外周血淋巴细胞染色体制备与分析技术规范
人的外周血淋巴细胞培养及染色体制片方法、染色体组型分析
人的外周血淋巴细胞培养及染色体制片方法、染色体组型分析一、实验背景1、Carnoy固定液：固定液的重要特性是能迅速穿透细胞，将其固定并维持染色体结构的完整性，还要能够增强染色体的嗜碱性，达到优良染色效果。
单纯的固定液一般难以达到这些要求，因此在实验中使用两种混合的固定液。
由于Carnoy首先使用的甲醇和冰乙酸混合液而称其为卡诺氏固定液。
Carnoy固定液（甲醇∶冰乙酸=3∶1）每次使用前需临时配制，长时间放置影响固定效果，固定时间15min至24h，冰箱、室温均可。
必要时可改变甲醇和冰乙酸的比例，冰乙酸比例增加，利于细胞膨胀、染色体铺展，但易导致细胞破裂、染色体散失。
2、低渗液（hypotonic solution）低渗液是指渗透压和离子强度均低于正常细胞生理条件的溶液，渗透压低于组织液，与外周血混在一起时，水分迅速进入细胞，使其膨胀，甚至破裂，获得分散良好的染色体分裂象。
常见的低渗液：水、低渗的柠檬酸钠或氯化钠、甘油磷酸钾（0.65mol/L）、氯化钾（0.075mol/L）等。
低渗效果取决于低渗液的化学组成、低渗的温度和处理时间。
低渗处理是凭借反渗透作用使细胞膨胀染色体铺展，同时可使黏附于染色体的核仁物质散开，以便能在一个平面上观察所有染色体形态。
实验室中一般选用0.075mol/L KCl为低渗液，其优点有：①染色体轮廓清楚，可染色性强，染色时间短。
②用于显带染色时能充分显示带型特点。
低渗处理为37℃，25～30min，以预实验条件为准。
2、肝素N-硫酸和艾杜糖醛酸含量较多的一种糖胺聚糖，由D-β-葡糖醛酸(或L-α-艾杜糖醛酸)和N-乙酰氨基葡糖形成重复二糖单位组成的多糖。
肝素是一种抗凝剂，是由二种多糖交替连接而成的多聚体，在体内外都有抗凝血作用。
2、PHA植物血凝素(Phytohaemagglutinin)是一种有丝分裂原，主要用于激活免疫细胞—淋巴细胞。
是一种干扰素诱导剂，不仅可以刺激机体产生白介素-2和干扰素；还可以刺激机体产生非特异性抗体。
人体外周血淋巴细胞染色体制备与观察实验方案
人体外周血淋巴细胞染色体制备与观察实验方案清晨的阳光透过实验室的窗户，洒在桌子上，我拿起笔，准备写下这个实验方案。
人体外周血淋巴细胞染色体制备与观察，这是一个既熟悉又充满挑战的课题。
就让我以意识流的方式，带你走进这个神秘的实验世界。
一、实验目的1.了解人体外周血淋巴细胞染色体的基本结构。
2.学习并掌握染色体制备与观察的方法。
3.分析染色体形态，探讨其在遗传研究中的应用。
二、实验原理1.人体外周血淋巴细胞具有分裂能力，可进行有丝分裂。
2.通过特定染色方法，使染色体着色，便于观察。
3.利用显微镜技术，观察染色体形态和结构。
三、实验材料1.人体外周血：新鲜、无污染。
2.染色剂：吉姆萨染液、醋酸洋红染液。
3.试剂：肝素钠、氯化钠、磷酸缓冲液。
4.实验器材：显微镜、载玻片、盖玻片、离心机、移液器、吸管、计时器等。
四、实验步骤1.采集外周血：抽取2ml静脉血，加入含有肝素钠的抗凝管中，轻轻摇匀。
2.制备淋巴细胞悬液：将抗凝血置于离心管中，加入适量氯化钠溶液，1500r/min离心10分钟，弃上清，重复洗涤2次。
加入适量磷酸缓冲液，重悬细胞。
3.染色：取适量淋巴细胞悬液，滴加吉姆萨染液或醋酸洋红染液，染色5-10分钟。
4.制片：将染色后的细胞悬液滴在载玻片上，用盖玻片覆盖，轻轻压实。
5.观察染色体：将制片置于显微镜下，调节光线和倍数，观察染色体形态和结构。
6.记录结果：记录观察到的染色体形态、数量、排列等信息。
五、实验结果分析1.染色体形态：观察到的染色体呈棒状或X形，颜色鲜艳。
2.染色体数量：正常人体外周血淋巴细胞染色体数为46条。
3.染色体排列：有规律地排列成2个染色体组。
4.遗传研究应用：通过染色体分析，可研究遗传病、肿瘤等疾病的发生机制。
六、实验注意事项1.采集外周血时，要确保无污染。
2.制备淋巴细胞悬液时，要充分洗涤，去除红细胞和血浆。
3.染色过程中，要控制好染色时间，避免过染或欠染。
4.观察染色体时，要调节好显微镜光线和倍数，确保清晰。
人体外周血淋巴细胞培养及染色体标本制备实验报告
人体外周血淋巴细胞培养及染色体标本制备实验报告今天咱们来聊聊人体外周血淋巴细胞培养和染色体标本制备这个实验。
说实话，听到这些名词，可能不少人脑袋都开始发懵了，觉得这不就是一堆复杂的科学术语吗？别急，咱们慢慢捋，听我给你讲讲。
这可不是要你背什么枯燥的理论，而是要带你一起走进实验的世界，让你感受到那种“哦，原来是这么回事”的瞬间。
毕竟，科学嘛，有时候就像拆礼物，总有惊喜！实验的核心就是“外周血淋巴细胞培养”。
乍一听，你是不是就想，外周血、淋巴细胞，都是啥玩意儿？咱们先聊聊外周血吧，这其实就是咱们常常说的“血液”啦。
血液里有好多种细胞，其中淋巴细胞是一类非常重要的免疫细胞，它们在咱们身体里干着“保卫战”的活儿，专门用来对付入侵的细菌、病毒什么的。
简单来说，外周血淋巴细胞培养，就是从咱们的血液里把这些“小卫兵”挑出来，然后在实验室里“喂养”它们，让它们活得更好，变得更强大。
你可能好奇，咱们怎么从血液中把这些淋巴细胞分离出来呢？这个过程就像是“捞金子”。
先把血液给分离开，过滤掉那些不需要的部分，然后通过一些化学方法把淋巴细胞从里面提取出来。
想象一下，就像在沙滩上捡贝壳，虽然周围一片沙子，关键是得挑到最闪亮的那个！而这些淋巴细胞就像是你捡到的宝贝，咱们要把它们培养得越来越强，看看它们会变成什么样子。
咱们要讲到“染色体标本制备”了。
这一步可以说是实验的“高光时刻”，也是最让人兴奋的地方。
你想啊，细胞里的染色体其实就是所有遗传信息的“宝藏”，它们决定了咱们长得像谁、会不会秃头、是不是容易发胖，这些东西统统都藏在里面。
所以，看看这些染色体的“真面目”就成了实验的终极目标。
为了能看清楚它们，咱们要用一些特殊的染色技术，让染色体变得更“显眼”。
你可以想象，染色体就像一张复杂的地图，原本是密密麻麻、看不清楚的，但一旦染上颜色，它们就变得清晰可见，咱们才能一目了然地分辨出它们的结构和形态。
在这个过程中，首先咱们得让细胞分裂。
人的外周血淋巴细胞培养及染色体制片方法、染色体组型分析
人的外周血淋巴细胞培养及染色体制片方法、染色体组型分析人的外周血淋巴细胞培养及染色体制片方法、染色体组型分析一、实验背景1、Carnoy固定液：固定液的重要特性是能迅速穿透细胞，将其固定并维持染色体结构的完整性，还要能够增强染色体的嗜碱性，达到优良染色效果。
单纯的固定液一般难以达到这些要求，因此在实验中使用两种混合的固定液。
由于Carnoy首先使用的甲醇和冰乙酸混合液而称其为卡诺氏固定液。
Carnoy固定液（甲醇∶冰乙酸=3∶1）每次使用前需临时配制，长时间放置影响固定效果，固定时间15min至24h，冰箱、室温均可。
必要时可改变甲醇和冰乙酸的比例，冰乙酸比例增加，利于细胞膨胀、染色体铺展，但易导致细胞破裂、染色体散失。
2、低渗液（hypotonic solution）低渗液是指渗透压和离子强度均低于正常细胞生理条件的溶液，渗透压低于组织液，与外周血混在一起时，水分迅速进入细胞，使其膨胀，甚至破裂，获得分散良好的染色体分裂象。
常见的低渗液：水、低渗的柠檬酸钠或氯化钠、甘油磷酸钾（0.65mol/L）、氯化钾（0.075mol/L）等。
低渗效果取决于低渗液的化学组成、低渗的温度和处理时间。
低渗处理是凭借反渗透作用使细胞膨胀染色体铺展，同时可使黏附于染色体的核仁物质散开，以便能在一个平面上观察所有染色体形态。
实验室中一般选用0.075mol/L KCl为低渗液，其优点有：①染色体轮廓清楚，可染色性强，染色时间短。
②用于显带染色时能充分显示带型特点。
低渗处理为37℃，25～30min，以预实验条件为准。
2、肝素N-硫酸和艾杜糖醛酸含量较多的一种糖胺聚糖，由D-β-葡糖醛酸(或L-α-艾杜糖醛酸)和N-乙酰氨基葡糖形成重复二糖单位组成的多糖。
肝素是一种抗凝剂，是由二种多糖交替连接而成的多聚体，在体内外都有抗凝血作用。
2、PHA植物血凝素(Phytohaemagglutinin)是一种有丝分裂原，主要用于激活免疫细胞—淋巴细胞。
外周血淋巴细胞染色体制备与分析技术规范
外周血染色体制备与分析技术规范原理：在正常情况下，人外周血中是没有分裂相的，只有在异常情况下才能发现。
植物血球凝集素（PHA）是人类淋巴细胞有丝分裂的刺激剂，在PHA作用下，原处于Go期的淋巴细胞转化为淋巴母细胞，进而进行有丝分裂。
利用PHA这一特性，淋巴细胞经过含有HPA培养液培养，在体外便可获得丰富的含有丝分裂的生长活跃的细胞群体，终止分裂中期的淋巴细胞，例可得到所需的人体染色体图形。
具有用血量少、操作简单等优点。
1、实验材料2.5%碘酒、75%酒精、无菌棉签或棉球、镊子、吸管、培养瓶、培养液（PRMI 1640、M199）、小牛血清、秋水仙素、KCL、甲醇、冰醋酸、载玻片等。
2、培养液配制无菌条件下配制培养液，每瓶所含下列试剂：RPMI 1640或199 90%小牛血清 10%PHA（自制） 0.1ml 3%肝素 10u/ml 2%双抗 100u/ml（选择）分装于10ml培养瓶内，每瓶5ml培养液，封口置冷藏柜备用。
3、植物油凝素的制备植物血凝素也称为植物凝集素（PHA），可自制也可购自商品。
自制的方法常用生理盐水提取法。
（A）干品制备法（1）选广东鸡子豆10g，用蒸馏水冲洗，置培养皿内用75%酒精一次性浸洗，倒掉酒精留间隙置37℃。
恒温箱内24-48小时；（2）在无菌条件下研碎鸡子豆，加生理盐水30ml，摇匀后放入4℃冰箱24小时，第二天再加生理盐水70ml，再置4℃冰箱内24小时。
每8-12小时摇荡一次。
（也可一次性加100ml生理盐水）；（3）无菌条件下移入10-50ml离心管内，3000-4000rpm30分钟。
在无菌箱内把上清液分装于10ml小瓶，置冰箱冷冻层备用；（4）效价：外周血染色体制备每100ml培养基加PHA约2ml。
注：若整个过程未在无菌条件下进行，分装时用G5玻砂漏斗除菌即可。
（B）鲜品制备法：（1）选择完整无破皮鲜菜豆20g，用75%酒精浸泡10分钟；（2）在净化工作中用无菌盐水或蒸馏水漂洗二次，然后置无菌乳钵中捣成糊状，用100ml无菌盐水浸泡封口；（3）移入4℃冰箱中置24小时，中间摇动数次，次日3000rpm30分钟，在无菌情况下分装上清液于10ml小瓶内，置冰箱冷冻层备用。
外周血淋巴细胞培养与染色体制备
01
提交方式
根据实验室或研究机构的要求， 选择合适的提交方式，如纸质版 或电子版。
提交时间
02
03
交流与讨论
按照规定的时间节点提交实验报 告，确保数据的及时性和有效性。
与其他研究者或导师进行交流与 讨论，对实验结果进行深入探讨 和改进。
THANKS FOR WATCHING
感谢您的观看
04 外周血淋巴细胞培养注意 事项
细胞培养环境控制
温度
CO2浓度
维持恒定的温度是细胞生长的必要条 件，通常在37°C左右。
维持5%的CO2浓度，以维持培养基的 酸碱平衡。
湿度
保持培养箱内湿度在95%左右，以防 止细胞干燥。
细胞培养基质选择
01
选择适合淋巴细胞生长的培养基 ，如RPMI-1640或DMEM培养基 。
收获细胞
当细胞达到一定数量或生长状 态良好时，可以收获用于后续 实验或应用。
02 染色体制备
染色体分散
染色体分散是染色体制备的重要步骤，通过使用低渗溶液或机械力等方法使细胞膜 通透性增加，染色体从细胞中释放出来。
染色体分散的关键在于保持细胞的完整性和染色体的天然状态，以避免染色体畸变 或丢失。
常用的染色体分散方法包括低渗法、酶解法、机械法等，选择合适的方法取决于实 验目的和细胞类型。
02
根据需要添加适量的生长因子、 抗生素等添加剂，以促进细胞生 长和防止污染。
细胞培养过程监控
定期观察细胞生长情 况，记录细胞密度、 形态等指标。
定期进行微生物检测， 确保无污染发生。
定期检测培养基的 pH值和渗透压，确 保培养基的适宜条件。
05 染色体制备注意事项
染色体制备试剂选择
人体外周血淋巴细胞染色体制备与观察实验方案 (1)
人体外周血淋巴细胞培养及染色体组型分析实验方案2012级师范2班第3组组员：吴婵胡颖月央珍杨基伟杨青松宋海燕田金梅（组长）一、实验目的掌握人体外周血淋巴细胞培养与染色体组型分析的方法。
二、实验原理人的1ml外周血约含有1×10*6~3×10*6个小淋巴细胞，它们几乎都处于G0或G1期，一般情况下不分裂，但但采用人工离体培养的方法，经PHA（植物血球凝集素）刺激后，能转变成可分裂的淋巴母细胞进行有丝分裂。
所谓外周血培养即是将外周血接种在适当的培养物中加入适量的秋水仙素，使纺锤体微管解聚，这样细胞停留在中期，可以获得大量的分裂细胞。
用低渗盐溶液（一般是0.075mol/L的KCl）处理，使其中的红细胞及分裂相细胞膜和一部分细胞质除去然后用Carnoy固定液固定，最后以气干法制片，可获得较好的染色体标本。
核型（karyotype）指一个细胞中的整套染色体，按其大小、形态特征顺序排列所构成的图像。
通常是将显微摄影得到的染色体照片剪贴而成。
在完全正常的情况下，一个体细胞的核型一般可代表该个体的核型。
组型（idiogram)是以模式图的方式表示，它是通过许多细胞染色体的测量取其平均值绘制成的，是理想的，模式化的染色体组成，代表一物种染色体组型的特征。
将待测细胞的核型进行染色体数目、形态特性的分析，确定其是否与正常核型完全一致，称为核型分析（karyotype analysis）。
这对于探索人类遗传病的发病机理，探讨动物和植物的起源，以及物种间的亲缘关系等都具有重要意义。
染色体的特征以有丝分裂中期最为显著，所以一般都分析中期分裂相。
根据染色体着丝粒位置可将染色体分为中部着丝粒染色体（m）,亚中部着丝粒染色体（sm），亚端部着丝力粒染色体（st)，端部着丝力粒染色体（t）。
对于任何一个的基本形态特征来说，重要的参数有以下3个：（1）相对长度=单条染色体的长度/(单倍体常染色体+X或Y染色体)的总长度×100%（2）臂指数=长臂/短臂（反映着丝粒位置的指数）（3）着丝粒指数=短臂/整个染色体长度×100%（反映着丝粒位置的指数）人类体细胞的正常核型是含有23对染色体，共46条。
人体外周血淋巴细胞染色体制备与观察实验方案 (1)
人体外周血淋巴细胞培养及染色体组型分析实验方案2012级师范2班第3组组员：吴婵胡颖月央珍杨基伟杨青松宋海燕田金梅（组长）一、实验目的掌握人体外周血淋巴细胞培养与染色体组型分析的方法。
二、实验原理人的1ml外周血约含有1×10*6~3×10*6个小淋巴细胞，它们几乎都处于G0或G1期，一般情况下不分裂，但但采用人工离体培养的方法，经PHA（植物血球凝集素）刺激后，能转变成可分裂的淋巴母细胞进行有丝分裂。
所谓外周血培养即是将外周血接种在适当的培养物中加入适量的秋水仙素，使纺锤体微管解聚，这样细胞停留在中期，可以获得大量的分裂细胞。
用低渗盐溶液（一般是0.075mol/L的KCl）处理，使其中的红细胞及分裂相细胞膜和一部分细胞质除去然后用Carnoy固定液固定，最后以气干法制片，可获得较好的染色体标本。
核型（karyotype）指一个细胞中的整套染色体，按其大小、形态特征顺序排列所构成的图像。
通常是将显微摄影得到的染色体照片剪贴而成。
在完全正常的情况下，一个体细胞的核型一般可代表该个体的核型。
组型（idiogram)是以模式图的方式表示，它是通过许多细胞染色体的测量取其平均值绘制成的，是理想的，模式化的染色体组成，代表一物种染色体组型的特征。
将待测细胞的核型进行染色体数目、形态特性的分析，确定其是否与正常核型完全一致，称为核型分析（karyotype analysis）。
这对于探索人类遗传病的发病机理，探讨动物和植物的起源，以及物种间的亲缘关系等都具有重要意义。
染色体的特征以有丝分裂中期最为显著，所以一般都分析中期分裂相。
根据染色体着丝粒位置可将染色体分为中部着丝粒染色体（m）,亚中部着丝粒染色体（sm），亚端部着丝力粒染色体（st)，端部着丝力粒染色体（t）。
对于任何一个的基本形态特征来说，重要的参数有以下3个：（1）相对长度=单条染色体的长度/(单倍体常染色体+X或Y染色体)的总长度×100%（2）臂指数=长臂/短臂（反映着丝粒位置的指数）（3）着丝粒指数=短臂/整个染色体长度×100%（反映着丝粒位置的指数）人类体细胞的正常核型是含有23对染色体，共46条。
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外周血染色体制备与分析技术规范
原理：
在正常情况下，人外周血中是没有分裂相的，只有在异常情况下才能发现。
植物血球凝集素（PHA）是人类淋巴细胞有丝分裂的刺激剂，在PHA作用下，原处于Go期的淋巴细胞转化为淋巴母细胞，进而进行有丝分裂。
利用PHA这一特性，淋巴细胞经过含有HPA培养液培养，在体外便可获得丰富的含有丝分裂的生长活跃的细胞群体，终止分裂中期的淋巴细胞，例可得到所需的人体染色体图形。
具有用血量少、操作简单等优点。
1、实验材料
2.5%碘酒、75%酒精、无菌棉签或棉球、镊子、吸管、培养瓶、培养液（PRMI 1640、M199）、小牛血清、秋水仙素、KCL、甲醇、冰醋酸、载玻片等。
2、培养液配制
无菌条件下配制培养液，每瓶所含下列试剂：
RPMI 1640或199 90%
小牛血清 10%
PHA（自制） 0.1ml 3%
肝素 10u/ml 2%
双抗 100u/ml（选择）
分装于10ml培养瓶内，每瓶5ml培养液，封口置冷藏柜备用。
3、植物油凝素的制备
植物血凝素也称为植物凝集素（PHA），可自制也可购自商品。
自制的方法常用生理盐水提取法。
（A）干品制备法
（1）选广东鸡子豆10g，用蒸馏水冲洗，置培养皿内用75%酒精一次性浸洗，倒掉酒精留间隙置37℃。
恒温箱内24-48小时；
（2）在无菌条件下研碎鸡子豆，加生理盐水30ml，摇匀后放入4℃冰箱24小时，第二天再加生理盐水70ml，再置4℃冰箱内24小时。
每8-12小时摇荡一次。
（也可一次性加100ml生理盐水）；
（3）无菌条件下移入10-50ml离心管内，3000-4000rpm30分钟。
在无菌箱内把上清液分装于10ml小瓶，置冰箱冷冻层备用；
（4）效价：外周血染色体制备每100ml培养基加PHA约2ml。
注：若整个过程未在无菌条件下进行，分装时用G5玻砂漏斗除菌即可。
（B）鲜品制备法：
（1）选择完整无破皮鲜菜豆20g，用75%酒精浸泡10分钟；
（2）在净化工作中用无菌盐水或蒸馏水漂洗二次，然后置无菌乳钵中捣成糊状，用100ml无菌盐水浸泡封口；
（3）移入4℃冰箱中置24小时，中间摇动数次，次日3000rpm30
分钟，在无菌情况下分装上清液于10ml小瓶内，置冰箱冷冻层备用。
（4）效价：正式使用前先用一定量作效价测定，按效价使用。
检查人染色体的数目、结构是否正常。
4、标本要求
（1）标本类型：全血。
（2）标本要求：新鲜，无脂血，无溶血。
（3）标本拒收状态：细菌污染，严重溶血或脂血标本不能作测定。
5、操作过程
（1）采样接种：用2.5%碘酒、75%酒精消毒瓶盖，用酒精灯火焰过烤，无菌条件下抽取患者外周血0.5-1ml，每瓶加20滴左右，轻摇均匀，尽量避免培养物与瓶盖接触；
（2）培养：置36℃培养箱中培养72小时，每隔12小时左右轻遥1次，以促进细胞生长增殖；
（3）抑止分裂：收获前2小时左右加秋水仙素，最终浓度为0.02ug/ml培养液，摇匀后置培养箱中继续培养，以抑止细胞在分裂中期。
（4）终止培养：从培养箱中取出培养瓶，摇匀后移至10ml尖底离心管中，尽量收集培养细胞。
2000rpm8分钟。
（5）低渗处理：弃上清液，加入预温37℃的0.075MKCL8ml，迅速打匀，置37℃培养箱或水浴锅中10-20分钟；（
6）预固定：取出低渗中尖底离心管，轻轻加入新配制的1-2ml 3∶2甲醇：冰乙酸混合液，取相应编号滴管用汽泡轻轻软打2-3下。
800-1000rpm8-10分钟；
（7）固定：弃上清液。
加入新鲜配制的3∶2甲醇冰乙酸混合液10ml，轻打混匀，封口置室温30分钟以上。
1500-2000rpm10分钟，反复2-3次；
（8）制片：使用蒸馏水制备冰水片进行滴片。
留离心后沉淀细胞，加新鲜配制的固定液，制成细胞悬液，取1-2滴滴片，用于轻轻吹开。
刻号后清理刻号污物，置80℃烤片2小时；
（9）收片：待烤箱自然冷却后，取出烤片，置干净环境中或培养箱中以备进行显带处理。