HUNGATE亨盖特滚管法厌氧培养操作步骤
亨盖特滚管技术
厌氧菌的分离和培养关键词：厌氧菌分离培养 2008-06-12 00:00 来源：丁香园点击次数：23001 目的1.1 了解厌氧微生物的生长特性1.2 观察厌氧微生物（双歧杆菌）的形态特征1.3 掌握厌氧微生物的滚管分离、培养与计数技术2 原理目前培养厌氧微生物的简便而又有效的技术包括有：厌氧箱培养技术；厌氧罐培养技术；厌氧袋培养技术；亨盖特厌氧滚管技术。
这里介绍的是亨盖特厌氧滚管技术。
亨盖特厌氧滚管技术是美国微生物学家亨盖特（Hungate）于1950年首次提出并应用于瘤胃厌氧微生物研究的一种厌氧培养技术。
以后这项技术又经历了几十年的不断改进，从而使亨盖特厌氧技术日趣完善，并逐渐发展成为研究厌氧微生物的一整套完整技术。
而且多年来的实践已经证明它是研究严格、专性厌氧菌的一种极为有效的技术。
亨盖特厌样滚管培养技术不仅可用于有益厌氧菌如双歧杆菌等的分离、与活菌培养计数，还可以用于有害腐败菌（如酪酸菌）或病原菌（如肉毒梭状芽孢杆菌）的分离与鉴定。
3 材料3.1 样品双歧酸奶（液体）、双歧杆菌制剂（固体）。
3.2 培养基改良MRS培养基，PTYG培养基。
3.3 仪器和器具亨盖特厌氧滚管装置一套，厌氧管，厌氧瓶，滚管机，定量加样器4 流程铜柱除氧→预还原培养基→稀释用液制备→稀释样品→滚管→培养→计数5 方法5.1铜柱系统除氧铜柱是一个内部装有铜丝或铜屑的硬质玻璃管。
此管的大小为40—400mm，两段被加工成漏斗装，外壁绕有加热带，并与变压器相连来控制电压和稳定铜柱的温度。
铜柱两端连接胶管，一端连接气钢瓶，一端连接出气管口。
由于从气钢瓶出来的气体如N2、CO2和H2等通常都含有O2，故当这些气体通过温度约360℃的铜柱时，铜和气体中的微量O2化合生成CuO，铜柱则由明亮的黄色变为黑色。
当向氧化状的铜柱通入H2时，H2与CuO中的氧就结合形成H2O，而CuO又被还原成了铜，铜柱则又呈现明亮的黄色。
此铜柱可以反复使用，并不断起到除氧的目的。
检验科厌氧培养的规范操作流程
检验科厌氧培养的规范操作流程下载温馨提示:该文档是我店铺精心编制而成，希望大家下载以后，能够帮助大家解决实际的问题。
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厌氧菌的培养方法
祁红兵
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1
物理方法包括遮断空气法、煮沸法、真空法、空 气置换法、气体喷射法或转管法等
化学方法包括焦性没食子酸法、铁丝绒法、保险 粉法等
生物学方法包括与需氧菌共生好氧法、燕麦发芽 法等
混合法包括厌氧罐（袋）法、厌氧手套箱法或厌 氧室法、空气置换铁丝绒法、空气置换钯粒法等。
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2
1 液体培养基的厌氧培养法
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2.6 生物好氧厌氧培养法
疱肉培养基: 牛肉渣
0.5g
牛肉浸液 7ml
液面上加盖3～4mm厚的融化凡士林，灭菌。
生物好氧厌氧培养方法
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23
2.7 转管技术和气体喷射培养法
钢瓶进气
360℃
铜柱
除氧气体
微量O2
（亮黄色）
H2源 CuO （黑色）
接种或移植
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2.8厌氧手套箱法
又称厌氧室法
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27
4 厌氧菌的保存
4.1继代保存：
以GAM半固体流动培养基和TEP半固 体培养基作传代培养保存。用毛细吸管吸 菌进行继代培养，使用白金接种环移菌接 种，可以避免有的菌在操作中接触空气或 氧化物而死亡。数周作一次继代培养。新 分离的的菌种，在几个月内，每3～4星期 传代一次。被保存的菌种，放室温下暗处。 最好是不同菌用不同培养基保存。
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13
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2.2.3 保险粉的厌氧罐培养法
二亚硫酸钠（Na2S2O4） 碳酸氢钠 无水硫酸钠
不用触媒
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2.3 钢丝绒法
酸性硫酸铜溶液 钢(铁)丝绒
铜和铁的络合物
O2
厌氧指示剂
亨盖特厌氧滚管装置
亨盖特厌氧滚管装置
亨盖特滚管技术是在厌氧微生物分离培养实验中一个重要的部分，是将培养基和接种物混合后利用滚动厌氧试管的方式将培养基均匀的涂布在试管内表面，如同进行常规的平板培养，在厌氧的条件下培养单个菌落，之后则可以挑取单个菌落达到分离的目的。
常规方法是将融化的培养基于接种物混合后迅速置于冰上进行滚动，琼脂降温后便凝固于试管内表面。
这种操作效率低，而且琼脂的厚度不容易控制均匀，此时采用电机驱动的滚管机就是实验人员的最佳选择。
自行设计生产的亨盖特滚管机采用直流电机无极调速方式驱动一根软性滚轴带动试管转动，并采取加冰水或者是电子制冷水对试管进行冷却，高速转动的滚轴可以提供极佳的琼脂厚度均一性，提高滚管成品率。
一、工作环境
1、电源：DC24V 1A。
二、技术参数
1、转速可调，最大转速550rpm；
2、转速数字显示；
3、具水位控制功能；
4、采用电磁阀控制排水；
5、可采用碎冰、冰盒、冰袋或配套电子制冷器作为冷媒；
6、具防试管脱位功能；
7、不受试管盖形状影响。
2022年湖北工业大学食品科学与工程专业《微生物学》期末试卷B(有答案)
2022年湖北工业大学食品科学与工程专业《微生物学》期末试卷B(有答案）一、填空题1、放线菌的代表属有______、______、______、______等。
2、朊病毒与真病毒有巨大差别，例如______、______、______、和______等。
3、6分子葡萄糖经HMP途径进行直接氧化和一系列复杂反应后，最终产物为______个______分子，______个______分子和6个CO2。
4、从元素水平来看，微生物的有机氮源有______和______两类，无机氮源则有______、______和______三类。
5、食用菌一般是指可食用的有大型______的高等真菌，分类上主要属于______，其次为______。
6、我国古代劳动人民在微生物应用方面的主要贡献是发明用______独特工艺加工______原料以生产______。
7、厌氧菌的固体培养方法有：______、______、______、______和______。
8、参与硫循环的微生物有______、______、______。
9、根据感受态建立方式，可以分为______转化和______转化，前者感受态的出现是细胞一定生长阶段的生理特性；后者则是通过人为诱导的方法，使细胞具有摄取DNA的能力，或人为地将DNA导入细胞内。
10、病原菌或病原体的侵袭力由______、______和______三方面组成。
二、判断题11、支原体是一类无细胞壁，也是整个生物界中发现的能独立营养的最小原核生物。
（）12、被动扩散是微生物细胞吸收营养物质的主要方式。
（）13、一般地说，形态构造和生活史越复杂的微生物，它们的次生代谢产物的种类就越多。
（）14、病毒包膜系病毒以芽出方式成熟时自细胞膜衍生而来，故其结构和脂质种类与含量皆与细胞膜相同。
（）15、足细胞可在曲霉和青霉的分生孢子梗的基部找到。
（）16、（G＋C）mol%值的差别，可作为微生物系统分类工作中正确设置分类单元的可靠依据。
2022年山西师范大学食品科学与工程专业《微生物学》期末试卷A(有答案)
2022年山西师范大学食品科学与工程专业《微生物学》期末试卷A(有答案）一、填空题1、G＋菌细胞壁的主要成分是______和______；前者的双糖单位是由一个______通过______与另一个______相连构成，这一双糖单位易被______水解，而导致细菌细胞壁“散架”而死亡。
2、当宿主细胞内的大量子代噬菌体成熟后，由于水解细胞膜的______ 和水解细胞壁的______等的作用，促进了细胞的裂解。
3、ED途径的一特征反应是将2-酮-3-脱氧-6-磷酸葡萄糖（KDPG）裂解为______和______，因此，其特征酶为______。
4、通常牛肉膏蛋白胨培养基适合于培养______、应将pH调至______；高氏一号培养基适合于培养______、应将pH调至______；马丁氏培养基合于培养______、pH为______；马铃薯葡萄糖培养基适合于培养______、pH为______。
5、真菌细胞壁的主要成分是______，另有少量的蛋白质和脂类。
低等真菌的细胞壁成分以______为主，酵母菌以______为主，而高等陆生真菌则以______为主。
6、第一个用自制显微镜观察到微生物的学者是______，被称为微生物学研究的先驱者，而法国学者______和德国学者______则是微生物生理学和病原菌学研究的开创者。
7、厌氧菌的固体培养方法有：______、______、______、______和______。
8、自然界的碳素循环主要包括______和______两个过程。
9、通常情况下，菌种可保藏在______℃和______℃的低温下。
10、在补体结合实验中，无溶血现象出现称为补体结合实验______，说明样品中______抗原存在。
二、判断题11、光合细菌和蓝细菌都只含有叶绿素，所以都能进行光合作用，同化CO2合成菌体有机质。
（）12、氮素营养物质不仅用来合成细胞中的蛋白质，还可以为部分微生物提供能源。
厌氧培养箱之厌氧菌的培养操作
厌氧培养箱之厌氧菌的培养操作厌氧菌在有氧的情况下不能生长。
要培养厌氧菌，必须创造一个无氧的环境。
通常用培养基中加入还原剂，或用物理、化学方法去除环境中的游离氧，以降低氧化还原电势。
如疱肉培养基、硫基乙酸钠培养基，牛心脑浸液培养基等。
常用的厌氧培养方法有许多，可根据实际情况选用。
1．厌氧缸法接种好标本的平板或液体培养基试管，可放入厌氧缸内培养，厌氧缸是普通的干燥缸，用物理化学的方法使缸内造成厌氧环境，从而将厌氧菌培养出来。
2．厌氧袋（Bio-bag）即在塑料袋内造成厌氧环境来培养厌氧菌。
塑料袋透明而不透气，内装气体发生管（有硼Q化钠的碳酸氢钠固体以及5%柠檬酸安瓿）、美兰指示剂管、钯催化剂管、干燥剂。
放入已接种好的平板后，尽量挤出袋内空气，然后密封袋口。
先折断气体发生管，后折断美兰指示剂管，命名袋内在半小时内造成无气环境。
如不突变表示袋内已达厌氧状态，可以孵育。
3．厌氧手套箱（Anaerobie glove box）即厌氧培养箱。
它是一个密闭的大型金属箱，箱的前面有一个有机玻璃做的透明面板，板上装有两个手套，可通过手套在箱内进行操作，故名。
箱侧有一交换室，具有内外二门，内门通箱内先关着。
欲放物入箱，先打开外门，放入交换室，关上外门进行抽气和换气（H2，CO2，N2）达到厌氧状态，然后手伸入手套把交换室内门打开，将物品移入箱内，关上内门。
箱内保持厌氧状态，也是利用充气中的氢在钯的催化下和箱中钱残余氧化合成水的原理。
该箱可调节温度，本身是孵箱或孵箱即附在其内，还可放入解剖显微镜便于观察厌氧菌菌落，这种厌氧箱适于作厌氧细菌的大量培养研究，大量培养基可放入作预还原和厌氧性无菌试验。
金属硬壁型厌氧箱的抽气、充气、厌氧环境和温度等均系自动调节。
4.厌氧盒：原理同厌氧袋，有成品销售。
5.生物耗氧法：在一密闭的容器内放以生物（多是植物），消耗氧气，同时产生二氧化碳，供细菌生长用。
我没见过。
6.焦性末食子酸法：在一洁净的玻片上铺上纱布或滤纸，均匀撒上焦性末食子酸，然后再混入NaHCO3粉末或NaOH溶液，迅速将已接种细菌的平板倒扣在上面，用融化的白蜡封边，造成一个封闭空间。
厌氧培养方法
厌氧性细菌的分离培养法厌氧菌需有较低的氧化—还原势能才能生长(例如破伤风梭状芽孢杆菌需氧化—还原电势降低至0.11V时才开始生长)，在有氧的环境下，培养基的氧化—还原电势较高，不适于厌氧菌的生长。
为使培养基降低势，降低培养环境的氧压是十分必要的。
现有的厌氧培养法甚多，主要有生物学，化学和物理学3种方法，可根据各实验室的具体情况而选用。
1．生物学方法培养基中含有植物组织(如马铃薯、燕麦、发芽谷物等)或动物组织(新鲜无菌的小片组织或加热杀菌的肌肉、心、脑等)，由于组织的呼吸作用或组织中的可氧化物质氧化而消耗氧气(如肌肉或脑组织中不饱和脂肪酸的氧化能消耗氧气，碎肉培养基的应用，就是根据这个原理)，组织中所含的还原性化合物如谷胱甘肽也可以使氧化—还原电势下降。
另外，将厌氧菌与需氧菌共同培养在一个平皿内，利用需氧菌的生长将氧消耗后，使厌氧菌能生长。
其方法是将培养皿的一半接种吸收氧气能力强的需氧菌(如枯草杆菌)，另一半接种厌氧菌，接种后将平皿倒扣在一块玻璃板上，并用石蜡密封，置37恒温箱中培养2~3d 后，即可观察到需氧菌和厌氧菌均先后生长。
2．化学方法利用还原作用强的化学物质，将环境或培养基内的氧气吸收，或用还原氧化型物质，降低氧化—还原电势。
（１）李伏夫(B．M．JIbbob)法此法系用连二亚硫酸纳(Sodium hydrosulphite)和碳酸钠以吸收空气中的氧气，其反应式如下：Na2S204十Na2C03十O2一→Na2SO4十Na2SO3十C02取一有盖的玻璃罐，罐底垫一薄层棉花，将接种好的平皿重叠正放于罐内(如系液体培养基，则直立于罐内)，最上端保留可容纳1~2个平皿的空间(视玻罐的体积而定)，按玻罐的体积每1000cm3空间用连二亚硫酸纳及碳酸钠各30g，在纸上混匀后，盛于上面的空平皿中，加水少许使混合物潮湿，但不可过湿，以免罐内水分过多。
若用无盖玻罐，则可将平皿重叠正放在浅底容器上，以无盖玻罐罩于皿上，罐口周围用胶泥或水银封闭(如图１－５)。
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Hungate滚管法厌氧培养操作概要
以双歧杆菌培养为例：
实验步骤：
1.铜柱系统除氧
铜柱是一个内部装有铜丝或铜屑的硬质玻璃管。
此管的大小为40—400mm，两段被加工成漏斗装，外壁绕有加热带，并与变压器相连来控制电压和稳定铜柱的温度。
铜柱两端连接胶管，一端连接气钢瓶，一端连接出气管口。
由于从气钢瓶出来的气体如N2、CO2和H2等通常都含有O2，故当这些气体通过温度约360℃的铜柱时，铜和气体中的微量O2化合生成CuO，铜柱则由明亮的黄色变为黑色。
当向氧化状的铜柱通入H2时，H2与CuO中的氧就结合形成H2O，而CuO又被还原成了铜，铜柱则又呈现明亮的黄色。
此铜柱可以反复使用，并不断起到除氧的目的。
当然H2源也可以由氢气发生器产生。
2 预还原培养基及稀释液的制备
制作预还原培养基及稀释液时，先将配制好的培养基和稀释液煮沸驱氧，而后用半定量加样器趁热分装到螺口厌氧试管(FM scientific 货号2651-6001)中，一般琼脂培养基装4.5-5ml，稀释液装9ml，并插入通N2气的长针头以排除O2。
此时可以清楚地看到培养基内加入的氧化还原指示剂—刃天青由蓝到红最后变成无色，说明试管内已成为无氧状态，然后盖上螺口的丁烯胶塞及螺盖，灭菌备用。
3 双歧杆菌样品不同稀释度的制备
在无菌条件下准确称取1g固体或用无菌注射器吸取1ml混合均匀的液体样品，而后加入装有预还原生理盐水的厌氧试管中，用震荡器将其震荡均匀，制成10-1
稀释液。
用无菌注射器吸取1ml 10-1稀释液至另一支装有9ml生理盐水的试管中，制成10-2稀释液。
按此操作方法依次进行10倍系列稀释至10-7，制成不同浓度的样品稀释液。
通常选10-5、10-6、10-7三个稀释度进行滚管培养计数。
4厌氧滚管培养法
将盛有融化的无菌无氧琼脂培养基试管放置于50℃左右的恒温水浴中，用1ml无菌注射器分别吸取10-5、10-6、10-7三个稀释度的稀释液各0.1ml于融化了的琼脂培养基试管中，而后将其平放于滚管机（FM Scientific 型号R10）上迅速滚动，这样带菌的融化培养基在试管内壁立即凝固成一薄层。
每个稀释度重复3次，而后置于37℃（酸奶样品42℃）恒温培养箱中培养。
一般培养24—48小时后，即可在厌氧管的琼脂层内或表面长出肉眼可见的菌落。
5.厌氧管清洗和灭菌方法
清洗厌氧管时，先用2%盐酸浸泡过夜，自来水冲洗干净后，用蒸馏水浸泡至pH中性，干燥后贴上标签，标上菌号及时间，121℃下高压灭菌15-20分钟，备用。
6.注意事项
1注射器在使用前必须经过121℃、20min灭菌。
2注意无菌操作，保持手和培养管的清洁。
每次接种前需用酒精棉球将厌氧管盖子擦一遍。
3用注射器吸取菌悬液注入固体培养基后，如需再次吸取，应快速将注射器插入厌氧管中，以防止针头污染。
备注：本操作概要仅供参考。