexural strength气体冷凝法gas-condensatin method抗拉强度tensile strength抗压强度compressive strength液相法liquid-phase method固相法solid-phase method支架scaffold细胞外基质材料extracellular matrix material生物衍生支架bio-derived scaffold胶原纤维collagen fiber去细胞化支架decellularized scaffold血管内支架intravascular stents糖铁络合物涂层glucose-Fe complex coating表面修饰改性surface modification层层自组装layer-by-layer self-assembly编织型神经导管braided nerve conduit支架stentTiNi合金Ti-Ni alloy超弹性hyperelastic有限元Finite element计算流体动力学computational fluid dynamic analysis 反复铸造recasting镍铬烤瓷合金nickel-chromium ceramic alloy结合力bonding strength义齿性口炎denture stomatitis活动义齿removable dentures基托denture base抗菌性sterilization开放性骨折open fracture硫酸钙calcium sulfate抗生素antibiotic心血管支架cardiovascular stent再狭窄restenosis生物相容性biocompatibility 输血blood transfusion不良反应adverse effect支架scaffold载体vector丝素蛋白silk fibroin牛骨形态发生蛋白bovine bone morphogenetic protein 组织工程骨tissue engineering bone构建construct脊柱融合spinal fusion扩增amplify细胞外基质材料extracellular matrix material生物力学biomechanics生物衍生支架bio-derived scaffold细胞外基质extracellular matrix制备preparation鉴定identification原代肝细胞primary hepatocyte培养基medium胎牛血清fetal bovine serum胰岛素insulin地塞米松dexamethasone表皮生长因子epidermal growth factor等离子喷涂涂层plasma spraying coating去细胞化支架decellularized scaffold糖铁络合物涂层glucose-Fe complex coating表面修饰改性surface modification层层自组装layer-by-layer self-assembly编织型神经导管braided nerve conduit载体材料carrier material血管内支架intravascular stents透析膜材料dialysis membrane material钙磷/壳聚糖涂层calcium phosphate∕chitosan coatings 药物缓释材料drug delivery material生物膜biomembrane封阻剂，阻断剂blocker螯合剂chelating agent克隆载体cloning vector皮质颗粒cortical granule肾上腺皮质素corticoid促肾上腺皮质素释放素corticoliberin皮质类固醇corticosteroid细胞骨架结构cytoskeletal structure宏观量子隧道效应macroscopic quantum tunneling effect (MQT)惰性气体沉积法inert gas deposition高能球磨法high energy ball mill冷冻干燥法freeze drying水热合成法hydrothermal synthesis辐射化学合成法radiation chemical synthesis快速凝固法rapidly quenching强烈塑性变形法severe (intense) plastic deformation非晶晶化法amorphous solid crystallization原位复合法in-situ composite插层复合法intercalation hybrids微乳液法micro emulsion模板合成法template synthesis自组装法self-assembly石墨电弧放电法graphite arc discharge快速凝固法rapidly quenching稳定化处理passivating treatmentX 射线衍射法X-ray diffractometry (XRD)扫描探针显微镜scanning probe microscopy (SPM)红外吸收光谱法infrared absorption spectroscopyX 射线衍射线宽化法X-ray diffractometry line broadening (XRD-LB)X 射线小角度散射法small angle X-ray scattering (SAXS) 拉曼光谱法raman spectrometry穆斯堡尔谱法mossbauer spectrometry光子相关谱法photon correlation spectroscopy压汞仪法mercury porosimetry纳米压痕仪nano impress (NI4.6.16)扫描隧道电子显微法scanning tunneling electron microscopy (STM)扫描近场光学显微法scanning near-field optical microscopy (SNOM)原子力显微法atomic force microscopy (AFM)扫描电容显微法scanning capacitance microscopy (SCM) 扫描热显微法scanning thermal microscopy (STHM)场离子显微法field ion microscopy (FIM)磁力显微法magnetic force microscopy (MFM)激光干涉仪laser interferometer激光衍射/散射法laser diffraction and scattering离心沉降法centrifugal sedimentation绝对偏差absolute deviation绝对误差absolute error可及启动子accessible promoter消色差透镜achromatic lens插入重组，加插重组additive recombination亲和层析affinity chromatography亲和共电泳affinity coelectrophoresis双相接种技术biphasic seeding technique碳纤维增强聚醚醚酮carbon fibers reinforced polyetheretherketone还原胺化反应reductive amination reaction金纳米粒子gold nanoparticles电化学沉积electrochemicaly deposition髌骨软化症chondromalacia patellae锥虫蓝trypan blue 壳聚糖-胶原支架Chitosan-Collagen scaffold水胶体敷料hydrocolloid dressing仿生双相陶瓷生物骨bionic biphasic ceramic-like biologic bonePDS 可吸收缝线poly (p-dioxanone) absorbable suture 真空抽干lyophilized processing透明质酸苄基酯hyaluric acid phenmethyl ester异种移植xenotransplantation颈前路手术cervical anterior approach药物洗脱支架drug-eluting stent瞬心instantaneous center辅助性T 淋巴细胞T helper lymphocytes缓释片controlled release tablets累积释放度cumulative release percent腔内隔绝术endovascular graft exclusion球囊扩张椎体后凸成形术Balloon kyphoplasty低强度脉冲式超声波Low-intensity pulsed ultrasound 封阻剂，阻断剂Blocker封闭剂，封阻剂blocking agent封闭抗体，阻断抗体blocking antibody血细胞计数器blood cell counter血液循环blood circulation血块blood clot血块收缩blood clot retraction血液凝固，凝血blood clotting血液凝固，凝血blood coagulation凝血级联系统blood coagulation cascade凝血因子blood coagulation factor螯合聚合物chelate polymer细胞毒性T 淋巴细胞cytotoxic T lymphocyte细胞毒性cytotoxicity细胞毒性T 淋巴细胞cytotoxic T lymphocyte细胞毒素cytotoxin细胞向性cytotropism配离子coordination ion配位异构coordination isomerism配位数coordination number二尖瓣bicuspidal valve双极电解bielectrolysis双焦点眼镜bifocal spectacles双节肋骨咬骨钳bi-joints rib rongeur两侧的bilateral胆道扩张器bile duct dilator胆红素比色计bilirubin colorimeter双层金属真空计bimetallic vacuum gauge双峰起搏器bimodal pacemaker双重X 射线源binary X-ray source牙龈形态学gingival morphology牙槽嵴形态学alveolar ridge morphology模型分析model analysis侧貌分析profile analysis美学诊断蜡型aesthetic diagnostic wax-up绘图模拟paint simulation蜡模拟wax simulation切平面incisal plane凸出切平面convex incisal plane鸥翼切平面gull wing incisal plane腰椎管狭窄lumbar stenosis超声波ultrasound脊柱侧凸scoliosis软组织损伤soft tissue injury脊髓造影myelography前列腺素E2 prostaglandin E2影像分析imaging analysispH 值pH value生物医学工程biomedical engineeringβ-内啡肽β-endorphin激光解析\离子化-飞行laser desorption/ionizationtime-of-flight时间质谱mass spectrometry technique股骨头缺血性坏死ischemic necrosis of the femoral head 地龙pheretimaasiatica冲击波shock wave肽peptide矫形器orthosis蛋白质组proteome下肢矫形器lower limb orthosis医学工程学medical engineering马蹄内翻足talipesequinovarus直流电疗机galvanic current apparatus电烙绞勒器galvanic ecraser伽伐尼电，流电，化电galvanic electricity原电池galvanic element皮肤电反应galvanic skin response (abbr.GSR)直流电刺激galvanic stimulation①电镀②流电疗法galvanization直流电疗机galvanization apparatus流电，电针术galvanogalvanoacupuncture电针麻醉galvanoacupuncture anesthesia电针麻仪galvanoadcupuncture anesthesia unit电烙勒除器galvanocaustic snare电烙器galvanocautery电烙刀galvanocautery knife电流记录图galvanograph电流计，检电流计galvanometer检流计放大器galvanometer amplifier检流计示波器galvanometer oscillograph电流记录仪galvo-recorder 活体移植living donor transplantation可摘除式假牙removable partial dentures假牙支撑support牙冠crown生物相容性biocompatibility生物反应器bioreactor酸性磷酸酶acid phosphatase促肾上腺皮质激素adrenocorticotropic hormone丙胺酸转氨酶alanine amino transferase白蛋白albumin醛缩酶aldolase醛甾酮aldosterone碱性磷酸酶alkaline phosphatase同功酶isoenzymesδ－氨基乙酰丙酸delta-aminolevulinic acid雄（甾）烯二酮androstenedione雄甾酮androsterone血管紧缩素I 和肾素angiotensin I and rennin血管紧缩素转化酶（A.C.E.）angiotensin converting enzyme [A.C.E.]抗坏血酸维生素Cascorbic acid人造臂artificial arms半功能手semi-functional hands吸收震动脚shock absorbing feet充分活动full mobility人造假体artificial prosthesis义眼artificial eye微型数字照相机miniature digital camera远程单向电子接口remote unidirectional electronic interface视网膜retina视神经optic nerve人造电子眼artificial electronic eye人造心脏artificial hearts人造耳朵artificial ear勃起障碍erectile dysfunction海绵体corpora cavernosa食管癌esophageal cancer失弛缓症achalasia胃食管返流疾病gastroesophageal reflux disease人造贲门artificial cardia胃stomach板层骨lamellar bone编织骨woven bone不动关节synarthrosis成骨细胞osteoblast初级骨化中心primary osseous center次级骨化中心secondary ossification center穿通管Volkmann’s canal粗面内质网rough endoplasmic reticulum蛋白多糖类protein polysaccharides低磷性佝偻病hypophosphatemicricket动力固定dynamic fixation动力加压dynamic compression动力加压接骨板dynamic compressing plate DCP 二磷酸盐diphosphonate非自攻钉nonself tapping肥大性假关节hypertrophic pseudoarthrosis负荷load干骺端metaphysis干骺端metaphyses骨囊肿bone cyst骨髓bone marrow骨皮质螺钉cortical screws骨松质螺钉cancellous screws冠状动脉支架coronary artery stent implantation 血小板活化platelet activation生物相容性biocompatibility金属裸支架bare stent药物洗脱支架drug-eluting stent再狭窄restenosis肩锁关节acromioclavicular喙突coracoid process脱位dislocation颈椎前路anterior cervical plating内固定器internal fixation device伸膝迟滞Knee extension lag膝骨关节炎knee osteoarthritis全膝人工关节置换total knee arthroplasty股骨骨折intertrochanteric fracture虚拟手术virtual surgery穿透penetration事件相关电位event related potential听觉Oddball auditory Odd-ball task。
WAVE(TM)生物反应器中的Cytodex(TM)
GE Healthcare应用文献 28-9576-34 AA疫苗WAVE™生物反应器中的Cytodex™ 微载体细胞培养工艺关键词：MDCK，Vero，细胞培养，微载体，Cytodex，WAVE，疫苗摘要介绍WAVE Bioreactor系统多用于悬浮细胞的培养。
然而，用于细胞治疗和疫苗生产的多种细胞为贴壁依赖型的，需要一个可贴附的生长表面。
在本研究中，Cytodex微载体被应用在CellbagTM生物反应器中以扩增Madine-Darby Canine Kidney (MDCK)和Vero细胞。
为了优化细胞贴附，测试了两种细胞株的不同摇动混合条件。
我们发现培养基成分对细胞贴附有显著的影响；例如在低血清培养基中的MDCK和Vero细胞，用间歇式和连续摇动混合都可以使细胞贴附到微载体上。
然而，在无血清条件下，Vero 细胞在间歇式摇动混合下可以获得高贴壁率。
生长在 WAVE Bioreactor系统中的MDCK 细胞可以被放大到2 L和10 L工作体积。
细胞达到最大密度为3×106细胞/ml。
Vero细胞在2 L工作体积下的Cytodex 1和Cytodex 3微载体上培养，无血清条件下达到1.4×106细胞/ml 最大密度。
用转瓶同样条件可以获得相同密度的Vero细胞，WAVE中细胞生长速度更快。
数据显示WAVE Bioreactor系统是成功用于MDCK和Vero细胞微载体培养的通用平台，可以方便的进行规模放大，是对传统搅拌罐生物反应器或转瓶的一种快速和方便的替代系统。
与滚瓶 (Roller Bottle)中的细胞培养不同，贴壁细胞在微载体上的培养使它相对容易进行生产工艺的规模放大。
此外，微载体使细胞能够在生物反应器中扩增，与多个小T型瓶等塑料培养容器相比，生物反应器可以提供更好的工艺参数自动控制，降低劳动强度的同时减少污染的危险。
一次性生物反应器的使用减少了投资成本、提高灵活性(简化批次间的轮换准备等操作），消除了生产容器清洗验证的需要。
动物细胞培养的基本方法
已成功生产了包括狂犬病疫苗、口蹄疫
疫苗、甲型肝炎疫苗、乙型肝炎疫苗、红 细胞生成素、单克隆抗体等产品。
依细胞种类：原代培养、传代培养 依培养基：液体培养、固体培养 依培养器和方式: 静止培养、旋转培养、搅 拌培养、微载体培养、中空纤维培养、固 定床或流化床培养。 生产实际来看：悬浮培养、贴壁培养和贴壁悬浮培养。
①温度 ②pH a在培养初期，偏碱，控制进二氧化碳量 b当细胞密度提高后控制NaHCO3的量 ③溶氧 ④搅拌 ⑤进出液流量
第七节 动物细胞制药的前 景与展望
一、提高产量、降低成本和改进质量 方面的研究 二、转基因动物的研究 三、组织工程的研究
一、提高产量、降低成本和改 进质量方面的研究
为了提高产量，要提高细胞表达水平。 为降低成本，须改进培养基配方。
第五节 动物细胞培养的基本方法
一 细胞分离
1 离心分离法
用于从含有细胞的体液如血液、羊水、 胸腹水中分离细胞。一般用800～1000rpm 离心5～10min。
2 消化分离法
先从生物体取来组织块，将其剪碎，并用消化 液将其消化，使组织松散成细胞悬液，然后用缓冲 液洗涤、离心、去除残留的消化液而获得所需的细 胞。 常用的消化液有胰蛋白酶、乙二胺四乙酸、胰 酶－柠檬酸盐、胰酶－EDTA、胶原酶、链霉蛋白酶、 木瓜蛋白酶等。
缺点：
a操作比较麻烦，需要合适的贴附材料和足够 的面积。 b培养条件不易均一，传质和传氧效果差。
c不能有效地监控细胞的生长。
贴壁培养系统：中空纤维；玻璃珠；微载 体培养。
贴壁培养和悬浮培养的不同之处是在 传代或扩大培养时，常常需要用酶将其从 基质上消化下来。
3、贴壁-悬浮培养，或称假悬浮培养
结构较简单，装填的材料可以是一切对 细胞无毒、又有利于细胞贴附的材料，有 实心载体和有孔载体两类。
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谷氨酰酶 (mml/l)
乳酸 (g/l)
氨 (mmol/l)
葡萄糖 (g/l)
应用园地 14
在细胞生长的对数增长阶段，静态培养物被转移到 灌注系统的WAVE生物反应器中，细胞的培养浓度 可达到1x107个细胞/ml甚至更高。在WAVE生物反 应器2/10和20/50中优化培养活化的T细胞和转基因 T细胞。 优化 优化WAVE生物反应器细胞培养时必须考虑下列几 个参数，如摇床的转速，摇动角度，培养基灌注速 率和培养基的成分。此外，为了确定生物反应器的 生产效率，可以检测细胞数量，细胞浓度，细胞活 力，以及监控pH值和营养物质的消耗量。由于细 胞的刺激方法，培养基的成分，和捐献者或病人个 体都会有所差异，我们建议在优化阶段进行细胞培 养的多参数分析。
1. Levine B.L., et.at,Int. Immunol. 7, 891-904 (1995). 2. Levine B. L., et.al.J.Immunol. 159, 5921-5930 (1997). 3. Weng N. P., et.al. Proc. Natl. Acad, Sci. USA 92, 11091-11094 (1995). 4. Levine B.L., et.al. Nat.Med. 8, 47-53 (2002). 5. Laport G.G., et.al. Blood 102, 2004-2013 (2003). 6. Rapoport A. P., et.al. Bone Marrow Transplant. 33, 53-60 (2004). 7. Porter D. L., et.al. Nat. Med. 11, 1230-1237 (2005). 8. Levine B. L., et.al. Proc. Natl Acad. Sci. 103, 17372-17377 (2006). 9. Maus M.V., et.al. Nat. Biotech. 20, 143-148 (2002). 10. Thomas A. K., et.al. Clin. Jmmunol. 105, 259-272 (2002). 11. Suhoski M. M., et.al. Mol. Ther. 15, 981-988 (2007). 12. Hami L. S. et.al. Cytotherapy 6, 554-562 (2004). 13. Hami L. et.al. Bioprocessing 2, 1-10 (2003). 14. Application note: WAVE Cell Culture of T cells in Suspension. December 2003. 15. Levine B. L., et.al.J.Hematotherapy 7, 437-448 (1998).
应用园地
应用WAVE生物反应器 快速生产临床级别的T淋巴细胞
B. Levine 临床细胞和疫苗生产部，宾西法尼亚大学附属医院，美国细胞制备与处理Cell preparation and processing
本研究介绍和比较了大规模扩增培养T淋巴细胞方 法：静态培养与在WAVE Bioreactor 2/10波浪生物 反应器中使用人工抗原提呈细胞或球状固相载体辅 助培养。较静态培养而言，WAVE波浪生物反应器 灌注培养的T淋巴细胞可以在较小的培养体积中达 到更高的细胞密度。这样可以节省培养和收集过程 中所消耗的人力，同时能减少抛弃型耗材的成本。 该方法对于生产高效和特殊功能的T淋巴细胞具有 极其重要的作用。针对临床试验所需大剂量的T淋 巴细胞，这将会产生新一代的细胞治疗方法。 使用人工抗原提呈细胞高效培养T淋巴细胞 在T淋巴细胞结合抗原提呈细胞(APC )的作用下，T 淋巴细胞协调体内免疫反应，从而导致其增殖和 克隆扩增。这个复杂的多级过程可以通过在体外 将T淋巴细胞结合到固定化的抗CD3和抗CD28的 单克隆抗体上来重现(1-3)。据报道，该激活方法 可以最有效刺激人类多克隆T淋巴细胞的增长(2)， 而且不需要外源性生长因子或其他细胞的帮助。 据此，T淋巴细胞可以在体外迅速的增殖，达到临 床治疗所需要的规模(4-9)。 最近，源于慢性粒细胞白血病白细胞系K562成功 开发出抗原提呈细胞aAPC [10-12]。这些强化的 细胞基的aAPC可以在WAVE 生物反应器中产生出 主细胞库(Master Cell Bank)，用于临床试验。 体外制造过程中细胞的分离与扩增 临床级别细胞扩增来源于研究对象或健康的捐助 者体内分离的外周血单核细胞(PBMC)。外周血单 核细胞经过洗涤去除特定种类的细胞。这些外周 血单核细胞，淋巴细胞，富集的T细胞受到包被了 抗-CD3/CD28Mab微球的刺激生长(1, 2)，微球和 细胞的比例3：1。细胞在添加了5%人白, 2 mM Lglutamine, 20 mM HEPES, 和 100 IU/ml rhIL-2的XVIVO™15无血清培养基中培养。各种细胞，培养 基，载体(转基因操作时)，和aAPC被放到可渗透 气体的塑料袋或其他培养容器中，放置在一个培 养箱中(37℃，5％的CO2)。在静态培养中，补充 新鲜的培养基以维持适当的细胞密度(约0.5至1.5x 106细胞/ml)，培养数天。然后在无菌操作条件下 将细胞转移到其他的细胞培养袋中。
= WAVE Bioreact or 灌注培养 = 静态培养
1
2 处理天数
3
4
5
图2. WAVE Bioreactor灌注培养和静态培养中谷氨酰胺、乳酸、 氨和葡萄糖的浓度。
Cells/ml
谷氨酰酶 4
6 5ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
细胞数量增倍
1x10 8x10 6x10 4x10 2x10 0 0 1 2 3 4 细胞转移到WAVE Bioreactor后的天数
7
6
= WAVE Bioreact ot 灌注培养 = 静态培养 = WAVE Bioreact ot 灌注培养 细胞浓度 = 静态培养 浓度
4 3
6
6
2 1 0
6
图3. 静态培养与WAVE Bioreactor 2/10灌注培养中细胞生长和浓 度曲线。
图2显示了在一个培养试验中的谷氨酰胺、乳酸、 氨和葡萄糖的水平，显示上述参数的优化，培养 基在WAVE波浪生物反应器灌注培养中的代谢产物 水平与静态对照培养物相同。 如果培养基成分或灌注设置参数没有达到最佳配 比，那么乳酸和氨的水平需要控制，调节前面提到 的参数来调整。图3比较了经过优化的WAVE灌注培 养和静态对照培养的细胞生长状况和培养浓度。 在经过初步的刺激后，WAVE Bioreactor中的T淋巴 细胞得到扩增，在长达12天的培养后收获细胞， 作为细胞治疗之用。在细胞扩增之后，抗体包被 的微球用磁场(15)清除，并且检测最终细胞产物中 的残留微球的数量。用该方法，可以除去5log10微 球。用细胞处理器或相似的设备洗滤和浓缩细 胞，以维持系统的封闭。细胞经过洗涤、浓缩后 重悬到细胞冻存液中，储存细胞以待将来使用。 冻存液中组分比例1：1，Plasma-LyteA加5%葡萄 糖,人血清白蛋及二甲基亚砜(DMSO), 0.45% 氯化钠 补充dextran40和5%葡萄糖。 结论 通过改进T淋巴细胞的培养方法，WAVE Bioreactor 可以成为一种不可替代的T细胞培养工具，生产满 足临床使用剂量的治疗性T细胞，从而用于治疗癌 症和其他疾病。WAVE Bioreactor的一个重要优势 是T淋巴细胞可以在灌注模式下扩增到足够用于临 床治疗的细胞数量，同时显著的降低了成本和一 次性材料的消耗。 参考文献
用流式细胞仪检测，刺激细胞增长前和细胞培 养末期细胞的表型，用CellQuest™软件采集分析 数据，或用FlowJo软件分析测试结果。白细胞 免疫表型使用以下荧光标记的单克隆抗体来检 测，包括CD3 (SK7 ， lgG1) ， CD4 (SK3 ，lgG1) , CD8 (SK1 ，lgG1) ， CD19 (HIB19 ，lgG1) ， CD45 及 ( 2 D 1 ， l g G 1) ， C D 1 6 ( 3 G 8 ， l g G 1) 和 CD45(H130 ，lgG1) 。
3
2
1
= WAVE Bioreact or 灌注培养 = 静态培养
0 0
乳酸
1
2 处理天数
3
4
5
4
3
2
1
= WAVE Bioreact or 灌注培养 = 静态培养
0 0 氨 4 1 2 处理天数 3 4 5
3
2
1
= WAVE Bioreact or 灌注培养 = 静态培养
0 0 葡萄糖 6 5 4 3 2 1 0 0 1 2 处理天数 3 4 5
图1. T淋巴细胞和包被了抗体的微球。
WAVE生物反应器的贡献 虽然T淋巴细胞可在最大为1500ml的静态培养袋 中培养，但是高于2x109细胞量的培养则需要更 多的静态培养袋，这样就需要增加塑料袋和劳 动力的支出。临床操作需要的T细胞量大于1x 1010。制造空间，劳动力需求，以及需要制备多 个病人剂量的花费可能会阻碍生产。WAVE波浪 反应器则可以消除这个障碍，整个生产过程都 在一个无菌细胞培养袋中完成。 已认证了WAVE生物应器灌注培养技术的可行 性，参考文献13－15的操作指南，并在培养基 中添加了消泡剂。