外周血染色体标本制作课件

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二、实验原理
染色体是在显微镜下可见细胞有丝分裂过程 中出现的结构。因此，必须获得染色体标本才 能进行检查分析，通常情况下，都是利用外周 血淋巴细胞进行核型分析。正常情况下，人体 外周血淋巴细胞不再分裂，但植物血凝素 （PHA）可刺激血中的淋巴细胞转化成淋巴母 细胞，使其恢复增殖能力。
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1.纺锤体抑制剂
细胞分裂中纺锤体是由微管组成的。微管管壁 由13条原丝纵向平行排列构成，主要成分为微管蛋白， 而微管蛋白分α微管蛋白和β微管蛋白两种。α微管蛋 白和β微管蛋白组成的异二聚体构成微管亚单位，若 干个异二聚体相接连成原丝。α微管蛋白与β微管蛋白 在化学结构上极为相似，两者42%序列相同。其中β 微管蛋白肽链中第201位为半胱氨酸，为秋水仙素结 合部位。如果结合的部位被其结合，微管不仅不能继 续聚合，而且会引起原有微管解聚。
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秋水仙素的作用与其浓度和作用时间相关，在高 浓度时可以延缓着丝点分裂，低浓度时则抑制细胞纺 锤体的形成。 在秋水仙素作用下，染色单体缩短，着 色变深以致外形清晰。但不同染色体缩短的程度不一， 长的染色体比短的染色体浓缩得更明显些。
从能收集到足够的中期细胞考虑，秋水仙素处理 的时间宜长些，所用的浓度宜高些；但从能得到较为 细长的染色体考虑，处理的时间宜短，所用的浓度宜 低。因而秋水仙素处理的方法应同时兼顾这二个方面。 如果处理的时间太短则标本中的分裂细胞就少；与此 相反，如果处理的时间太长分裂细胞虽多，但染色体 缩得太短，以致形态模糊，就难以获得优良的显带标 本。
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1.纺锤体抑制剂
故秋水仙素具有干扰微管装配，破坏纺锤体形 成和终止细胞分裂的作用。以秋水仙素为代表的纺锤 体抑制剂能引起有丝分裂过程中纺锤丝断裂或抑制纺 锤体的形成，但不影响染色体的复制和着丝粒的分裂 使正在分裂的细胞停留在中期，以获得大量分裂相供 分析之用。秋水仙素积累分裂中期的作用，几乎对所 有植物器官和许多动物的器官都是十分有效的。
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从收获到制片需经过加纺锤体抑制剂、低渗处 理、固定、滴片等几个主要环节，现将各步骤的原 理、所用试剂及相关注意事项详述如下。
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1.纺锤体抑制剂
1.1基本原理和机制
• 使染色体散开并清楚地呈现次缢痕，凭借的原理是改 变细胞质的粘度。因为在细胞分裂时，随着纺锤体的 形成，染色体紧靠在一起，很难进行分析。纺锤体的 形成取决于细胞质和纺锤体成分的粘度之间的平衡。 因此，改变细胞质的粘度就能破坏纺锤体，使染色体 依然呈游离状态，或者更确切地说，染色体不再粘附 至细胞内的任何结合力上。所以在随后制作标本时一 旦受到压力，染色体就很易铺展开来。同时，由于染 色体的不同区段上水合作用的能力不一，当细胞质的 粘度发生变化时，就会使缢痕区显示得更为清楚。
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1.3处理过程
培养终止前在培养基中加入浓度为20μg/ml的秋 水仙素0.05~0.1ml（1ml注射器滴垂直3-5滴）使其最 终浓度为0.4~0.8μg/ml，置5%CO2、37ºC±0.5ºC培 养箱中处理2~4h。
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1.4注意事项
应当注意的是经秋水仙素处理后的细胞虽可用 各种不同的固定液(金属固定液或非金属固定液)予 以固定，但一定要在固定之前把秋水仙素从组织或 细胞上冲洗掉，否则沉积在细胞表面的秋水仙素不 仅会影响染色体的形态，而且还会阻碍固定液的穿 透性。为此，在低渗处理后，应尽早地加快速穿透 液，如甲醇-冰醋酸固定液。要不然在固定的时候， 细胞核仍可能进入代谢期。
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二、实验原理
因此，可采取少量外周静脉血，做短期培 养，培养至72小时细胞进入增殖旺盛期，此时 加入秋水仙素抑制细胞分裂，使细胞分裂停止 在中期以获得足够量的分裂期细胞，经低渗、 固定、制片、染色后镜下观察进行核型分析。 上述制备的染色体标本经胰蛋白酶消化、 Giemsa染色后，可在染色体纵轴上显示出着 色深、浅相间的横纹——带，表明每条染色体 的特征。
• 乙酰甲基秋水仙碱是人工合成的秋水仙素的衍生物。 它的功能跟秋水仙素一样但对细胞的毒害作用只有 秋水仙素的1/30一1/40。4-6×10-6的浓度即可得到 所希望的效应。
• 除了秋水仙素以外，另一些化学物也可作为纺锤体 抑制剂。如三氯乙醛水合物、六六六、硫酸长春花 碱等，它们在人体细胞均可产生良好效果。
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• 与其它预处理化学物相比较秋水仙素的另一个优点
是，在广泛的温度范围内都是有活性的。在热带地 区的夏季，那怕气温高达43.3℃，对秋水仙素的活 性也无显著影响，有人将秋水仙素加入保存在89℃的组织中，发现中期细胞的数目比保存在室温 但未加秋水仙素的组织要多得多，而且染色体的结
构也很清楚。
人类体细胞染色体标本制备与核型分析 Metaphase Chromosome Preparation and Analysis of Karyotype
学习交流PPTຫໍສະໝຸດ 1一、实验目的 1.熟悉人类外周血淋巴细胞的培养方法及染 色体标本的制备方法。 2.熟悉人类染色体G显带标本制备与分析。
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1.纺锤体抑制剂
1.2主要的纺锤体抑制剂及其作用特点
• 秋水仙素
• 秋水仙素（colchicine）是一种生物碱，因最初从百 合科植物秋水仙（Colchicum autumnale）中提取 出来，故名。分子式C22H25O6N。纯秋水仙素呈 黄色针状结晶，熔点157℃。易溶于水、乙醇和氯 仿，难溶于热水、乙醚等。味苦，有毒。秋水仙素 能抑制有丝分裂，破坏纺锤体，使染色体停滞在分 裂中期。这种由秋水仙素引起的不正常分裂，称为 秋水仙素有丝分裂（C-mitosis）。在这样的有丝分 裂中，染色体虽然纵裂，但细胞不分裂，不能形成 两个子细胞，因而使染色体加倍。
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2.低渗溶液
经过秋水仙素处理后，细胞内的染色体比较适 合于观察了，但还是不能满足要求。因为人类细胞 的染色体数目多，形状小，最大的染色体约7-8微米， 加之主要的观察与分析均在油镜下进行，这就要求 标本中的染色体彼此散开，并且尽可能处于同一平 面上。这些均有赖于低渗处理。