OD260OD280比值的应用
DNA_RNA比值
DNA/RNA的定量与纯度的测定OD260 OD280 OD230 一、实验目的学习、掌握紫外吸收法检测DNA浓度和纯度的原理和方法。
二、实验原理DNA/RNA在260nm处有最大的吸收峰，蛋白质在280nm处有最大的吸收峰，盐和小分子则集中在230nm处。
因此，可以用260nm波长进行分光测定DNA浓度，OD值为1相当于大约50μg/ml双链DNA。
如用1cm光径，用H2O稀释DNA/RNA 样品n倍并以H2O为空白对照，根据此时读出的OD260值即可计算出样品稀释前的浓度：DNA（mg/ml）=50×OD260读数×稀释倍数/1000。
RNA（mg/ml）=40×OD260读数×稀释倍数/1000。
DNA/RNA纯品的OD260/OD280为1.8或2.0，故根据OD260/OD280的值可以估计DNA的纯度。
若比值较高说明含有RNA，比值较低说明有残余蛋白质存在。
OD230/OD260的比值应在0.4-0.5之间，若比值较高说明有残余的盐存在.本实验室机器显示是OD260\OD230，则比值应在2-2.5之间，偏小则说明有残余盐剩余。
三、实验步骤1. 将制备的DNA悬浮溶解于TE缓冲液中[pH8.0, 10mmo1/L 的Tris缓冲液,内含〈1mmol/L EDTA〉]或悬浮溶解在灭菌水中(依据DNA含量加水)。
2. 用可扫描的紫外分光光度计测定制备的DNA/RNA的紫外吸收曲线，测定OD260和OD280，并计算比值：OD260/OD280，纯DNA的此比值约为1.8～2.0。
纯RNA的此比值约为大于2.0。
3. 根据：每毫升1微克的纯DNA的OD260值= 0.020，计算所得DNA的纯度；每毫升1微克的纯RNA的OD260值= 0.025，计算所得RNA的纯度；并讨论纯度较低的原因和解决办法。
260、320、230、280nm下的吸光度分别代表了核酸、背景（溶液浑浊度）、盐浓度和蛋白等有机物的值。
DNA的质量监测通常有两个方法
2）DNA的质量监测通常有两个方法：首先OD260/OD280比值应该在1.8左右（1.7-1.9），否则意味着DNA样品中存在大量的蛋白质或RNA污染。
其次，琼脂糖电泳分析时应主要以超螺旋条带为主。
最多不超过三条带（分别为超螺旋DNA，线性化DNA和环状DNA）。
否则意味质粒DNA的质量不高，应该重新制备。
2.限制性内切酶的活性1）限制性内切酶一般需要低温保存，而且反复的升降温过程对酶活性的损害很明显。
因而为了确保在有效期内的限制性内切酶不会失活，限制性内切酶的日常保存和使用应当很小。
2）建议购买具有保温功能的冻存盒保存限制性内切酶（-20度），而且取用限制性内切酶时，也应该使用具有保温功能的冻存盒，尽量防止酶的温度反复出现大的波动。
3.限制性内切酶的用量1）限制性内切酶的单位定义通常为：在合适的温度下，完全消化1ugDNA底物所需的酶量定义为一个单位。
2）在这个单位定义中，有几个不确定因素：首先是底物，不同的酶单位定义是选择的底物可能不同（常用的几个底物DNA包括：Lambda DNA ,AD2 DNA 和一些质粒DNA）；第二个不确定因素是限制性内切酶在底物DNA上的酶切位点的个数。
由于单位定义中要求完全消化，因而底物上某个酶的酶切位点的个数的多少，就直接影响了该酶的单位定义。
3）因而，在进行酶切时，用1ul酶（一般10IU/ul）消化1ugDNA的通常做法是很不科学的，这也导致在实际工作中，大家要进行多次预实验才能确定最合适酶切条件。
4）以前，我推荐了一个在线的双酶切设计软件，double digestion designer, 可以精确地计算酶切时的限制性内切酶的用量。
使用中，能够注意到，用来进行双酶切的两个酶的用量有时竟然相差近20倍（EcoRI + NheI)，而且发现，小片段PCR产物（100-500bp）进行酶切时，需要的酶量比质粒DNA酶切时用量多10倍以上。
5）该软件目前可以免费使用，用户名和密码都是test。
用OD值评判DNA和RNA质量
用OD值评判DNA和RNA质量1、根据OD值计算核酸浓度因为核酸分子里含有嘌呤和嘧啶，它们具有共轭双键，在波长260 nm处有最大吸收峰，所以核酸的最大吸收波长是260 nm。
蛋白质的最大吸收波长是280 nm。
在波长260 nm处测定的OD值记为OD260。
如果样本是纯净的，OD260值可以用于计算核酸样品的浓度。
1 OD260相当于50 μg/mL双链DNA，或者30 μg/mL（40 μg/mL）单链DNA（RNA），或者20 μg/mL寡核苷酸。
2、根据OD值评估核酸纯度在波长260 nm和280 nm 处测定的OD值的比值记为OD260/280。
它可以用于评估核酸样品的纯度。
纯DNA的OD260/280比值为1.8；纯RNA的OD260/280比值为2.0。
通常情况下，提取之后经过适当纯化、纯度较高的DNA样品，OD260/280在1.6-1.8之间，能够满足大多数分子生物学实验的要求；经过纯化、纯度较高的RNA样品，OD260/280在1.9-2.0之间，也能够满足大多数分子生物学实验的要求。
如果DNA样品的OD260/280比值高于1.8，表明该DNA样品中有RNA残留；低于1.6，表明有蛋白质和/或苯酚残留（也称为污染）。
如果RNA样品的OD260/280比值高于2.0，表明有异硫氰酸胍残留；低于1.9，表明有蛋白质和/或苯酚残留。
另外，OD230用于评估样品中是否存在碳水化合物、多肽、苯酚等污染物。
较纯净的核酸样品，OD260 /230比值大于2.0。
3、影响OD值的因素当一束光通过一种吸光物质（通常为溶液）时，溶质吸收了光能，光的强度减弱。
吸光度(absorbance，A)就是用来衡量光被吸收程度的物理量。
吸光度是指光线通过溶液(或某一物质)前的入射光强度与通过溶液（或某一物质）后的透射光强度的比值的对数。
吸光度也称为光密度(optical density，OD)，二者是同义词。
OD280 OD 260 OD230
OD260/280 OD260/230用来评估核酸的质量的
核酸的最大吸收波长为260nm，蛋白质为280nm，在波长260nm时，1OD值相当于双链DNA浓度为50μg/ml，单链寡核苷酸的含量为30μg/ml，可以据此
来计算核酸样品的浓度,还可通过测定在260nm和280nm的OD值的比值（OD260/OD280），估计核酸的纯度。
纯净DNA的比值为1.8，RNA为2.0。
若比值高于1.8说明DNA样品中的RNA 尚未除尽，若样品中含有酚和蛋白质将导致比值降低。
270nm存在高吸收表明有酚的干扰。
核酸所含嘌呤和嘧啶分子具有共轭双键，在260nm波长处有最大吸收峰。
蛋白在280nm波长处有最大吸收峰
OD230来评估样品中是否存在一些污染物，如碳水化合物，多肽，苯酚等，较纯净的核酸OD260 /OD 230 的比值大于 2.0。
230、260、280
核酸在波长260 nm处有最高吸收峰。
吸收紫外光的性质是嘌呤环和嘧啶环的共轭双键系统所具有的，所以嘌呤和嘧啶以及一切含有它们的物质，不论是核苷、核苷酸或核酸都有吸收紫外光的特性。
但紫外法不能区分DNA和RNA，只能用来鉴定核酸的纯度和含量。
蛋白质由于含有芳香氨基酸，因此也能吸收紫外光。
通常蛋白质的吸收高峰在280nm 波长处，在260nm处的吸收值公为核酸的十分之一或更低，故核酸样品中蛋白质含量较低时对核酸的紫外测定影响不大。
RNA的260nm与280nm吸收的比值在2.0以上；DNA的260nm与280nm吸收的比值则在1.9左右。
当样品中蛋白质含量较高时比值即下降。
核酸的定量DNA和RNA都有吸收紫外光的性质，它们的吸收高峰在260nm波长处，每种核酸的分子构成不一，因此其换算系数不同。
定量不同类型的核酸，事先要选择对应的系数。
如：1OD 的吸光值分别相当于50μg / ml 的dsDNA，37μg / ml 的ssDNA，40μg/ml的RNA，30μg/ml的寡核苷酸。
测试后的吸光值经过上述系数的换算，从而得出相应的样品浓度，这些由分光光度计内预设的程序执行，因此，测试前选择正确的程序，测试样品的类型，首先测试空白液，然后再测试样品，注意输入样品稀释倍数。
如何避免吸光值漂移读数不稳定可能是实验者最头痛的问题。
灵敏度越高的仪器，表现出的吸光值漂移越大。
事实上，分光光度计的设计原理和工作原理，允许吸光值在一定范围内变化，即仪器有一定的准确度和精确度。
核酸本身物化性质溶解核酸的缓冲液的pH 值、离子浓度等在测试时，离子浓度太高也会导致读数漂移，因此建议使用pH 值一定、离子浓度较低的缓冲液（如TE）可大大稳定读数。
核酸的吸光值受pH值和缓冲液离子浓度影响。
只有在一定的pH值和低离子浓度的条件下（如10 mM Tris-HCl pH 8.0），才能得到精确的检测结果。
水的pH值不稳定，可能导致检测误差。
提取DNA纯度
试剂盒特点:◆经过特殊处理的纯化柱能有效的去除杂质和腐殖酸。
◆兼容性强，适用于各种不同的粪便。
◆不需要使用有毒的苯酚等试剂，也不需要乙醇沉淀等步骤。
◆快速，简捷，单个样品操作一般可在60分钟内完成。
◆ 高纯度，OD260/OD280典型的比值达1.7～1.9，长度可达50kb以上，可直接用于PCR，1.DNA 提取中会污染任何物质蛋白糖类RNA等。
其纯度一般用核算吸收OD260/OD280（蛋白质污染）分析判断，纯DNA比值为1.8。
此外用OD280/OD230估计盐离子是不是太高。
5.分光光度分析DNA的A280/A260小于1.8；不纯，含有蛋白质等杂质。
在这种情况下，应加入SDS至终浓度为0.5%，并重复步骤2～8。
你取出1微升或2微升，用EB稀释100倍或50倍到100微升，OD260/280的比值在1.8-2.0是比较理想的，代表你的DNA纯度很高。
波长260nm时，1OD 值相当于双链DNA浓度为50μg/ml，算一下，再乘以你的稀释倍数，就是浓度了紫外吸收检测DNA浓度与纯度2007年11月13日星期二11:40目的：了解紫外吸收检测DNA浓度与纯度的原理，掌握测定方法。
原理：核酸的最大吸收波长为260nm，蛋白质为280nm，在波长260nm时，1OD值相当于双链DNA 浓度为50μg/ml，单链寡核苷酸的含量为30μg/ml，可以据此来计算核酸样品的浓度,还可通过测定在260nm和280nm的OD值的比值（OD260/OD280），估计核酸的纯度。
纯净DNA的比值为1.8, RNA为2.0。
若比值高于1.8说明DNA 样品中的RNA尚未除尽，若样品中含有酚和蛋白质将导致比值降低。
270nm存在高吸收表明有酚的干扰。
紫外分光光度法只能用于测定浓度大于0.25μg/ml 的核酸溶液，对浓度更小的样品，可采用荧光分光光度法。
试剂与仪器：提取的质粒DNA，紫外分光光度仪。
操作步骤：1) 分光光度计先用水在260nm和280nm两个波长下校零。
OD值
DNA纯度的判断根据OD260/OD280的比值判断，符合要求纯度高的纯化DNA其OD260/OD280在1.6-1.8之间，低于此范围表明蛋白质含量超标，高于此范围表明样品中含有RNA。
一.OD是optical density（光密度）的缩写，表示被检测物吸收掉的光密度，是检测方法里的专有名词，检测单位用OD值表示，OD=lg（1/trans），其中trans为检测物的透光值。
光通过被检测物，前后的能量差异即是被检测物吸收掉的能量，特定波长下，同一种被检测物的浓度与被吸收的能量成定量关系。
一般机器给出的比值是分子分母同时减OD320所得,你可以自己算一下OD260/OD280,如果在要求的范围内,说明你的OD320偏高,即可能有有机物污染,比如酒精未充分挥发我要纠正一下，纯DNA的A260/A280应大于1.8，纯的RNA应达到2.0，样品中如果含有蛋白质及苯酚，A260/A280比值会明显下降。
对于纯的样品，只要读出260nm的A值即可以算出含量。
通常以A值为1相当于50微克/ml双螺旋DNA，或者40微克/ml单链DNA（RNA），或者20微克/ml寡核苷酸计算。
OD260／OD280 1.9-2.0 RNA居多纯度已经很高了纯DNA：OD260/OD280≈1.8(＞1.9,表明有RNA污染；＜1.6，表明有蛋白质、酚等污染）纯RNA：1.7 ＜OD260/OD280＜2.0（＜1.7时表明有蛋白质或酚污染；＞2.0时表明可能有异硫氰酸残存）OD是optical density（光密度）的缩写，OD＝1og（1／trans），其中trans为检测物的透光值。
吸光度吸光度,absorbance,是指光线通过溶液或某一物质前的入射光强度与该光线通过溶液或物质后的透射光强度比值的对数，影响它的因素有溶剂、浓度、温度等等吸光系数与入射光的波长以及被光通过的物质有关。
只要光的波长被固定下来，同一种物质，吸光系数就不变。
DNA纯度的判断
DNA纯度的判断根据OD260/OD280的比值判断，符合要求纯度高的纯化DNA其OD260/OD280在1.6-1.8之间，低于此范围表明蛋白质含量超标，高于此范围表明样品中含有RNA。
一般机器给出的比值是分子分母同时减OD320所得,你可以自己算一下OD260/OD280,如果在要求的范围内,说明你的OD320偏高,即可能有有机物污染,比如酒精未充分挥发我要纠正一下，纯DNA的A260/A280应大于1.8，纯的RNA应达到2.0，样品中如果含有蛋白质及苯酚，A260/A280比值会明显下降。
对于纯的样品，只要读出260nm的A值即可以算出含量。
通常以A值为1相当于50微克/ml 双螺旋DNA，或者40微克/ml单链DNA（RNA），或者20微克/ml寡核苷酸计算。
OD260／OD280 1.9-2.0 RNA居多纯度已经很高了纯DNA：OD260/OD280≈1.8(＞1.9,表明有RNA污染；＜1.6，表明有蛋白质、酚等污染）纯RNA：1.7 ＜OD260/OD280＜2.0（＜1.7时表明有蛋白质或酚污染；＞2.0时表明可能有异硫氰酸残存）OD是optical density（光密度）的缩写，OD＝1og（1／trans），其中trans为检测物的透光值。
吸光度吸光度,absorbance,是指光线通过溶液或某一物质前的入射光强度与该光线通过溶液或物质后的透射光强度比值的对数，影响它的因素有溶剂、浓度、温度等等吸光系数与入射光的波长以及被光通过的物质有关。
只要光的波长被固定下来，同一种物质，吸光系数就不变。
当一束光通过一个吸光物质（通常为溶液）时，溶质吸收了光能，光的强度减弱。
吸光度就是用来衡量光被吸收程度的一个物理量。
吸光度用A表示，A＝abc，其中a为吸光系数，单位L/(g•cm),b为液层厚度（通常为比色皿的厚度），单位cm ，c为溶液浓度，单位g/L 影响吸光度的因数是b和c。
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OD260:OD280比值的应用
当你辛辛苦苦纯化出蛋白，准备下一步的实验时，如果后续实验的反应体系中涉及到DNA 或RNA或寡核苷酸，那么你就有必要在实验之前测定一下你的蛋白样品中是否有核酸污染。
那么，如何判断蛋白是否被核酸污染呢？用OD260:OD280比值！
Warburg和Christian（1942）提出OD260:OD280比值是蛋白制品被核酸所污染程度的很好指标。
当蛋白中掺入了核酸之后，OD260：OD280比值变化很明显，尤其是纯的蛋白制品中掺入了一点点核酸后，变化最明显。
例如：纯的蛋白样品，其OD260：OD280比值为0.57，而掺入5%的核酸之后，该比值上升到了1.06。
但是反过来却是不成立的，即：这个比值不能用来指示核酸被蛋白污染的程度。
因为核酸在260nm和280nm处的消光系数比蛋白质高很多，即使有明显的蛋白污染也不会大幅度改变核酸溶液的OD260：OD280比值。
例如，纯的核酸的OD260：OD280比值是2.0，当掺入了5%的蛋白质污染之后，OD260：OD280比值变成1.99，掺入20%的蛋白质污染后，也才变成1.96。
这就说明这个比值用来指示核酸被蛋白污染的程度是非常不灵敏的。
从下面这个表中就可以明显看出来。
蛋白质／％核酸／％ OD260:OD280
100 0 0.57
95 5 1.06
90 10 1.32
85 15 1.48
80 20 1.59
75 25 1.67
70 30 1.73
65 35 1.78
60 40 1.81
55 45 1.84
50 50 1.87
45 55 1.89
40 60 1.91
35 65 1.93
30 70 1.94
25 75 1.95
20 80 1.96
15 85 1.97
10 90 1.98
5 95 1.99
0 100 2————————————————————————————————————————————
A280(nm)紫外光吸收法测定蛋白浓度
原理：
蛋白质分子中常含有酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸等苯环结构，在紫外280nm波长处有最大
吸收峰，其光吸收值与蛋白质浓度成正比，故可以用280nm波长吸收值大小来测定蛋白质
含量。
优点：
1. 快速；
2. 对蛋白质无破坏性。
缺点：
1. 不是严格的定量方法。
因为此法是根据酪氨酸（Tyr）、苯丙氨酸（Phe）、色氨酸（Trp）残基的强吸收值来测定的，不同的蛋白质具有不同的消光系数。
另外，当蛋白质分子中不
含Tyr、Phe或Trp残基时，该方法就不能检出蛋白。
（此法用于测粗提总蛋白浓度较为适宜）
2. 核酸可引起强烈干扰。
灵敏度：
0.2 mg/ml ~ 2 mg/ml；比色杯最小测量体积为0.1 ml。
注意事项：
实验室通常认为用1cm的比色杯所测光吸收值为1.0时，蛋白浓度约为1mg/ml，这是非常
不精确的。
如果实验所用的缓冲液和水有较高的光吸收值，说明缓冲液中有干扰物质存在。
测量方法和计算公式：
对于不含核酸污染的蛋白溶液（如果样品光吸收值大于2.0，应将样品稀释至光吸收值小于2.0）：选择蛋白缓冲液作为空白对照，测定280 nm波长处的光吸收值，一般来说，1
A280 Unit ≈ 1mg/ml (对于浓度位于0.02 mg/ml ~ 3 mg/ml范围之内的蛋白样品而言如此，
对于浓度小于0.1 mg/ml的蛋白样品，可以采用以下的方法估算：蛋白浓度≈ A205/31）
对于存在核酸污染的蛋白溶液：选择蛋白缓冲液作为空白对照，测定280 nm和260 nm波
长处的光吸收值，或280 nm和205 nm波长处光吸收值，按照以下公式计算：
蛋白浓度（mg/ml）= [1.55 × A280] － [0.76 × A260]
蛋白浓度（mg/ml）= A205 ÷ (27 ＋A280/A205)
_______________________________________________________________________________ ___________
A260(nm)光吸收测DNA浓度
利用260nm光吸收测定DNA浓度计算公式:
1 A260 Unit of dsDNA = 50 μg/ml H2O
1 A260 Unit of ssDNA = 33 μg/ml H2O
注意：
A260的光吸收值应当落在0.1到1.0之间。
因此需根据不同情况按适当比例稀释。
A260/A280≥1.8代表DNA纯度可以；如果小于1.8，表示有蛋白污染；如果大于2.0则表示可能有RNA污染。
A260光吸收值不能体现DNA链的长短。
_______________________________________________________________________________ ____________
1 A260 unit of ds DNA =50ug/ml
1 A260 unit of ssDNA =33ug/ml
纯的DNA A260/A280>=1.8
如果小于1.8说明污染了蛋白或有机溶剂
DNA A260/A280>2说明有RNA污染，
OD对于DNA的长度无关
——罗氏手册
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紫外分光光度法只能用于测定浓度大于0.25μg/ml的核酸溶液，对浓度更小的样品，可采用荧光分光光度法。
试剂与仪器：
提取的质粒DNA，紫外分光光度仪。
操作步骤：
1) 分光光度计先用水在260nm和280nm两个波长下校零。
2) 取质粒DNA样品2μl，用水稀释100倍，转入分光光度计的石英比色杯中。
3) 在260nm和280nm分别读出样品光密度值。
如果样品浓度单位为μg/μl，则样品DNA浓度为OD 值的10倍，即如 OD<SUB>260</SUB>=0.1，则样品浓度即为1μg/μl。
4) 若OD<SUB>260</SUB>/OD<SUB>280</SUB>大于1.8，说明仍有RNA，可以考虑用RNA酶处理样品，若小于1.8，说明样品中含有蛋白质或酚，应再用酚/氯仿抽提，以乙醇沉淀纯化DNA。